Mtodos de Separacin

MTODOS DE SEPARACIN
Los mtodos de Separacin se basan en diferencias entre las propiedades fsicas
de los componentes de una mezcla, tales como:
PUNTO DE EBULLICIN
DENSIDAD
PRESIN DE VAPOR
PUNTO DE FUSIN
SOLUBILIDAD

Los mtodos ms conocidos son:

FILTRACIN:
Consiste en retener partculas slidas por medio de una barrera, la cual puede
consistir de mallas, fibras, material poroso o un relleno slido. DECANTACIN
Consiste en separar componentes que contienen diferentes fases (por ejemplo, 2
lquidos que no se mezclan, slido y lquido, etc.) siempre y cuando exista una
diferencia
significativa
entre
las
densidades
de
las
fases.
La Separacin se efecta vertiendo la fase superior (menos densa) o la inferior (ms
densa).

Los mtodos ms conocidos son:

EVAPORACIN:
El procedimiento de Evaporacin consiste en separar los componentes mas
voltiles exponiendo una gran superficie de la mezcla. El aplicar calor y una
corriente de aire seco acelera el proceso.

CRISTALIZACIN:
Para efectuar la cristalizacin de un Slido hay que partir de una Solucin
Sobre-Saturada, para el proceso de cristalizacin hay varios caminos:
Enfriamiento de la solucin,
Eliminar parte del Disolvente (Por ejemplo: por evaporacin) a fin de aumentar la
concentracin del soluto,
Aadir un tercer componente que tenga una mayor solubilidad que el componente que se
desea cristalizar.

La rapidez del Enfriamiento definir el tamao de los cristales resultantes.

Un enfriamiento rpido producir cristales pequeos,
un enfriamiento lento producir cristales grandes.
Para acelerar la Cristalizacin puede hacerse una "siembra" raspando las paredes del
recipiente.

SUBLIMACIN
La Sublimacin aprovecha la propiedad de algunos compuestos de cambiar del
estado slido al estado vapor sin pasar por el estado lquido. Por ejemplo, el I2 y el
CO2 (hielo seco) poseen esta propiedad a presin atmosfrica.

DESTILACIN
Este mtodo consiste en separar los componentes de las mezclas basndose en las
diferencias en los puntos de ebullicin de dichos componentes.
Los compuestos con una presin de vapor baja tendrn puntos de ebullicin altos
y los que tengan una presin de vapor alta tendrn puntos de ebullicin bajos.
Los tipos de Destilacin ms comunes son:
Destilacin Simple
Destilacin Fraccionada
Destilacin por Arrastre de vapor

Destilacin sencilla
Se usa para separar de lquidos con
puntos de ebullicin inferiores a
150C de impurezas no voltiles, o
bien para separar mezclas de dos
componentes que hiervan con una
diferencia de puntos de ebullicin de
al menos 60-80C.
El lquido que se quiere destilar se
pone en el matraz (que no debe
llenarse mucho ms de la mitad de
su capacidad) y se calienta con la
placa calefactora. Cuando se alcanza
la temperatura de ebullicin del
lquido comienza la produccin
apreciable de vapor, condensndose
parte del mismo en el termmetro y
en las paredes del matraz. La mayor
parte del vapor pasa al refrigerante
donde se condensa debido a la
corriente de agua fra que asciende
por la camisa de este. El destilado
(vapor condensado) escurre al
matraz colector a travs de la
alargadera.

Destilacin fraccionada
Es una tcnica que permite la
realizacin de una serie de
destilaciones sencillas en una
sola operacin continua. Se usa
para
separar
componentes
lquidos que difieren menos de
25C en el punto de ebullicin.
Es un montaje similar a la
destilacin simple en el que se
ha intercalado entre el matraz y
la cabeza de destilacin una
columna que puede rellenarse
con cualquier tipo de sustancia
inerte que posea gran superficie,
por ejemplo anillos o hlices de
vidrio, alambre, trozos de arcilla,
fragmentos de porcelana, etc.

Destilacin por Arrastre: se hace pasar una corriente de vapor a travs de la

mezcla de reaccin y los componentes que son solubles en el vapor son
separados.

EXTRACCIN:
Cuando los solutos se distribuyen libremente entre dos solventes inmiscibles se
establece una diferencia entre las relaciones de concentracin en el equilibrio.

