Konu 6 RNA: zolasyon ve Analizi.

NE?: RNA izolasyonu ve analizi NASIL?: . NEDEN?....

Dier Derslerden Bilinmesi Gerekenler: RNAnn yaps RNA eitleri
8 Kasm 2007 @ Dr. Bekir l Mula niversitesi Molekler Biyoloji

Kaynak 2

Kaynak 1

28 sayfalk bir derleme.

Bu dersi hazrlamak iin yararlanlan Kaynaklardan birisidir. Master ve doktora almalarnda RNA almalarnda kaynak olarak kullanlabilir.

Kaynak 3:
Molekler Biyolojide Kullanlan Yntemler Kitab Temizkan. Arda.

taslak
RNA nedir, RNA cesitleri nelerdir. DNA dan farklar nelerdir? RNA izolasyonu neden gereklidir? Izole edilen RNA ne amac icin kullanilir? RNA nin 3 boyutlu yapisi RNA izolasyonu basamaklari ve bazi teknikler, resimler RNA izolasyonda kullanilan kimyasallar ve kullanilma nedenleri RNA kullanilarak yapilabilecek bazi deneylerin genel hatlarla anlatilmasi

Central Dogma
replikasyon transkripsiyon Processing: ilenmesi translasyon

NEDEN RNA (mRNA) ZOLASYONU: AMA? ELDE EDLECEK RNA NEREDE KULLANILACAK ?

GEN EKSPRESYONU (genin ifade edilmesi) Genotipten Fenotipe gidiat DNAda (gende) depolanm bilginin Protein ile CRASI ya da FONKSYONU RNA!!!! Genotipteki bilgiyi FENOTPE (fonksiyonlar toplamna) TAIYAN ara Molekl !!! Hangi bilginin (hangi genin) ne zaman ve hangi koulda ifade edileceini yani fonksiyona dneceini anlamak, o spesifik genin mRNAsnn hcrede olup olmadna bakmakla balar. (RNA izolasyon ve analizini bilmeniz size bu byk resme ulamanzda yardm eder)

 Genleri tahtada iz ve RNA izolasyon ve analizinin byk resme nasl uyduunu gster.

RNA ve Sentezi
RNA: Ribonkleik asit Kimyasal adan RNA ve DNA birbirine ok benzerdir denilebilir RNA sentezi, DNA Sentezine benzer DNAnn bir iplikiinden komplementer (tamamlayc) iplikik sentezlenir Ama birtakm farklar vardr:

DNA
DNA polimeraz Deoksi-ribonkleotidler timin (T) ki iplikik sentezlenir

RNA
RNA polymerase ribonnkleotidler Uridine (U) Bir iplikik sentezlenir (sense)

Timinde Ekstra metil

H DNDNZ M NEDEN DNADA URASL YERNE TMN VAR?

nk sitozin amin grubunu kaybederek (deaminasyon) urasili meydana getirebilir. Bu hcre ierisinde belli sklkla meydana gelebilen bir olaydr. Bu, DNAda mutasyona neden olur.

Byle bir durum (Sitozin->Urasil mutasyonu) hcrenin DNA tamir mekanizmasyla dzeltilir. Eer DNAda urasil grlrse proofreading ile tamir edilir. te bu yzden DNAda timin vardr.

RNA eitleri

RNA nn 3 boyutlu yaps: RNA dorusal bir makromolekl olarak sentezlenir ama Kendisini oluturan bazlarn birbirleri ile ba yapmas sonucu ekilde gsterildii gibi bir 3 boyutlu yapya brnr. 3 boyutlu yap baz dizisi ve eidine gre farkllk gsterir.

Bilgisayar tarafndan tahmin Edilmi bir 3 boyutlu mRNA grnm. Bu mRNA insan methiyonin Sentaz geninin bir parasdr (5UTR blgesi) PEK RNA y jelde koarken bu 3 boyutlu yap komay etkiler mi? Cevap: EVET. Bunu nasl aabiliriz?: Cevap: Bundan sonraki anlatlacaklarda

Bir mRNA nn ematik ekli:

RNA karyot ve prokaryotlarda farkllk gsterir. Bknz: Baka ders notlarnz. Yukarda bir mRNA nn ematik yaps izilmi.

mRNA y izole etmek iin ekilde gsterilen hangi zellii kullanabiliriz???

