La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) es un método de separación cromatográfica donde los componentes de una muestra se distribuyen entre una fase móvil y una fase estacionaria inmóvil. El proceso HPLC permite la separación rápida de sustancias termolábiles a altas presiones utilizando columnas cortas. Los detectores miden las propiedades de los analitos eluidos para identificar los componentes separados de la muestra.
La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) es un método de separación cromatográfica donde los componentes de una muestra se distribuyen entre una fase móvil y una fase estacionaria inmóvil. El proceso HPLC permite la separación rápida de sustancias termolábiles a altas presiones utilizando columnas cortas. Los detectores miden las propiedades de los analitos eluidos para identificar los componentes separados de la muestra.
La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) es un método de separación cromatográfica donde los componentes de una muestra se distribuyen entre una fase móvil y una fase estacionaria inmóvil. El proceso HPLC permite la separación rápida de sustancias termolábiles a altas presiones utilizando columnas cortas. Los detectores miden las propiedades de los analitos eluidos para identificar los componentes separados de la muestra.
Cromatografa. Es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (FE) mientras que la otra (FM) se mueve en una direccin definida. Cromatgrama. Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector. Fase Ligada. Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas de soporte o a la pared interior de la columna.
Efluente. La fase mvil que abandona la columna. Muestra. Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil. Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. El proceso cromatografico es rapido Permite separacion de sustancias termolabiles Se puede identificar sustancias con un amplio margen de pesos moleculares Emplea presiones elevadas 600 atm Longitud de columnas entre 5 y 25 cm y diametro de 1 a 5 mm Las columnas pueden ser de vidrio o acero inoxidable o plastico
Proceso en una columna Se inmoviliza en una columna un slido finamente dividido llamado fase estacionaria. Se coloca en la parte superior de la columna un pequeo volumen de muestra que hay que separar. Se fuerza a la mezcla disuelta, a travs de la fase mvil, a atravesar la columna para arrastrar los diversos constituyentes. Si los compuestos de la mezcla migran a velocidades diferentes, podrn recogerse separadamente. Caractersticas de los detectores Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible. Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido. Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
Recipientes Los recipientes que se utilicen para almacenar la FM tienen que ser inertes. El disolvente no deber extraer especie alguna del material con el que estn construidos. botellas de vidrio y tubos de tefln. Estn provistos de unos filtros, para eliminar los gases disueltos y partculas que pueda contener la FM. Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de las partculas de la FE, se utiliza una bomba encargada de introducir la FM o disolvente a travs de la columna. Elusin isocrtica. La composicin del disolvente se mantiene constante. Elusin con gradiente. La composicin del disolvente cambia en forma continua por etapas.
Productos farmacuticos Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Productos bioqumicos Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos alimenticios Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos Reactivos qumicos industriales Aromticos condensados, colorantes, propelentes contaminantes Pesticidas, herbicidas, fenoles Caracteristicas del sistema de bombeo Generar presiones superiores a 6000 psi. Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10 ml/min con una precisin del 0,5 % y que est libre de pulsaciones. Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados. Bombas recprocas o de vaivn, formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que debe amortiguarse. Sus ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno. Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones con una capacidad limitada a unos 250 ml. Bombas neumticas o de presin constante, hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn limitadas a presiones relativamente bajas.
Los volmenes que se inyectan de muestra debern ser pequeos para evitar la sobrecarga de la columna. Hay varios tipos: El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi. Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado. Sistema de inyeccin Detectores Detectores de absorbancia ultravioleta, Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada longitud de onda. Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo. Detectores electroqumicos, es especifico, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. Responde a analitos que puedan oxidarse. Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz UV al componente de inters y la posterior medida de la luz fluorescente emitida por ste. Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la fotoclula . Sensibles a los cambios de temperatura no es apropiado para la elusin con gradiente. Detectores de conductividad, los solutos eluidos son inicos, cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin. Cromatografa de intercambio inico
La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH.
Cromatografia por permeabilidad en gel Es para separacin de protenas. Separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna es un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran ms rpido a travs de la columna, que las de pequeo tamao, ya que son grandes para pasar por los poros de las bolas de polmero. Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta. Cromatografia de afinidad Permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene un ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.