You are on page 1of 26

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

DE ALTA EFICACIA (HPLC)



Cromatografa. Es un mtodo fsico de
separacin en el que los componentes
a separar se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales est en reposo
(FE) mientras que la otra (FM) se mueve
en una direccin definida.
Cromatgrama. Una grfica u otro tipo
de presentacin de la respuesta de un
detector.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que
est unida de forma covalente a las
partculas de soporte o a la pared
interior de la columna.

Efluente. La fase mvil que abandona
la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto
nmero de componentes, cuya
separacin se pretende en el lecho
cromatogrfico al ser arrastrados o
eluidos por la fase mvil.
Componentes de la Muestra. Los
constituyentes qumicamente puros de
la muestra. Pueden no ser retenidos
por la fase estacionaria (es decir, no
retardados), retenidos parcialmente (es
decir, eluidos a tiempos diferentes) o
retenidos permanentemente.
El proceso cromatografico es rapido
Permite separacion de sustancias
termolabiles
Se puede identificar sustancias con un
amplio margen de pesos moleculares
Emplea presiones elevadas 600 atm
Longitud de columnas entre 5 y 25 cm y
diametro de 1 a 5 mm
Las columnas pueden ser de vidrio o
acero inoxidable o plastico

Proceso en una columna
Se inmoviliza en una columna un slido
finamente dividido llamado fase estacionaria.
Se coloca en la parte superior de la columna un
pequeo volumen de muestra que hay que
separar.
Se fuerza a la mezcla disuelta, a travs de la
fase mvil, a atravesar la columna para
arrastrar los diversos constituyentes. Si los
compuestos de la mezcla migran a velocidades
diferentes, podrn recogerse separadamente.
Caractersticas de los detectores
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un
detector para convertir la muestra en una seal
elctrica medible.
Linealidad. Rango de masa concentracin de
muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin
arbitraria.
la linealidad del detector es el que le indica al
analista la concentracin para la cual el detector
es confiable.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la
amplitud pico-pico de la seal. El significado de
conocer el nivel de ruido de un detector es un
factor determinante en la determinacin de la
cantidad mnima detectable
Lmite de Deteccin. Est definido como la
mnima cantidad de sustancia que puede
producir una seal que sea el doble del nivel
de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida
generada por el proceso en el que un detector
est operativo sin que alguna sustancia pasa a
travs de l. Esta seal permite diagnosticar el
buen o mal funcionamiento del detector.

Recipientes
Los recipientes que se utilicen para
almacenar la FM tienen que ser inertes.
El disolvente no deber extraer especie
alguna del material con el que estn
construidos. botellas de vidrio y tubos de
tefln. Estn provistos de unos filtros, para
eliminar los gases disueltos y partculas
que pueda contener la FM.
Debido a las elevadas presiones de trabajo
y al pequeo tamao de las partculas de la
FE, se utiliza una bomba encargada de
introducir la FM o disolvente a travs de la
columna.
Elusin isocrtica. La composicin del
disolvente se mantiene constante.
Elusin con gradiente. La composicin del
disolvente cambia en forma continua por etapas.


Productos farmacuticos Antibiticos, sedantes,
esteroides, analgsicos
Productos bioqumicos Aminocidos, protenas,
carbohidratos, lpidos
Productos alimenticios Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aditivos
Reactivos qumicos
industriales
Aromticos condensados,
colorantes, propelentes
contaminantes Pesticidas, herbicidas,
fenoles
Caracteristicas del sistema de
bombeo
Generar presiones superiores a 6000 psi.
Capaces de cubrir un amplio rango de
flujo entre 0,1 y 10 ml/min con una
precisin del 0,5 % y que est libre de
pulsaciones.
Construidos con materiales inertes
respecto a los disolventes empleados.
Bombas recprocas o de vaivn, formadas por
una pequea cmara cilndrica que se llena y
luego se vaca por oscilacin de un pistn de
zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que
debe amortiguarse. Sus ventajas son que se
consiguen presiones elevadas y se suministra
un caudal constante, pudindose adaptar a la
tcnica de elucin con gradiente, debido a su
pequeo volumen interno.
Bombas de desplazamiento o tipo jeringa,
cmara equipada con un mecanismo de
tornillo. Suministran un flujo libre de
pulsaciones con una capacidad limitada a unos
250 ml.
Bombas neumticas o de presin
constante, hacen uso de la presin de un
gas aplicado al recipiente conteniendo la
fase mvil. Son sencillas, no provocan
pulsaciones pero estn limitadas a
presiones relativamente bajas.

Los volmenes que se inyectan de
muestra debern ser pequeos para
evitar la sobrecarga de la columna. Hay
varios tipos:
El mtodo ms simple es la utilizacin de
una jeringa de alta presin con un
diafragma (septum) a la entrada de la
columna. Est limitado a una presin
mxima de operacin de 1500 psi.
Las vlvulas de inyeccin con bucles de
volumen conocido, es el mtodo ms
utilizado.
Sistema de inyeccin
Detectores
Detectores de absorbancia ultravioleta,
Su fundamento es la espectrofotometra
de absorcin de luz visible y ultravioleta
de un componente a una determinada
longitud de onda.
Los datos de absorbancia se
representan en funcin de la longitud de
onda y del tiempo.
Detectores electroqumicos, es especifico,
sensibilidad y amplia aplicabilidad,
especialmente para compuestos
orgnicos. Responde a analitos que
puedan oxidarse.
Detectores de fluorescencia, son muy
sensibles y selectivos, el principio de
operacin se basa en la irradiacin con la
luz UV al componente de inters y la
posterior medida de la luz fluorescente
emitida por ste.
Detectores de ndice de refraccin, est
formado por una celda con dos
compartimentos, en uno se introduce el
disolvente puro y en el otro la muestra, se hace
pasar luz visible paralela. Cuando entra en la
celda soluto de distinto ndice de refraccin al
disolvente el has se desva y vara la seal
dada por la fotoclula . Sensibles a los cambios
de temperatura no es apropiado para la
elusin con gradiente.
Detectores de conductividad, los solutos
eluidos son inicos, cidos y bases, as como
cationes y aniones inorgnicos despus de su
separacin por cromatografa de cambio inico.
Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga
duracin.
Cromatografa de intercambio
inico

La Fase Estacionaria es una resina de
intercambio inico que contiene
grupos cargados, teniendo la
propiedad de separar especies
ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase
Mvil es generalmente una solucin
amortiguadora de pH.


Cromatografia por permeabilidad
en gel
Es para separacin de protenas. Separa en funcin
de su tamao.
La matriz de la columna es un polmero
entrecruzado con poros de tamaos determinados.
Las protenas de mayor tamao migran ms rpido a
travs de la columna, que las de pequeo tamao,
ya que son grandes para pasar por los poros de las
bolas de polmero.
Las protenas de menor tamao, entran en los
poros y su marcha a lo largo de la columna es ms
lenta.
Cromatografia de afinidad
Permite la separacin de mezclas proteicas por su
afinidad o capacidad de unin a un determinado
ligando.
las protenas que se retienen en la columna son
aquellas que se unen especficamente a un
ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna.
las protenas que no se unen al ligando son
lavadas o eluidas a travs de la columna, la
protena de inters que ha quedado retenida en la
columna se eluye o libera mediante el empleo de
una solucin que contiene un ligando libre u otro
compuesto que rompa la interaccin entre el
ligando y la protena.

You might also like