 La Distribucin de un soluto entre dos solventes inmiscibles est gobernada por la

"Ley de Distribucin".
Supngase que la especie del soluto A se deja distribuir entre una fase acuosa y otra
orgnica.
La relacin de concentraciones de A entre las fases acuosa y orgnica ser constante
e independiente de la cantidad total de A.
K = [Ao]/[Aw]
Donde:
K es el coeficiente de Reparto
[Ao]= concentracin de A en la fase orgnica
[Aw]= concentracin de A en la fase acuosa

CROMATOGRAFA
La cromatografa: engloba a un conjunto de tcnicas basadas en la separacin de
los componentes de una mezcla y su posterior deteccin, tcnica constituda por
una fase mvil y una fase estacionaria
La fase mvil consiste en un fluido (gas, lquido por ejemplo) que arrastra a la
muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido
fijado en un slido.

FASE ESTACIONARIA
CROMATOGRFICO

FASE MVIL

LECHO

ELUYENTE

Elementos intervinientes en una cromatografa

Fase Estacionaria
Fase Mvil
Muestra
Como interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la
mezcla de molculas que se desea separar (muestra)
interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina
fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es
inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta
para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra.

Muestra:
tres componentes
mezclados

Fase
estacionaria

Se dispone una mezcla

sobre una fase estacionaria

Se hace fluir una fase

mvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidad
relativa por ambas fases, los
componentes de la mezcla
primitiva se separan

Fase mvil

Consideraciones tericas y parmetros cromatogrficos

La cromatografa es un sistema de separacin dinmica:
-Continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a
separar con las fases mvil y estacionaria.
-La fase estacionaria consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con
una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo
superficial:
a) Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa
b) En ocasiones es necesario un tratamiento qumico de la fase estacionaria para
conseguir unas partculas de tamao y poro adecuados.

La fase mvil puede ser un lquido o un gas:

-Su funcin es transportar a los componentes de la mezcla a travs del
sistema cromatogrfico.
En el proceso de separacin se produce una competencia entre la fase
mvil y la fase estacionaria por el componente.
A este proceso se le denomina particin del componente distribuido entre
las dos fases.

Se establece un equilibrio entre la concentracin del componente presente

en la fase mvil y la concentracin presente en la fase estacionaria.
El coeficiente de distribucin de un componente A se define como:

Donde
-DA es el coeficiente de distribucin del componente A,
- [Aest.] = concentracin del componente A en la fase estacionaria
-[Amv.] = concentracin del componente A en la fase en la fase mvil.
-El valor del coeficiente de distribucin es caracterstico de un componente
para una fase estacionaria y una fase mvil determinadas.

Fundamento de la cromatografa

-Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase

estacionaria y con la fase mvil.
-De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas
velocidades y se van separando.
-La separacin entre dos sustancias empieza cuando una es retenida ms
fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms
rpidamente en la fase mvil.

-Las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenmenos de

interaccin que se dan entre las dos fases y que pueden ser :

La adsorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de los

puntos activos de la superficie de un slido quedando delimitado el
fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.
La absorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de una
masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la
primera, absorcin pura, o a reaccionar qumicamente con la misma,
absorcin con reaccin qumica, considerando ambas como un fenmeno
msico y no superficial.

 Despus de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y

haberse separado pasan por un detector que genera una seal que puede
depender de la concentracin y del tipo de compuesto.
Los mtodos cromatogrficos actuales ms modernos monitorean la salida
de los componentes y eluyentes, esto se consigue conectando a la salida del
sistema cromatogrfico unos aparatos electrnicos, denominados
detectores, que detectan pequeas cantidades de componentes.
Si se representan los valores de la concentracin de esos componentes
frente al tiempo o al volumen de eluyente se obtiene unas curvas
Gaussianas denominadas cromatogramas.

