INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL.

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS.

INGENIERA BIOQUMICA.
Laboratorio de microbiologa industrial y biotecnologa
microbiana.
Prctica 2. Seleccin secundaria de
levaduras para produccin de biomasa.
6IM2
Equipo 3. Seccin 1.
Abrego Chvez Ivn.
Domnguez Snchez Ivn.



1 10/ 09/ 2014
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE ACTINOMICETOS
ANTIBACTERIANOS DE MUESTRA DE SUELO DE
KALAPATTHAR, REGIN DEL MONTE EVEREST.
Tara Devi Gurung; Chringma Sherpa; Vishwanath Prasad Agrawal; Binod Lekhak1
Departamento Central de microbiologa, Universidad Tribhuvan, Kirtipur, Nepal.
Academia de ciencia y tecnologa de Nepal, Khumaltar, Lalitpur
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Introduccin.
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Dominio
Bacteria
Filo
Firmicutes
Clase
Actinobacteri
a
Subclase
Actinobacterida
e
Bacterias G(+)
Formacin
filamentosa
Alto contenido de
G y C en DNA
Fuente de ATB
Introduccin.
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Uso de suelos
Kala Patthar
(5545 m)
Monte Everest,
Nepal.
Ambiente extremo
MATERIALES Y MTODOS.
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Recoleccin de muestras de suelo.
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Noviembre de 2006
Profundid
ad 4-5 cm
Bolsas de
polietileno
Mezcladas
con 1g
CaCO3
Secado a
temperatu
ra
ambiente
3 semanas.
Muestras de suelo seco
Aislamiento de actinomicetos.
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Extensin en placa
Diluciones en
placa.
Agar almidn
casena.
Cicloheximida Nistatina.
Deteccin de actinomicetos por
actividad antibacteriana.
Seleccin primaria Seleccin secundaria.
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Test en Agar Nutritivo
E. coli, Proteus mirabillis, P vulgaris,
K. pneumoniae, K. oxytoca, S. aureus,
B. subtillis, Shigella spp., S. typhi,
Test en MHA
Staphylococcus aureus
Resistente a meticilina
Caracterizacin de actinomicetos
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Morfologa microscpica
Morfologa colonial
Morfologa de los aislados
comparada con
la morfologa de actinomicetos
del manual de Bergey.
Caracterizacin de actinomicetos
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Prueba de la catalasa
Pruebas de hidrlisis.
Prueba de la oxidasa
Prueba de reduccin
de nitratos
Fermentacin.
Aislados
Cultivo
sumergido
Matraz
erlenmeyer
Amplio espectro
antibacteriano.
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Aislamiento de metabolitos
antibacterianos.
Filtrado
Extraccin
con solvente
Purificacin
por
evaporacin
Pesada
Conservacin
en regulador
de fosfatos.
Adicin de
etil acetato
Agitacin
vigorosa
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Determinacin de actividad
antibacteriana.
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Mtodo de difusin en agar.
Determinacin de concentracin
mnima inhibitoria.
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Staphylococcus aureus.
Cromatografa en capa fina.
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Vancomicina
(Referencia)
10L de
metabolitos
antimicrobianos
Disolvente
CHCl3 y CH3OH
Cmara de
vapor usando I2.

Cromatografa en Placa de slica gel
RESULTADOS
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17 activos frente a G(+)
3 activos frente a G(-)
7 activos frente a G(+) y G(-)
27 de 79 presentan
actividad antibacteriana
19 frente a S. aureus
18 frente a B. subtilis
8 frente a S. paratyphi
5 frente a S. typhi
5 frente a P. vulgaris
4 frente a K. pneumoniae y K. oxytoca
3 frente a E.coli, Shigella spp. y P. mirabilis
K.6.3, K.14.2 y K.58.5 son de amplio espectro, inhibiendo
incluso, a MRSA ATCC 40 y MRSA ATCC 42
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13 de los 19 aislados en la
seleccin primaria
presentan actividad
antibacteriana por lo
menos en un tester.
K.6.3, K.14.2 y K.58.5 siguen
presentando amplio espectro,
incluyendo a las cepas MRSA
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Seleccin
Secundaria
Seleccin
Primaria
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16 como Streptomyces
2 como Micromonospora
1 como Intrasporangium 7 sin identificacin
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Caldo fermentado de K.6.8, K.14.2
y K.58.5
No se logr
K.6.3 1 mg/ml
K.14.2 y K.58.5 2 mg/ml
Frente a S.aureus ATCC 29213
Cada extracto mostr dos puntos;
uno en el sitio de carga y el otro,
cerca del frente del solvente
Mostraron actividad
antibacteriana en todos los testers
K.6.3 Rf= 0.88
K.14.2 Rf=0.86
K.58.5 Rf=0.95
Vancomicina (control) Rf=0.09
DISCUSIN
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Aislados.
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79 aislados
Supervivencia
Difcil.
Adaptacin a su
medio ambiente
por formacin de
esporas.
Dificultades en el
aislamiento.
Periodo de
incubacin.
-Tratamiento previo.
-Uso de medio
selectivo.
-Uso de antibiticos.
Mtodos de
seleccin
primaria.
Seleccionar
aislados
antibacterianos
Determinara el
rango de
bacterias
sensibles.
Mtodos de
seleccin
secundaria.
(Cuantitativo)
Rendimiento del
antibitico que
puede esperarse
cuando el mo crece
en diferentes
medios.
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79 aislados
Seleccin
primaria
27 actinomicetos
activos.
Seleccin
secundaria.
13 actinomicetos
activos.
Puede deberse a la
diferente morfologa
cuando se cultivan en
medio slido y en
medio lquido.
-Inactivacin de
compuestos.
Mayor actividad
sobre Gram (+)
Pared celular
Aislados
K.6.3 , K.14.2 y
K.58.5
(Mejores cepas)
-Amplio espectro.
-Halos de 20mm
-Fermentacin.
-Extraccin con
disolventes.
(Inconvenientes)
Grupos polares en
los metabolitos
Agitacin
inadecuada y falta
de disolvente
correcto
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Aislados
K.6.3
MIC=1mg/mL.
K.14.2.
MIC=1mg/mL
Filtrado crudo
(Evaporacin)
K 58.5
MIC=2mg/mL
Anlisis de extracto
crudo por
cromatografa.
2 manchas. (Por
identificar)
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Aislados con
heterogeneidad
metablica.
Correcta
identificacin.
Pruebas fisiolgicas
y bioqumicas.
Aislados activos.
Anlisis numrico
Dendrograma.
-3 grupos 50% similitud.
-22 grupos 80%
Similitud.
Aislados K.6 y K58,5
Presuntivamente
pertenecientes al
gnero
Streptomyces
Aislado
K.14.2

Gnero diferente
Prometedor para
descubrimiento
de potente
antibitico.