Cuando el pH es bajo, los grupos

ionizables estn protonados, y la carga

neta de la protena es de signo positivo.


Cuando el pH es alto, los grupos
ionizables estn desprotonados, y la
carga neta es de signo negativo.






Patrn electroforesis normal
Electroforesis de Protenas
Es el movimiento de partculas o molculas que se separan de
acuerdo a su carga neta en presencia de un campo elctrico. Las
protenas estn compuestas por aminocidos, que le dan la carga
neta de estas dependiendo del medio en que se encuentran. La
electroforesis es un mtodo no inmunolgico.
Campo Elctrico
Voltaje Aplicado

Partcula cargada




pH y Fuerza Inica(FI) del buffer
ph es responsable carga neta elctrica partcula
FI Baja- Mayor VM y Baja Temp.
FI Alta- Mayor Definicin de bandas y Alta Temp.
Calor generado (Temperatura)
Soporte y muestra
+ H+ + - OH -
NH3 RCOOH NH3RCOO NH2 RCOO + H2O
Enlace peptdico
Caractersticas tcnicas ELP
Soporte
Acetato de Celulosa, Gel de Agarosa, Papel, etc.
Voltaje
180 volts
Buffer
Barbital-Barbital Na (pH 8.8),Tris(hidroximetil)
amino metano, Veronal Sdico.
Colorante
Rojo Ponceau, Azul de Coomasie
Muestra
Suero , Orina Concentrada, LCR
Lectura
Densitometros, Escner
Tcnica ( soporte Acetato de Celulosa)
Preparacin cmara, soporte. aplicador
Preparacin de la placa
Aplicacin de la muestra
Electroforesis 20 min./180 volts
Tincin de Bandas con Rojo Ponceau
Decoloracin placa con cido actico
Deshidratacin de placa con metanol
Aclaramiento de placa con Clear aid (polyethylene
glycol)
Secado de placa (10 min./50 C)
Leer placa con filtro de 525 nm.
Tcnica de electroforesis de protenas


Placa de electroforesis de protenas en
sangre


Caractersticas tcnicas ELP
Soporte
Acetato de Celulosa, Gel de Agarosa, Papel, etc.
Voltaje
180 volts
Buffer
Barbital-Barbital Na (pH 8.8),Tris(hidroximetil)
amino metano, Veronal Sdico.
Colorante
Rojo Ponceau, Azul de Coomasie
Muestra
Suero , Orina Concentrada, LCR
Lectura
Densitometros, Escner


Gammapata policlonal

Gammapata monoclonal
Blood
&
Bone
marrow
Bone
marrow
Periphery
Plasma cell
Germinal centre B
cell
Hodgkins lymphoma
IgM-secreting B cell
Waldenstrms
macroglobulinaemia
Resting naive B cell Mantle cell lymphoma
Pre-B cell Pre-B cell leukaemia
Lymphoid progenitor
Acute lymphoblastic
leukaemia
Activated or memory B cell
Chronic lymphocytic leukaemia
(CLL)
MGUS
Intact
immunoglobulin
myeloma
Light chain
myeloma
Nonsecretory
myeloma
AL amyloidosis
Follicular centre cell
lymphoma
Burkitts lymphoma
Mature memory B cell
Figure 3.4. Development of the B-cell lineage and associated diseases.
Mieloma mltiple


Patogenia y sintomatologa

Unidad Laboratorio Clnico
Seccin Especialidades
Hipercalcemia

La crioglobulinemia es
causada por una protena
anormal que en ocasiones se
encuentra en la sangre de
personas que padecen
mieloma mltiple, leucemia
o ciertas formas de
neumona, la cual hace que
la sangre se gelifique a bajas
temperaturas. En esta
fotografa, la
crioglobulinemia ha
reducido el flujo sanguneo a
los dedos con tal severidad
que se han tornado oscuros.
Las reas negras son
gangrena resultante de la
falta de aporte sanguneo.
Mieloma Mltiple:
Frecuencia segn clase de Ig

Clase de Ig %

IgG 50 - 55
IgA 20 - 25
IgD 1 - 2
IgE Muy infrecuente
Biclonal 0.5 - 1
No secretor 0.5 - 1
Bence Jones (k l) 20

o Son cadenas ligeras kapa o Lambda, que se
eliminan por orina.
o Se presentan en el 50-80% de los pacientes con
mieloma.
o En una electroforesis de orina de 24 horas.
A. Pueden provocar el Rion de Mieloma.
B. Ocurre por obstruccin y perdida de nefronas
Insuficiencia renal.
Free light chain (FLC)
production by plasma cells
Kappa
Lambda
Definicin
Es una gamopata monoclonal que se
caracteriza por la presencia en el suero de
niveles elevados de IgM.
Etiologa
Desconocida.
Frecuencia
Es ms comn entre los 60-70 aos de
edad.
Corresponde aproximadamente al 2% de
todas las enfermedades malignas
hematolgicas.
Macroglobulinemia
de Waldenstrm