Las distintas tcnicas cromatogrficas se pueden dividir segn cmo

est dispuesta la fase estacionaria:
Tipos

Fase mvil

Fase estacionaria

Cromatografa en papel

Lquido

Slido

Cromatografa en capa fina

Lquido

Slido

Cromatografa de gases

Gas

Slido o lquido

Cromatografa lquida
en fase inversa

Lquido (polar)

Slido o lquido
(menos polar)

Cromatografa lquida
en fase normal

Lquido
(menos polar)

Slido o lquido
(polar)

Cromatografa lquida
de intercambio inico

Lquido (polar)

Slido

Cromatografa lquida
de exclusin

Lquido

Slido

Cromatografa lquida
de adsorcin

Lquido

Slido

Cromatografa de
fluidos supercrticos

Lquido

Slido

Anlisis Cromatogrfico
La cromatografa permite no slo separar componentes de una muestra, si
no tambin su identificacin y cuantificacin
Anlisis Cualitativo Basado en la medida de
cromatogrficos como tiempos y volmenes de retencin

parmetros

Anlisis Cuantitativo basado en las medida de alturas u reas de picos

cromatogrficos que se relacionan con la concentracin

Anlisis cualitativo cromatogrfico

Los parmetros cromatogrficos que se utilizan en el anlisis cualitativo
son dos: tiempo de retencin(tR) y volumen de retencin (vR)

Procedimiento: ambos parmetros han de ser comparados con los de una

sustancia patrn
Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parmetros
sean reproducibles, ni an manteniendo condiciones de trabajo constantes.
Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.

Cromatografa plana.
La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las
principales tcnicas son:
Cromatografa en Papel y Capa Fina (TLC)

Cromatografa en papel
Tcnica de mediana resolucin en el cual una mezcla de solutos
sembrada sobre papel de filtro logra separarse entre si basndose en:
Los diferentes coeficientes de particin de los solutos entre la fase acuosa
estacionaria dbilmente unido a las fibras de celulosa del papel y a la fase
lquida orgnica mvil corriendo a travs de la hoja por accin capilar
Diferencias en la adsorcin del soluto a las fibras de celulosa y disolucin
en la fase mvil.

CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA

F. ESTACIONARIA
(polar)

CMARA
CROMATOGRFICA

FLUJO
propiciado por
CAPILARIDAD

MUESTRA

Superficie plana = soporte

FASE MVIL
(apolar)

FRENTE de avance del solvente

hidrofbica

hidroflica

distancia avanzada por la molcula

Rf=
distancia avanzada por el frente

Rf es caracterstico para cada sustancia para una

composicin dada de fase mvil y un
determinado tipo de superficie

CROMATOGRAFA EN PAPEL
PROPIEDAD: Solubilidad
SOPORTE celulosa de papel de filtro
F. ESTACIONARIA (LQUIDA) H2O absorbida en la celulosa.
F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

H2 O
H2 O
H2 O
H2 O

H2 O
HHH-

H2 O
H2 O
H2 O

H2 O
H2 O

Molec. Hidroflica LENTA

(soluble)
Retenida por f. estacionaria

H2 O

Molec. Hidrofbica RPIDA

(insoluble)
Disuelta en fase mvil

RESULTADO

Cromatografa en capa fina

- En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria

manteniendo un pequeo espesor constante a lo largo de la placa.

- El eluyente ascender, por capilaridad, por la placa y arrastrar los

componentes a lo largo de sta produciendo manchas de los
componentes.

- Se usan lminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plstico (ej:
acetato) metlicos (ej: aluminio). Los tamaos de la placa para CCf
convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2.

- Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar

la identificacin de las muestras. Si no se usa indicador y los
componentes no son coloridos se requerirn tcnicas de revelado.

Fase estacionaria
(Adsorcin)

gel de slica,
almina,
cido silsico
otros

Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria

se aglutina con una pequea cantidad de sulfato de calcio u otro agente
cementante.
Las muestras se aplican aadiendo pequeas gotas de solucin en un
pequeo circulo cerca del extremo inferior de la placa

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)

PROPIEDAD: Hidrofobicidad
SOPORTE plancha de metal o vidrio
F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre
plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica.
F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico

-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH

HHH-

Molec. Hidroflica LENTA

Retenida por f. estacionaria

-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH
-Si-OH

Molec. Hidrofbica RPIDA

Disuelta en fase mvil

Fase Mvil
Polaridad
Alta

Baja

COOH cidos carboxlicos

Alcoholes
OH
Aminas
NH2
Tioles
SH
Aldehdos
CHO
Cetonas
CO
COOR Esteres
OCH3 teres
Hidrocarburos No Saturados
Hidrocarburos Saturados

El ndice de retencin Rf (Ratio of Front)

Rf es el registro y se define como:

