MOLEKLER BYOLOJDE KULLANILAN YNTEMLER II:

PROTENLERN ZOLASYONU VE ANALZ

MOLEKLER BYOLOJDE ANA KURAL ve TEMEL ALIMA ALANLARI

Transkripsiyonel kontrol Translasyonel kontrol Translasyon sonras Kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar)

Gen dizisi transkriptler primer protein rnleri fonksiyonel proteinler (DNA) (mRNA)
Nasl? Neden? Nasl? Neden?

DNA

Nasl? Neden?

RNA

PROTEN

Nkleik asitlerle ilgili teknikler

Proteinlerle ilgili teknikler

MOLEKLLER ARASI ETKLEM

GENOMK LEVSEL (TRANSKRPTOMK)

PROTEOMK LEVSEL (METABOLOMK)

YAPISAL

YAPISAL

Nkleotid dizisinin belirlenmesi

mRNA analizleri

Protein yap analizleri

Protein fonksiyon analizleri

ZETLE:
transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon

DNA

RNA

PROTEN
HCRESEL LEVLER

ANA HEDEF : Hcrenin molekler organizasyonunu, dolaysyla canlln molekler temellerini anlamak !!!

TEORK YAKLAIM:

Nkleotid
dizisi

Amino asit
dizisi
UYGUN 3 BOYUTLU YAPIDA

Genlerle proteinler arasnda bire bir bir iliki yoktur! nk:

DNA

P1 P2 P3 P4

UYGUN ZAMANDA DORU GREN BR PROTEN

P5

AKTF BR PROTEN OLUURKEN 400DEN FAZLA KMYASAL MODFKASYONUN GEREKLEEBLECE NGRLMEKTEDR.

NSANDA: 30.000 GEN 250.000 500.000 PROTEN

SORULAR:

Nerede ve/ya hangi proteinler var ? Ne kadar var?

Yaps nedir ?
Ne gibi zellikleri var?

Nasl i grr ?
Hangi molekllerle etkileir?

Bir proteinin nasl izole edileceine, hangi yntemle ve ne derece saflatrlacana karar verirken gz nnde bulundurulan kriterler:
AMA; MATERYALN VE ALIILACAK
PROTENN TP VE MKTARI; LEMLERN SRES VE MALYET; ELDEK OLANAKLAR

LABORATUVAR ORTAMI

LABORATUVARDA KULLANDIIMIZ KMYASALLAR

Dnyada en az 65 milyon eit kimyasal bileik retiliyor ve deiik saflk derecelerinde piyasaya srlyor.... Kalitesine ve miktarna gre farkl fiatlara satlyor.

Kimyasallarn bazlar (zellikle ENZMLER) soutucularda (+4oC ve -20 veya -80oC derin dondurucularda) saklanmaldr.

LABORATUVAR ARA-GERELER

balonjoje

l kab

pipet

Mikropipetler

Hamilton rngalar

TERAZ

pH-metre

HAVAN

KARITIRICILI HOMOJENZATR (Waring Blender)

MLL HOMOJENZATR (ultra turrax)

PSTONLU HOMOJENZATR

BASIN HCRES

BALSTK HOMOJENZATR

ULTRASONKATR

FLTRASYON DZENEKLER

MEMBRANLI FLTRASYON

SANTRFJLER

Protein denatrasyonundan ve inaktivasyondan korunmak iin almann her aamasnda pH ve SICAKLIK kontrol altnda tutulmaldr!
Scakln olumsuz etkisi, ilemlerin SOUKTA (genelde 4oCda) gerekletirilmesiyle nlenir.

pH ise bu molekllerin fizikokimyasal gereksinimleri dorultusunda hazrlanm tampon zeltilerin kullanm ile istenen deerde tutulur.

Ortam pHsnn 7 ve 7ye yakn deerlerde olduu koulda en geni apta kullanlan tamponlar tris ve fosfat tamponlardr.

YONK KUVVET
Bir tamponda yer alan iyonlarn deriimi ve
yk de protein almalarnda nem tar.

ci = iyonun molar konsantrasyonu

zi = iyonun yk (iareti dikkate alnmaz)

TAMPON SEMNDE DKKAT EDLMES GEREKENLER:

alma pHs, Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olmas, yonik kuvvet ve scaklk etkisiyle pH deiimi, Kimyasal etkinlik, Biyolojik etkinlik, Dier bileenlerle etkileim, Biyolojik membranlarn geirgenlii, Toksisite, 280 nm ve altndaki dalga boylarnda absorbsiyon, Maliyet, znrlk

