Cromatografa

Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
Descubridor
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail
Semenovich Tsvett, 1872-1919)
Definicin
Cromatografa es un mtodo de separacin
en el que se aprovechan las diferencias en
el comportamiento de particin entre una
fase mvil y una fase estacionaria para
separa los componentes de una mezcla.
Cromatografa, definicin (cont.)
Una columna u otro soporte mantienen a
la fase estacionaria y la fase mvil acarrea
a la muestra.
Los componentes de la muestra que
particionan fuertemente con la fase
estacionaria estarn ms tiempo dentro de
la columna.
Si es en columna :
Conforme los componentes son eluidos
de la columna, pueden ser cuantificados
por un detector y colectados para anlisis
posterior
Mtodos cromatogrficos
De gases
En capa fina
En lquidos inmovilizados
De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidroxiapatita
Hidrofbica
Afinidad
HPLC
Exclusin molecular
Fase estacionaria:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida
Las molculas grandes fluyen ms
rpido que las pequeas.
Desarrollo de una cromatografa
de exclusin molecular
Determinacin del tamao de la
columna
Hidratacin y lavado de la resina
Empaque de la columna
Determinacin del volumen vaco
Corrimiento de la muestra
Cromatograma de exclusin
molecular (EM)
Elusin de una columna de cromatografa de EM
Caractersticas de las resinas
de EM clsicas
BioGel



Sephadex



P-60
P-100
P-200
P-300
G-50
G-100
G-150
G-200
3-60
5-100
30-200
60-300
2-30
4-150
5-300
5-600
Nombre
Cdigo
Rango de
Fraccionamiento
(kDa)
Flujo mximo
(cm/hr)
5
5
4
3
5
5
3
2
Intercambio inico
Intercambio inico
Las protenas difieren mucho en su afinidad
por materiales cargados positiva o
negativamente.
Los soportes pueden ser:
Dextrn con enlaces cruzados
Agarosa con enlaces cruzado
Poliacrilamida
Celulosa
Poliestireno
Slice
Grupos intercambiadores
Carboximetilo (CM)
CH
2
CH
3

(CH
2
) NH
CH
2
CH
3
+
CH
2
N
+
(CH
3
)
3
PO
3
-

CH
2
COO
-

Fosfato (P)
Dietilaminoetil (DEAE)
Mono Q
2
Principios del intercambio
inico
La afinidad de una protena es proporcional
a la concentracin de sal requerida para
liberarla del material.
Una columna se carga (de protenas) con
un amortiguador de baja fuerza inica y la
elusin se inicia por incremento de la
concentracin del amortiguador de elusin.
Desarrollo de una cromatografa
de intercambio inico
Hidratacin y Lavado de la resina
Activacin (lavado con cido y base fuerte
diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y
finalmente con la sal que se usar ej.
NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal)
Volumen de la columna y capacidad de
retencin de la resina.
Diferentes sales tienen diferentes fuerzas
de elucin cuando se usan en
cromatografa de intercambio inico.
Intercambio del anin
citrato>sulfato>oxalato>I
-
>NO
3
-2
>CrO
4
-
>Br-
> SCN
-
> Cl
-
> Formiato
Intercambio del catin
Ba
2+
> Pb
2+
> Sr
2+
> Ca
2+
> Ni
2+
> Cd > Cu
> Co > Zn>Mg>Ti+> Ag >
Rb
+
>Cs
+
>K
+
>NH
4
+
>Na
+
>H
+
>Li
+
Amortiguadores
Para intercambiadores aninicos se
deben usar amortiguadores catinicos o
zwitterionicos
No usar amortiguadores aninicos pues
se unen a la resina.
Usar detergentes catinicos o no
inicos.
Cromatograma de intercambio
inico
Tiempo de retencin (min)
A


2
8
0

n
m

0 30 90 60
b
0
500
N
a
C
l


m
M

53
Hidroxiapatita (HA)
Introducida por Tiselius et al. en 1956
Bernardi realiz un estudio sistemtico
(Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography on calcium phosphate
columns, Arch Biochem Biophys 65, 132155
Frmula
Forma cristalizada de fosfato de calcio

(Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
)
Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography:
column performance for proteins, Eur J Biochem 152, 361371
Unin selectiva de protenas a
la hidroxiapatita
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.
Los grupos amino son atrados por los sitios fosfato pero
repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para
los carboxilos.
Adsorcin de grupos amino
Se debe a interaccin electrosttica no
especfica entre su cargas positivas y
las cargas generales negativas de la
columna de HA cuando la columna es
equilibrada con amortiguador de
fosfato.
Incremento de la unin de aminas
por bloqueo de la repulsin.
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de coordinacin.
Los dobles parntesis
indican repulsin.
Las lneas punteadas
indican enlaces inicos.
Los grupos fosfatos en solucin pueden cubrir a calcios que
repeleran a los grupos aminos.
Disociacin selectiva de la
hidroxiapatita
A, es una protena
bsica.
B, es una protena
acdica
El tringulo indica
enlaces de
coordinacin. Notar
que estos no se
afectan.
Efecto de la concentracin de
fosfato en la unin de protenas
El perfil superior fue
cargado con fosfato 1
mM
El inferior, con fosfato
50 mM.
La capacidad de unin
de las IgG se mejor
reduciendo la
competencia de
contaminantes.
Barrido con dos gradientes
El primer gradiente va
de 0 a 500 mM de
cloruro de sodio.
El segundo, de 0 a 500
mM de fosfato de
potasio.
El amortiguador base
es 0.5 M MES, 1mM
fosfato, pH 6.
La elusin de la IgG se
observa en gris
Usos
Purificacin de:
Protenas
cidos nuclicos
Virus
Bases de la Tcnica
Su selectividad no depende de la masa
molecular, densidad de carga o punto
isoelctrico.
Bases de la tcnica
La adsorcin y la elucin de las protenas
no son procesos en reversa de un solo
efecto.
Los grupos amino y carboxilo actan de
manera diferente en la adsorcin de las
protenas a la HA.
La elucin de protenas cidas y bsicas
por diferentes sales tiene deferentes
mecanismos.
Ventajas
HA tiene poco poder de adsorcin de
molculas de masa molecular baja
como nucletidos, sales y aminocidos.
Es relativamente incompresible.
Existen variantes cermicas ms fciles
de trabajar pues no se compactan.
Cromatografa hidrofbica
Cromatografa Hidrofbica
Los grupos adicionados al soporte son el
alcohol octlico, grupos bencnicos u otros
grupos hidrfobos como hidrocarburos
(C4, C8 o C18).

Los centros hidrfobos de las protenas son
expuestos por exceso de salinidad y son
atrapados por la columna.
Cromatograma hidrofbico
Tiempo de retencin (min)
A


2
8
0

n
m

0 30 90 60
b
0
500
(
N
H
4
)
2
S
O
4

m
M

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Series caotrpicas
Aniones
PO
4

>SO
4

>CH
3
COO

>CL

>Br

>NO
3
>ClO
4

>I>SCN

Cationes
NH
4
+
>Rb
+
>K>Na
+
>Cs
+
>Li
+
>Mg>Ca
2+
>
Ba
2+
Cromatografa de Afinidad
Sistema muy poderoso de purificacin
Sistema restringido
Se basa en la interaccin especfica de
dos compuestos
Antgeno - Anticuerpo
Enzima - sustrato
Receptor - Ligando
HPLC
Cromatografa lquida de alta
resolucin
High-performance liquid
chromatography
Limitaciones de la cromatografa
a bajas presiones
Imposibilidad fsica de aumentar el flujo
Resinas compresibles
Corridas de muchas horas
Grandes volmenes

Descubrimientos que
facilitaron la HPLC
Sntesis de resinas incompresibles
Nuevas tcnicas en el empaque de
las columnas
Microparticulacin de las resinas
Adelantos en la tecnologa
espectrofotometrica
Tipos de HPLC
De exclusin molecular
Intercambio inico
Hidrofbica
Afinidad
De fase reversa
Instrumentacin
Sistema de bombeo
Resistente a qumicos
Poca variabilidad
Presiones de 30 as 400 atm
Flujo constante (libre de pulsos)
Buen mezclado de los solventes
Reproducibilidad en la formacin de los
gradientes
Tipos de bombas
Jeringa
Pistn recproco
Diafragma
Presin constante
Detectores
Detectores de UV-Visible que pueda
leer 2 o ms longitudes de onda al
mismo tiempo
Detector de arreglo de diodos. Espectro
de 200 a 600 nm en menos de 1
segundo.

Cromatografa de fase reversa
Se basa en las propiedades hidrofbicas de las
protenas.
El proceso de elucin es diferente que en la
cromatografa hidrofbica
La fase mvil es un solvente orgnico (metanol,
2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA,
cido fosfrico, actico o hidroxibutrico).
Fase estacionaria
Slica acoplada con un derivado
alquilsilano.
La longitud de la cadena alquilo puede
ser de C
4
, C
8
, C
18
.
La porosidad del soporte es variable y
se recomienda que sea entre 300 a
1000 A
El tamao de las partculas es de 5 a 20
m
o
Fase mvil
La acidez de la fase mvil:
Influencia el estado inico de la
protena
Controla la ionizacin de la superficie
silanol
Forma pares inicos con la zona
catinica de la protena
Favorece la exposicin de zonas
hidrofbicas de la protena
Cromatograma de fase reversa
0 20 40
17
0
40
80
A
c
N

(
%
)

A


2
1
5

Tiempo de Retencin (min)
a
HPLC de Fase Reversa
Separacin eficiente an con
concentraciones altas de protenas
Bajo ruido de fondo
Solventes voltiles
Fcil formulacin de la fase mvil
Reproducibilidad de gradientes.
Diagrama del sistema HPLC
Manejador de muestras
Manejador de solvente
Celda Microbore
Celda Analtica
Termostato de la columna
Columna
Celda Preparativa
HPLC WATERS
modelo antiguo
HPLC WATERS
Cromatgrafo de Gases
Principales componentes
Gas de acarreo
Controladores de flujo
Inyectores
Columnas
Detectores
Sistema de datos
Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere
el uso de un gas de complemento en el detector (make-
up).

El make-up, es un gas de arrastre adicionado al
efluente de la columna antes de que pase al detector.

El sistema del gas portador, por lo general contiene uno
o varios tamices con el objeto de eliminar humedad,
hidrocarburos y oxgeno.

Los caudales utilizados en las columnas empacadas
oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las
capilares.
Gas de acarreo