Rf = distancia que recorre la muestra desde

el punto de aplicacin / distancia que
recorre el disolvente hasta el frente del
eluyente
El valor de Rf depende de las condiciones
en las cuales se corre la muestra (tipo
de adsorbente, eluyente, as como las
condiciones de la placa, temperatura,
vapor de saturacin, etc.). Tiene una
reproducibilidad de 20%, por lo que
es mejor correr duplicados de la misma
placa.
Una propiedad que permite identificar
sustancias en una mezcla

SECUENCIA DE PASOS

Cargado de la placa

Siembra

Inicio de la corrida

Eluyentes ms comunes para cromatografa en capa fina.

ter de petrleo
-tolueno
-dietil-ter, t-butil-ter
-diclorometano
-acetato de etilo
-n-pentano, n-hexano
-ciclohexano
-tetracloruro de carbono
-ter dietlico
-cloroformo
-acetona
-iso-propanol
-etanol
-metanol
-cido actico

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar
la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos
polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.

Reveladores ms comunes para cromatografa en capa fina

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las

incoloras pueden revelarse mediante:
Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una
fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254
F366), el nmero que aparece como subndice nos indica la longitud
de onda de excitacin del indicador utilizado.
La introduccin de la placa en vapores de yodo.
El roco con una solucin de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un
compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de
extraccin de gases).

Despus calentar

Adsorbentes ms comunes para cromatografa en capa fina.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

b) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas

Para la seleccin del adsorbentes deber tomar las siguientes

consideraciones:
Polaridad
Tamao de partcula
Dimetro
rea Superficial
Homogeneidad

Factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa

fina.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms

en la fase estacionaria.
b) La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de
aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con
grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a
pequea escala, stas deben limpiarse corriendo primero una
mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.

Ventajas de la cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a
otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase
gaseosa), ya que:

El material que precisa es ms simple.

El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es
mucho menor y la separacin es generalmente mejor.
El mtodo es simple y los resultados son fcilmente
reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para
fines analticos en la industria.

Cromatografa en columna

Todo el proceso de separacin acontece en la columna

El proceso de cromatografa en columna se controla por cromatografa
en capa fina, de tal manera que se puede separar cada componente de la
mezcla.
La cromatografa en columna se usa para separar grandes cantidades
de material: >100 mg. El proceso de cromatografa consta de una fase
mvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales
dependen de las sustancias.
Es una tcnica que se emplea en el fraccionamiento de protenas

Trminos comunes en cromatografa de columna

matriz de la columna: Sustancia que est empapada de solvente y que se
empaqueta en la columna. Tambin se denomina el lecho de la columna.
longitud de la columna: Longitud del dispositivo en el que se empaqueta
la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografa como la de
filtracin en gel y poco importante en otras como la cromatografa de
afinidad.

volumen de la columna: Volumen total de gel que se empaqueta en una

columna cromatogrfica.
volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que
atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado
completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la
columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera
protena. En general, y dependiendo del tipo de cromatografa puede ser de
1 a varias veces el volumen de la columna.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
EMPAQUETADO
COLUMNA

APLICACIN
MUESTRA

ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

RESERVORIO
f. mvil

LECHO
CROMATOGRFICO
f. estacionaria
COLUMNA

MUESTRA

FLUJO
gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN O FRACCIONAMIENTO

CROMATOGRAFA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIN

FRACCIONES
ANLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES
1

Pero normalmente las

fracciones no presentan
diferente coloracin

Molc. distribuida
en f.estacionaria

respuesta del detector

Molc. distribuida
en f.mvil

Espectrofotomtrico
Abs 280nm Protenas
Otras Abs - Colorantes

fraccin

Cromatografa de filtracin en gel

Tipos de
cromatografa
en columna

Cromatografa de intercambio
inico

Cromatografa de afinidad y
de inmunoafinidad

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

Esta cromatografa se realiza empleando unas matrices formadas por unas
esferas porosas.
-El volumen de los poros es muy elevado y su dimetro est determinado.

-En esta cromatografa se eluyen primero las protenas mayores, y en

segundo lugar las menores.
- Columnas largas y de mayor volumen aseguran separaciones de mayor
calidad.

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

PROPIEDAD: Tamao (y forma)

SOPORTE Resina de micropartculas esfricas porosas formadas

por polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla
de ellos). Dimetro de poro determinado.

FASE MVIL

Tamaos de poro intervalo o rango de fraccionamiento.

P.e.

Sephadex G25:
Sephadex G200:

1000 5000 Da
5000 250000 Da
F. ESTACIONARIA

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo

que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas.