RNAnn yapsndaki ribozda bulunan (DNAya gre) ekstra hidroksil grubu (OH) nasl bir fark yaratr?
Bu OH grubu hcre ierisinde nkleofilik ataa urayabilir. Yani protona (H) ihtiyac olan bir baz, OH grubundan H yi koparabilir. Meydana gelen H siz O ba yapmak ihtiyac ile, fosfodiester bandaki P ye atak eder ve bu olay ban kopmasna neden olur. Dolaysyla RNA yapsn bozar. YAN bundan dolay RNA, DNA ya GRE, daha ok degradasyon olmaya yatkndr.

Ayrca hcrede bol miktarda RNaz enzimi vardr. YLEYSE: RNA y paralanmadan bir btn olarak izole etmek DNA ya gre daha zordur. Peki NE YAPMALIYIZ K bunu aabilelim???

mRNA molekllerinin degradasyon yar mrleri

mRNA yar-mrleri Averaj Aralk

Hcre

Hcrenin blnme zaman

Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae (maya) Kltr edilmi nsan hcreleri

20 - 60 dakika

3 - 5 dakika

2 - 10 dakika

3 saat

22 min

4 - 40 dakika

16 - 24 saat

10 saat

30 min ya da daha az (histone, c-myc RNA lar) 0.3 - 24 saat (spesifik mRNA lar)

Dn ve balant kur: NEDEN NSAN HCRELERNN RNA s daha OK ZAMAN DAYANABLYOR? mRNA nn YARI MRLER neden DAHA FAZLA olabilir?

TOTAL RNA ZOLASYONU Gram negatif bakteriler

Organizma: Escherichia coli Kltr, LB besiyerinde 24 saat nceden remeye braklr (10ml), Santrifj edilir (12000g, 4C, 5dk), Pellet zndrlr (10ml protoplast tamponu iinde), lizozim eklenir ve 15 dk buzda bekletilir, Santrifj edilir (5900g, 4C, 10dk), Lizis tamponunda zndrlr, DEPC eklenir, kartrlr ve mikrosantrifj tplerine aktarlr, 37C de 5dk bekletildikten sonra buzda soutulur, Tuz ile doyurulmu DEPCli su eklenerek 10dk buzda tutulur, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 10dk), st sv eit olarak 2 mikrosantrifj tpne alnr ve zerine souk saf etanol eklenir ve bir gece - 20C de bekletilir, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 15dk), kelti souk %70 lik etanolde ykanr ve havada kurutulur kelti DEPC li suda zndrlr.

Gram pozitif bakteriler Organizma: Bacillus subtilis

Kltr, LB besiyerinde 24 saat nceden remeye braklr (10ml), Santrifj edilir (12000g, 4C, 5dk), kelti lizis tamponunda ktrlr, Mikrosantrifj tpne aktarlr ve kuru buzda dondurulur, rnek zndkten sonra, 3 kez 10sn sonikasyon yaplr ve 37C de 60dk bekletilir, Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek kartrlr ve santrifj edilir (14000dv/dk, 5dk, oda scakl) st faz alnarak baka bir mikrosantrifj tpne aktarlr, zerine eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm ile 1 kez, sonra eit kloroform/ izoamil karm eklenerek ekstrakte edilir, st faza NaCl eklenir ve tp souk saf etanol ile doldurulur ve kartrlr, -20 de 1 gece bekletilir, Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 15dk), kelti souk %70 lik etanol ile ykanr, kelti DNA paralama tamponunda zdrlrve zerine DNaz eklenir, 37C de 60dk Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek ekstrakte edilir st faz yeni tpe alnr, alt faza TE tamponu eklenir ve 5dk oda scaklnda santrifj st faz bir nceki st faz ile birletirilir. Bu sv kloroform/ izoamil alkol ile ekstrakte edilir, yeni st faza NaCl ve souk saf etanol eklenir ve -20 C 1 gece Santrifj edilir (14000 dv/dk, 4C, 30dk), kelti souk %70 lik etanolde ykanr ve havada kurutulur kelti DEPC li suda zndrlr.