FLUJOGRAMA DE ESTUDIO INMUNOLOGICO
MUESTRA SANGRE MUESTRA ORINA(24hrs)

CUANTIFICACION DE PROT./ALB. CUANTIFICACION PROT.
Met:biuret/Verde Bromocresol. Met.:turbidimetrico(Iwata y Niehlkaze)
No cuantificar por cinta

PROTEINAS (+) PROTEINAS(-)

CONCENTRAR ORINA INFORMAR
( PVP polyvinylpyrrolidone)

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS

NORMAL ANORMAL ANORMAL NORMAL

INFORMAR CUANTIFICACION G-A-M INFORMAR
Met.:Nefelomet./turbidimet.

INMUNIFIJACION G-A-M-K-L INMUNIFIJACION G-A-M-K-L
(y/o Inmunoelectroforesis de Prot.) (y/o Inmunoelectroforesis de Prot.)

DETECCION DE OTROS MARCADORES

PCR- IL-6- B2MICROGLOB.-TNF-ALFA

CITOMETRIA DE FLUJO BIOLOGIA MOLECULAR

Cuantificacin de inmunoglobulinas
La Cuantificacin de inmunoglobulinas, es un examen
complementario y fundamental en el estudio de pacientes
con sospecha de GM., existe diferentes mtodos para su
determinacin:
IDR:Tcnica de precipitacin en gel,en el agar se
encuentra un antisuero monoespecifico
Pocillos para Muestras
48 horas cmara hmeda y T constante
Anillos de precipitacin
Turbidimetra:Tcnica en la cual se mide la
turbidez o nubosidad (complejos AG_AC) de una
solucin,
La deteccin de la turbidez se mide en un
turbidimetro, este detecta la luz incidente que
atraviesa la solucin y la mide en lnea directa ,
cuantifica luz transmitida.
Tcnica rpida
Problemas en muestras con exceso de antgeno




Unidad Laboratorio Clnico
Seccin Especialidades
Nefelometra:Tcnica que mide la luz dispersa
en un determinado ngulo cuando una fuente
de luz incidente esta choca con los complejos
AG_AC presentes en una solucin.
Actualmente es la tcnica de eleccin para
determinar Inmunoglobulinas.






Utilidad del examen
La cuantificacin de inmunoglobulinas permite :
establecer un ndice pronostico (enfermedad
benigna o maligna)
Mantener un control y monitoreo evolutivo del
tratamiento
Detectar precozmente el inicio de una
inmunodeficiencia.

Electroforesis de Protenas
Es el movimiento de partculas o molculas que se separan de
acuerdo a su carga neta en presencia de un campo elctrico. Las
protenas estn compuestas por aminocidos, que le dan la carga
neta de estas dependiendo del medio en que se encuentran. La
electroforesis es un mtodo no inmunolgico.
Campo Elctrico
Voltaje Aplicado

Partcula cargada




pH y Fuerza Inica(FI) del buffer
ph es responsable carga neta elctrica partcula
FI Baja- Mayor VM y Baja Temp.
FI Alta- Mayor Definicin de bandas y Alta Temp.
Calor generado (Temperatura)
Soporte y muestra
+ H+ + - OH -
NH3 RCOOH NH3RCOO NH2 RCOO + H2O
Enlace peptdico
Tcnica ( soporte Acetato de Celulosa)
Preparacin cmara, soporte. aplicador
Preparacin de la placa
Aplicacin de la muestra
Electroforesis 20 min./180 volts
Tincin de Bandas con Rojo Ponceau
Decoloracin placa con cido actico
Deshidratacin de placa con metanol
Aclaramiento de placa con Clear aid (polyethylene
glycol)
Secado de placa (10 min./50 C)
Leer placa con filtro de 525 nm.
Tcnica de electroforesis de protenas


Placa de electroforesis de protenas sangre y
orina



Patrn electroforesis normal








Electroforesis en acetato de celulosa: Densitometra,
cuantifica el rea bajo la curva

