PROFESOR JANO VCTOR M.

VITORIA Estrategias de trabajo y aprendizaje

BIOTECNOLOGA
Ingeniera gentica

Desarrollo de las inteligencias

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BIOTECNOLOGA
Visin general:
Utilizacin de los seres vivos para beneficio humano
Produccin de alimentos y bebidas Obtencin de medicamentos

En la prctica:
La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.
Clonacin, mapas genticos, Organismos transgnicos, terapia gnica
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INGENIERA GENTICA
a) Tecnologa de ADN recombinante b) Clonacin y expresin de genes c) Aplicaciones

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PROCESO(ADN recombinante)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Fragmentar y aislar el ADN Unin a vectores. Introduccin en las clulas. Clonacin Bsqueda del clon idneo. Anlisis del ADN clonado: transferencia Southern, Secuenciacin. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

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FRAGMENTACIN DEL ADN

Por endonucleasas

de restriccin

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

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ACCIN DE ENDONUCLEASAS

Generan extremos cohesivos. Si se acta sobre dos ADNs diferentes con la misma endonucleasa, al juntarlos se uniran espontneamente.

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IMGENES DE ACCIN
ENDONUCLEASAS

ADN
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EN DETALLE

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MAPA DE RESTRICCIN
Mapa fsico de un segmento de ADN que muestra los lugares de corte de endonucleasas especficas y la distancia entre pares de bases.

Indica puntos de corte Se reflejan determinadas secuencias de nucletidos. Permite comparar ADNs y ver su similitud (deteccin de mutaciones)

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EJERCICIO 1
Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por separado con dos endonucleasas de restriccin y luego con una mezcla de ambas obtenindose los fragmentos indicados a continuacin :
Endonucleasa de restriccin EcoRI Tamao de los fragmentos (Kb) 3.0 y 4.0

HaeIII
EcoRI + HaeIII

2.0 y 5.0
2.0 , 1.0 y 4.0

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EJERCICIO 1 - Solucin

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APLICACIN MAPA RESTRICCIN

Permite diferencias ADNs de individuos de diferentes especies. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIN (RFLP) (cada individuo tiene diferente coleccin de fragmentos para la accin de una misma coleccin de endonucleasas)

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2. UNIN A VECTORES
Los vectores son estructuras que permiten introducir material gentico en el interior de otra clula.

Los vectores deben ser tratados con las mismas endonucleasas de restriccin. Luego se produce la unin del vector con el fragmento de ADN a introducir.

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PLSMIDOS
Son molculas de ADN circular e bacterias. Tienen replicacin independiente. Adems, otros genes Facilidad para la manipulacin. Porta marcadores especficos: permiten diferenciacin posteror.
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IMAGEN DE UNIN PLSMIDO

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FAGOS
Virus que infectan bacterias (bacterifagos) Transduccin: incorporan material gentico del huesped. Al infectar otra clula (bacteria) introduce el material del antiguo huesped. Ej. Bacteriofgo o fago l.

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FAGO LAMBDA
Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante. 48,502 pares de bases de longitud. Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado.
CICLO DE UN VIRUS
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CSMIDOS
Fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y el sitio COS. (similares a plsmidos) Sitio COS: provoca el empaquetamiento del ADN. Conclusin: permite transportar grandes cantidades de ADN.

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OTROS
Cromosomas artificiales de levadura: YACs Retrovirus Cromosomas humanos artificiales: HACs

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RESUMEN VECTORES

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4. CLONACIN
Sacar copias del ADN que se ha unido al vector. Se utiliza un huesped:
Capacidad de crecimiento rpido. No ser daino o patgeno Ser capaz de aceptar el ADN exgeno y que ste permanezca estable. El husped debe tener enzimas para la replicacin del vector.

Bacterias: E. coli y B. subtillis.

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Escherichia coli como vector

Potencialmente patgeno Produccin de endotoxinas.

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CLONACIN EN EUCARIOTAS
EL ms utilizado Saccharomyces cerevisiae.
Es capaz de recibir plsmidos. Tambin YACs (cromosomas artificiales de levadura)

Cultivos celulares de mamferos:

Manejo parecidos a huspedes bacterianos. Ventaja: tienen proceso maduracin del ARNm y as ya es directamente funcional.

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UTILIZACIN DE YACs

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5. BSQUEDA DEL CLON IDNEO

Hay muchos tipos de bacterias transformadas. Cul tiene el fragmento de ADN exgeno que nos interesa? Se saca rplica en membrana. Se desnaturaliza ADN con NaOH.

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5. BSQUEDA DEL CLON IDNEO

Se desnaturaliza el ADN con NaOH. Se aade sonda radioactiva: complementaria al gen que se quiere buscar. Se lava el ADN monohebra (slo queda el hbrido) Se pone placa fotogrfica.
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Biblioteca genmica

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APLICACIN MDICA OBTENCIN DE LA INSULINA

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6. IDENTIFICACIN DE GENES Southern

Es un mecanismo mediante el cual se pueden identificar genes que se encuentren en fragmentos de restriccin. Aplicacin:
Diagnstico de enfermedades Huella gentica

Concepto previo: electroforesis

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ELECTROFORESIS EN GEL
Gel de Agarosa (polmero de galactosa) Se ponen en pozitos en un extremos los fragmentos de ADN Se somete a un campo elctrico (grupos fosfato son arrastrados al polo +) Fragmentos ms grandes emigran menos. Los pequeos ms.
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MTODO SOUTHERN
1. Electroforesis en gel (separacin de fragmentos por tamao) 2. Desnaturalizacin (a ADN de cadena sencilla) 3. Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los papeles secantes absorben el tampn y los ADN monohebra se pegan al filtro) 4. Hibridacin con sondas marcadas P32. 5. Eliminacin de sondas no unidas. 6. Exposicin a la pelcula fotogrfica y revelado 7. Identificacin de fragmentos
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VER2

VER

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AMPLIFICACIN PCR
Objetivo: obtener millones de copias en poco tiempo de fragmentos de ADN. Se basa en el enzima: , obtenida de Thermobacillus. Slo se necesita conocer la secuencia de los extremos para fabricar cebadores. Tras varios ciclos se forman millones de copias.

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AMPLIFICACIN POR PCR

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POLIMERASA CHAIN REACTION

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CADENA DE REACCIN DE LA POLIMERASA - 1

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PCR 2

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CICLO DE UN VIRUS

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SOUTHERN

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Mtodo southern

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Produccin de alimentos y bebidas Obtencin de medicamentos

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