 Organizma: Saccharomyces cerevisiae Maya kltr santrifj edilir (5000g, 4C), Pellet, SDS tamponu iinde zndrlr ve mikrosantrifj tpne aktarlr, PCIA ve asit ile ykanm cam boncuk eklenir, Karm vortekslenir, zerine fenol/kloroform/izoamil alkol ve SDS ieren tampondan eklenir, kartrlr ve -20 C 1h bekletilir, Buz iine alnr kendi halinde znmesi beklenir ve santrifj edilir (5000g, 4C, 5dk) Eit fenol/kloroform/izoamil alkol karm eklenerek kartrlr ve santrifj edilir (15000g, 5dk, 4C) st sv yeni tpe aktarlr, zerine LiCl eklenir, alt st edilir ve -20 C 1gece bekletilir, Santrifj edilir (15000g, 20dk, 4C) keltinin buz iinde kurumas salanr, kelti DEPCli suda zndrlr ve kk hacimlere blnerek -20C de saklanr.

Mayalar

Memeli dokular
materyal: istenilen memeli dokusu Doku zerine paralama tamponu konur ve homojenizatr yardm ile paralanr, Homojenat tpe aktarlr ve Na-asetat eklenerek kartrlr, Fenol eklenir, kartrlr, kloroform:izoamil alkol eklenir ve 15dk 4C de beklenir, Santrifj edilir (10000g, 20dk, 4 C), st faz baka tpe alnr, zerine izopropanol eklenir ve -20 C de 30dk beklenir, Santrifj edilir ve RNA ktrlr (10000g, 10dk, 4 C), RNA, paralama tamponu iinde zndrlr ve mikrosantrifj tpne aktarlr, zerine izopropanol eklenir, -20 C de 30dk beklenir, santrifj edilir ve RNA ktrlr (10000g, 10dk, 4 C), RNA %70 lik etanolde sspanse edilir, vortekslenir, oda scaklnda 1015dk bekletilir, santrifj edilir (10000g, 5dk, 4 C), RNA keltisi vakumda kurutulur, kelti DEPCli suda zndrlr, -70C de saklanr.

Bitkiler
materyal: soan tipi gvde Paralama tamponu 65 C de stlr, Scak tampon zerine -20 C de dondurulmu bitki materyali eklenir ve homojenizatr yardm ile paralanr, zte proteinaz K ve KCl eklenir, 37C de 60dk bekletilir, Karm buz zerinde 1h tutulur ve santrifj edilir (10000g, 20dk, 4 C), st sv yeni tpe alnr, LiCl eklenir ve 4C de 1 gece beklenir, RNA ktrlr, Santrifj edilir (10000g, 20dk, 4 C), kelti 2 kez LiCl ile ykanr, kelti TE iinde zndrlr veya souk saf etanol iinde -70C de aylarca saklanr.

RNA izolasyonuna yaklasim ve basamaklar: 1.Hucre membran ve ceperini etkili sekilde parcalamak gereklidir. (daha onceki derste anlattik)

2. Nukleaz aktivitesinin inaktif hale getirilmesi

anlatacagiz)

(bu derste detaylica

3. Solusyonu proteinlerden arindirmak icin uygun metodun secilmesi (proteinlerin Proteinaz K enzimi ile parcalanmasi, fenol-kloroform
ekstraksiyonu, guanidyum tampon cozeltisinde cozunurluk..)

4. Nukleik asitin konsantre edilmesi icin uygun metodun secilmesi (tuz + alkol kullanilir. Tuz olarak uygun miktarda NaOAc, NaCl, LiCl,
KOAc ya da NH4OAc. Alkol olarak ethanol ya da izopropanol)

5. Izole edilen RNAnin uygun olarak depolanmasi

RNA PURFKASYONU Deneylerin total RNAym kullanacak, yoksa mRNAym? Total RNA: Birok deneyde yeterli, kfi, rn: Northern analizi, RT-PCR, ribonukleaz protection assay gibi teknikler poly Aieren RNA: (baz deneylerde sadece mRNA gerekir) rn: c DNA ktphanesi inas, array deneylerinde, cDNAnn iaretlenmesi (cDNA hazirlarken rRNA istenmez) vs deneylerde

Genellikle izole edilen total hcre RNAsnn, %5i mRNAdr

Bir doku tipinden ve ktlesinden izole edilecek total RNAy tahmin edebilmek mmkn mdr?
rnek: 5 mg dokudan (ya da 2.5 X 10 6 hcreden) 10 mg civarnda total RNA elde edilebilir. Bunun spesifik RNA eitlerine dalm aadaki gibidir. 8 mg rRNA 0,3 mg mRNA 1,7 mg tRNA ve dier RNA