INMUNOFIJACION DE INMUNOGLOBULINAS

La Inmunofijacin es un procedimiento que consta de dos
etapas.:
Electroforesis de protenas corrida en gel de agarosa en 6
posiciones
La segunda etapa es una inmunoprecipitacin. Sobre la
placa de agarosa en que se han separado las protenas
por electroforesis se aplican antisueros monoespecficos
y la presencia del antgeno complementario forma
complejos de antgeno anticuerpo que precipitan. La
formacin de precipitado antgeno-anticuerpo estable fija
las protenas al gel.
Posee mayor sensibilidad y poder resolutivo que IEF
Utilidad del examen
Su principal uso es en la identificacin de protenas
monoclonales.
Caractersticas tcnicas Inmunofijacin
Soporte
Gel de Agarosa
Voltaje
110 volts
Buffer
Barbital-Barbital Na (pH 8.8)
Colorante
Azul de Coomasie
Muestra
Suero , Orina Concentrada, LCR
Lectura
Anlisis visual de las bandas
Tcnica ( soporte Gel de Agarosa)
Preparacin cmara, soporte. aplicador
Preparacin de la placa
Aplicacin de la muestra
Electroforesis 15 min./110 volts
Aplicacin de antisueros
Lavado y prensado
Tincin de Bandas con Azul de Coomasie
Secado a T ambiente
Lectura visual de las bandas
Tcnica de Inmunofijacin de
inmunoglobulinas

Inmunoelectroforesis de Protenas
La inmunoelectroforesis (IEF)
Desarrollada por Grabar y Williams
Tcnica cualitativa que permite la identificacin de diferentes
antgenos en mezclas complejas, que pueden tener peso molecular
y movilidad electrofortica semejante, pero diferentes
determinantes antignicos.
Este mtodo se realiza en geles de agar o agarosa y se distinguen 2
etapas:
La solucin de protenas se somete a separacin
electroforetica
Terminada la electroforesis las protenas son
analizadas con antisueros poli o monoespecificos
aplicados en un canal paralelo al eje de la migracin.
Despus de la difusin en cmara hmeda, se observan
los arcos de precipitacin.
Utilidad del examen
La IEF es de gran utilidad para el anlisis e identificacin de
componentes monoclonales que caracterizan a las enfermedades
asociadas con gamapatas monoclonales,
Se necesita para su interpretacin gran experiencia por parte del
profesional que realiza la tcnica.

Deteccin de otros marcadores
Beta 2 Microglobulina
Esta protena forma parte de la estructura de las molculas
clase I del sistema Principal de histocompatibilidad, se
encuentra en superficie de todas las clulas nucleadas, puede
medirse en suero y en orina .
Constituye un factor pronostico en los sndromes
linfoproliferativos como MM.
Niveles elevados (activacin y destruccin de linfocitos) se
asocian con sobrevida mas corta que pacientes con GM con
niveles normales.
Niveles normales: 1.15 - 2.03 ug/ml
PCR
es empleada comnmente para monitorear procesos
inflamatorios , aunque en forma inespecfica. Los niveles de
esta protena se eleva en los pacientes con GM, particularmente
en MM,
Valor normal hasta 0.6 mg/dl.
Unidad Laboratorio Clnico
Seccin Especialidades
Interleuquina-6 (IL-6)

IL-6 es un factor muy importante de crecimiento
maduracin i proliferacin de linfocitos B malignos o
clulas plasmticas tumorales, esta interleuquina cumple
un rol muy importante en la respuesta de fase aguda,
mediando en la sntesis de las protenas de esta fase ,
,por esta razn hay una relacin directa con el
incremente de la PCR.
Un aumento a nivel serico constituye un ndice de
malignidad, por ende , de mal pronostico de las GM

TNF - alfa
Citoquina proinflamatoria, la cual tambin registra un
incremento en sus niveles en algunas de las fases
tumorales del MM.
Unidad Laboratorio Clnico
Seccin Especialidades

Citometra de Flujo

La citometra de flujo resulto de la aplicacin del conocimiento de
tcnicas y ciencias que ya haban desarrollado en forma
independiente como la tecnologa lser, produccin de
anticuerpos monoclonales, la citoqumica, la fluorocromoqumica
y la ciencia computacional
Citmetro es bsicamente un microscopio sofisticado, con
capacidad de analizar rpidamente mltiples propiedades de
clulas aisladas suspendidas en un medio liquido.
Aplicacin en GM.
Clonalidad
Poblaciones Linfocitarias




Unidad Laboratorio Clnico
Seccin Especialidades