BYOLOJK MATERYALLER: MKROORGANZMALAR

HAYVANSAL RNEKLER

HAYVAN DOKU VE HCRE KLTRLER

BTKLER VE BTK DOKU KLTRLER

HOMOJEN VE HETEROJEN KARIIMLARI AYIRMA VE SAFLATIRMA YNTEMLER

K (OK) FAZLI AYIRMA YNTEMLER Yardmc bir faz oluturarak ayrma (EKSTRAKSYON, KROMATOGARF, ELEKTROFOREZ) Kimyasal reak. sonucu faz oluturma (KTRME)

TEK FAZLI AYIRMA YNTEMLER SANTRFJLEME FLTRASYON DALZ

Istma veya soutma ile faz oluturma (KRSTALZASYON, DESTLASYON, SBLMASYON, EVAPORASYON)

HOMOJENZASYON: allacak molekl grubunu ieren doku veya hcrelerin eper ve zar yaplarn paralama ilemi

Fiziksel ilemler Kimyasal ilemler Mekanik ilemler zclerin kullanlmas Ultrasonikasyon Enzimlerin kullanlmas Ozmotik ok Dondurma-zme

Mekanik lemler: ALETL HOMOJENZASYON

Mekanik lemler: OZMOTK OK

Mekanik lemler: DONDURMA-ZME

Souk-Scak-Souk-Scak.....

Kimyasal lemler: zclerin Kullanlmas

Organik zcler Deterjanlar, Bazik zeltilerle...

BYOLOJK MOLEKLLERN ZOLASYONU (EKSTRAKSYON) : MASERASYON

PERKOLASYON

SREKL EKSTRAKSYON (SOXHLET EKS.)

SIVI-SIVI EKSTRAKSYONU

Kimyasal lemler: Enzimlerin Kullanlmas

Lizozim, Tripsin, Proteinaz K, Zimoliyaz gibi enzimlerle...

eitli materyallere uygulanabilecek baz paralama yntemleri

Teknik Nazik Ozmotik ok Enzim uygulamas Deterjan uygulamas Havan veya pistonlu homojenizatr Dier aletlerle paralama Orta iddette Milli homojenizatrle par. Kum, alumina vb. ile ezme Sert Fransz basn hcresi
Ultrasonikasyon Balistik paralama

Materyal tipi

Eritrositler Bakteriler, mayalar Doku kltr hcreleri

Karacier vb yumuak dokular Kas vb. Dokular

Hayvansal ve bitkisel dokular Bitkisel dokular, bakteriler

Bitkisel dokular, bakteriler Hcre sspansiyonlar Hcre sspansiyonlar

Paralama (homojenizasyon) yntemleri uygulanarak doku veya hcrelerin eper ve zar yaplar yok edilir.
Ele geen ve allacak molekl grubunu ieren karma HOMOJENAT denir.

AYIRMA VE SAFLATIRMA zerinde allacak molekl grubunu homojenattaki dier molekllerden ayrmak ve saf ekilde elde etmek
Preparatif veya Analitik amal yaplabilir.

SZME (FLTRASYON)

Molekler biyolojide en ok kullanlan filtre edici materyaller:

Mslin (tlbent veya gazl bez) Filtre kad (bkz. MBKY kitab Ek 15, s. 324) Sinterli cam huni Membran filtreler (bkz. MBKY kitab Ek 16, s.
324)

Membran filtreler veya membranlar zgl por aplarna sahip polimer filmlerden oluur. Porlardan geemeyecek byklkteki partikller ve mikroorganizmalar iin fiziksel bir bariyer oluturur ve bunlar zarn yzeyinde tutarlar.

ULTRAFLTRASYON
Molekllerin boyut, biim ve/veya yklerine gre ayrlmasn salar.

Centricon tipi ultrafiltrasyon tp (vakumdan yararlanlr)

Kapan hcresi (basntan yararlanlr)

NMWC

Nominal Molecular Weight Cut-off

Membrana zg bir deerdir. Membrandan geemeyen bir molekln arlna e deerdir.

SANTRFJLEME

Santrifjler yardmyla yksek hzda dndrlerek merkezka kuvveti oluturulan bir alanda partikllerin davranna gre ayrm salayan teknik

Santrifjleme sonunda

st faz (sv faz) spernatant

Alt faz (kelti) pellet

Santrifj kuvveti

F = m x 2 x r
m = ken partikln ktlesi

= asal hz

r = partikln dnm eksenine uzakl

Relative Centrifugal Force

Santrifj hz ile ilgili bir ifade (g deeri)

RCF = 1.119 x

-5 10

2 rpm

xr

rpm = dnm says (devir/dakika) r = partikln dnm eksenine uzakl (cm)

Homojenattaki zar (membran) paralarn, paralanmam doku ve hcreleri uzaklatrmak amacyla uygulanan N AYIRMA ilemlerinden sonra ele geen svya HAM ZT ad verilir.