Prife ettiin RNAnn iinde protein kontaminasyonu var m? Var ise bu bir problem mi? Saf RNA iin A 260 : A 280 = 2.0

Eer protein kontaminasyonunun bir problem olduuna karar verilirse; organik ekstrasyon yaplarak (fenol: kloroform : izoamil alkol 25:24:1) kontaminasyon giderilebilir. Az miktarda kalan, fenol A 260 : A 280 orann azaltabilir. Ve ayrca baz enzimatik reaksiyonlar inhibe edebilir. Fenolu ortamdan uzaklatrmak iin kloroform /izoamilalkol (24:1) kullanlabilir. Prifiye ettiiniz RNA salam m? Degradasyona uram m? zole edilen RNAnn kalitesi en iyi formaldehit- agaroz jel elektroforez ile denatre edici koullar altnda tespit edilir. rnekler 10g /ml EtBr ile gzlemlenebilir. (RNA rneine eklenecek) 28S rRNA ve 18S rRNAy jelde grebilirsiniz. yi kalitede olan bir RNAda 28S rRNA bandnn younluu 18S rRNA nn 2 kat ise izole edilen total RNA iyi bir kalitedir.

Hangi total RNA izolasyon teknii, sizin aratrmanz iin en uygun olandr? Organ ve dokulardan RNA izolasyonu iin 3 temel teknik vardr. ounlukla guanidium yada deterjan kullanlarak hcre paralanr. Ve hcre iindeki RNaz inaktif hale getirilir. Daha sonra elde edilen Lysis solusyonundaki protein, genomik DNA ve dier hcresel kompartmanlardan kurtulmak iin aadaki yntemler uygulanr. 1. Guanidium Cesium Klorid Metodu -Yava bir tekniktir, -ok emek gerektirir. -ok rnek varsa kullanlmas uygun deildir. -RNA temizdir. *Guanidium izothiocyanate, hcreleri lizis eder ve hemen ardndan RNaz enzimlerini inaktif hale getirir. * Ultrasantrifgasyon + Cesuum Klorid 12-24 saat santrifgasyon (32000 rpm) RNA alta ker ve DNA dier proteinlerden ayrlm olur.

2. Tekli ve ok basamakl Guanidium Asit Fenol metodu -Daha hzl, daha az basamak. -Genomik DNA konsantrasyonu sz konusu olabilir. -ok rnek var ise hantal ve uygun olmayan bir teknik. -Ultrasantrifigasyona gerek yok ve RNAy 2-4 saatte izole edebilir. Bu teknikte: RNA 4M Guanidium thiocyanate (GITC); pH:4.0 + fenol/ kloroform zeltisinde sv fazda znm olarak elde edilir. Dk pHda DNA organik fazda, dier proteinler ve makomolekller ise iki faz arasnda kalr.
ekil bir sonraki slaytta. ***Eer tuz kalmsa, alkol ile ykanr.

1. Guanidium Cesium Klorid Metodu

2. Tekli ve ok basamakl Guanidium Asit Fenol metodu

3. Fenolsz teknikler -ok Hzl. -Temiz RNA. -ok byk miktardaki rnekler ile allabilir. -Genomik DNA kontaminasyonu olabilir. Fenol zararl bir kimyasaldr. Hem kullanlmas hem de artklarnn yok edilmesi problem yaratr. Bundan dolay yeni teknikler aratrlm ve guanidium ieren tampon zelti iinde nkleik asitlere balanabilen cam-elyaf(lif) filtreler dizayn edilmitir. Guanidium burada hcreyi lizise uratmak iin kullanlm ve elde edilen Lizis rn ethanol yada izopropanol gibi organik zc ile seyreltilmi ve camlif-filter (ya da rezin reine) iine rnek eklenmitir. RNA bu materyale balanm, DNA ve proteinler ise uygun tampon zeltilerde ykanmtr. En sonunda bal kalan uygun tuz ve pH ieren tampon zeltilerle elsyona uratlm ve izole edilmitir. (Bu teknik, bir nevi kk kolon kullanlan bir prifikasyon stratejisidir) Bu teknikte RNA 1 saatten az srede izole edilebilir.