F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la

columna por los espacios intersticiales (entre las micropartculas).

MICROPARTCULAS

CROMATOGRAFA DE GEL FILTRACIN

Molec. GRANDES RPIDAS
* Avanzan a mayor velocidad a travs de los
espacios intersticiales entre las bolas (con f. mvil)
son eluidas antes
Molec. PEQUEAS LENTAS
* Penetran en los pequeos conductos de las bolas de
gel y avanzan a menor velocidad (con f. estacionaria)
son eluidas despus
PERFIL DE ELUCIN
APLICACIN
MUESTRA

grande

ELUCIN

respuesta del detector

pequea

8
9
fraccin

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

USOS
Se utiliza cuando se quiere. separar una mezcla cuyos componentes
son especies qumicas que, a un pH adecuado, se disocian en iones
Permite separar y purificar determinados analitos que, con
posterioridad, se cuantifican por absorcin molecular,etc..

En el interior de la columna se sita la fase estacionaria, que es un gel

intercambiador de iones, el cual debe de acondicionarse previamente al
paso de la fase mvil, que contiene la muestra.
Tras el paso de dicha muestra, se eluyen los componentes no unidos a la
fase estacionaria, y posteriormente se eluyen los componentes unidos
(separndose en fracciones, si fuera el caso) que se cuantificaran por
otros mtodos ya mencionados.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

PROPIEDAD: Interacciones electrostticas (carga elctrica)

SOPORTE Resina de micropartculas formadas por polmeros

sintticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa).
F. ESTACIONARIA (SLIDA) Grupos con cargas inicas
unidos al soporte.
Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-):
cromatografa aninica
Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+):
cromatografa catinica
F. MOVIL (LQUIDA) Solvente que anula la interaccin
electrosttica.

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga

de las molculas de la muestra.
Gradientes inicos (salinos) competencia
por grupos electrfilos.

FASE MVIL

F. ESTACIONARIA

MICROPARTCULAS

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Gradiente de pH
Gradiente salino

Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS

* Son desplazadas ms fcilmente por la f.mvil.
Las molc. (-) son rechazadas por la f. estacionaria
y eluidas directamente.
Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS
* Son retenidas por los grupos cargados inicamente
de la f. estacionaria.
PERFIL DE ELUCIN

q+
Q+

ELUCIN
* Cromatografa
catinica

respuesta del detector

APLICACIN
MUESTRA

Na+
1

8
9
fraccin

Elucin con solvente de baja molaridad

(baja fuerza inica)

Aumentar la
molaridad del solvente

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido
en la que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores,
inhibidores enzimticos y otras molculas) denominadas ligandos de
afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados,
retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de
manera reversible y selectiva.

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
PROPIEDAD: Interacciones especficas entre dos molculas
P.e.
hormona-receptor
protena-metal o cofactores como ATP
antgeno-anticuerpo
SOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga, con
rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica).

FASE MVIL

F. ESTACIONARIA (SLIDA) Ligandos (grupos qumicos)

especficos (con afinidad por alguna de las molculas a aislar)
unidos a la matriz.
Concavalina A une glicoprotenas
Protena A une IgG (anticuerpos)
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
-- Comerciales:

F. ESTACIONARIA
MICROPARTCULAS

F. MVIL (LQUIDA) Solucin que anula o disminuye la afinidad

con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre

-- Solucin con algo que interacciona con el ligando Molcula

CROMATOGRAFA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIN RPIDAS
* No se unen al ligando de la fase estacionaria
eluyen directamente.
Molec. INTERACCIN LENTAS
* Se unen al ligando de la f. estacionaria.
Elucin especfica.
PERFIL DE ELUCIN
ELUCIN
ESPECFICA

LAVADO
respuesta del detector

molcula

APLICACIN
MUESTRA
LAVADO
ELUCIN
ESPECFICA

8
9
fraccin

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Sistema GST (Glutatin-S-Transferasa)
Purificacin de PROTENAS RECOMBINANTES
Cualquier protena marcada con etiqueta GST

GST
Protena X
Glut
ELUCIN

Glut GST

Glut

APLICACIN
MUESTRA

Glut

Glut GST

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Aplicacin bsica PURIFICACIN DE PROTENAS.
Normalmente se combinan diferentes tcnicas para optimizar el
proceso (de menos a ms especficas).