Bir baka teknik:

DEPC ne yapar? RNaz inhibe eder. nasl?: RNazdan arndrlm solsyon ya da su hazrlamak iin dietilpyrocarbonate (DEPC) kullanlr. DEPC RNaz enziminde bulunan spesifik aminoasitlerin R gruplarnda karboksietilasyona neden olarak, bu proteini etkisiz hale getirir. DEPCnin karsinogen olabilecei konusunda pheler vardr. Dolaysyla bu konuya dikkat edilmelidir.

Baz nemli Noktalar Kullanlan cam malzemelerin, materyallerin, solsyonlarn, RNaz enziminden arndrlm olmas gereklidir. Cam malzeme 180 C de 8 saatten fazla tutularak RNaz dan arndrlabilir. 0,1 % DEPC ile 37 C de 2 ssat inkbasyon ve daha sonra steril su ile ykanarak RNaz etkisiz hale getirilir. Kullanlan elektroforez tanklar % 3 lk hidrojen peroksit solsyonu ile 10 dakiika inkbe edilerek ve daha sonra DEPC-dH2O le ykanarak RNaz etkisiz hale getirilebilir. RNA ile alrken daima eldiven giyilmeli ve sk sk eldivenler deitirilmelidir.

mRNA nn izolasyon stratejisi:

Salam RNA

Degrade olmu RNA

Grntleme cihaz

Analiz software

RNA nn Analizi
a) Spektral yntemler RNA = A260 x seyreltme faktr x 40 (g/ml)

b) Elektroforetik Yntemler (Agaroz- Formaldehit Jel Elektroforezi)

MOPS tamponu iinde agaroz zndrlr, 55 C e kadar soutulur, formaldehit ve etidyum bromr eklenir, Tank iersine dklr ve tarak yerletirilir, RNA 75 C de 10dk stlr, buzda soutulur, ykleme tamponu ile seyreltilip taraklara konur, Jel koulur. Bittikten sonra UV altnda baz rRNA bandlar gzlemlenebilir.

Bozulmu

Paralanm total RNA; jel zerinde belirgin 28S (veya 23S) ve 18S (veya 16S) rRNA bantlarna sahiptir. Bantlardaki parlaklk gze arpar; 28S rRNA band 18S rRNA bandndan 2 kat daha parlaktr. Bu oran (2:1) total RNA nn paralanmadan elde edildiinin gstergesidir.

Bozulmam

Sonuta:
Markerlar

 Ksmen paralanm RNA bulutumsu grnt verirken, belirgin bantlar gzlenmez, Paralanmam RNA da ise 2:1 oran gzlenmez, Tamamen paralanm RNA ise ok kk bantlarn bile gzlendii yaygn bir grnt oluturur.
Markerlar

(2g)

karacier

dalak

beyin

cier

yaprak

maya

E. coli

virs

kk

RNA izolasyon ve analizine bir ornek: gercek bir data

RNA Cos-1 (fibroblast) hucrelerinden izole edildi ve formaldehit-agaroz jel elektroforezinde kosuldu. EtBr ile boyanip UV isigi altinda fotografi cekilen RNA jelinde ustteki band 28SrRNA ve alttaki ise 18SrRNA dir. Bu RNA larin miktarlari cok oldugu icin boyama sonucu jelde gorulebilir. Ancak mRNA ler gorulemez. Bunun icin (spesifik bir mRNA yi gorebilmek icin) RNA analiz teknikleri vardir ve bunlardan birisi Northern Analizidir.
RNA izolasyonunun basarili oldugunu gosteren jel resmi. Degradasyon yok. RNA iyi kalitede. Sonraki analiz teknigi yapilabilir.
28srRNA 18SrRNA

RNA jel resmi. rRNA EtBR ve UV ile gozlemlenebilir.

Northern

Luciferase mRNA si

Radyoaktif Firefly luc geni ile hibridize olan luc mRNA si hucrede bu genin iyi bir seviyede ifade edildigini gosteriyor.

POST-GENOMIK DEVIR: YENI BIYOLOJI VE GELECEK!

RNA ILE YAPABILECEKLERIMIZDEN BAZILARI:

BU SLAYTTAN SINAVDA SORUMLU DEGILSINIZ.

BU SLAYTTAN SINAVDA SORUMLU DEGILSINIZ.

Copyright: Dr. Bekir l