DNAnn zolasyonu ve Analizi

DNA
Genetik bilgiyi tayan ift sarmal molekldr. 5Clu eker, fosfat ve bazlar ieren nkleotidlerden oluur. Doadaki canllarn tmne yakn ksmnda genetik materyal DNAdr.

 DNA hcre ierisinde, *ekirdek, *Mitokondri ve *Kloroplastlarda bulunmaktadr.

DNAnn zellikleri,
Negatif ykldr, Suda znebilir, Alkolde znmez.

DNA ZOLASYON YNTEMLERNDE BRBRN ZLEYEN TEMEL AAMA BULUNMAKTADIR:

1- Hcrenin paralanmas ile yksek molekl arlkl DNAnn aa kmas, 2-Denatrasyon veya proteoliz ile DNAprotein kompleksinin ayrlmas ve DNAnn znr duruma getirilmesi, 3-DNAnn basit enzimatik ve/veya kimyasal yntemlerle proteinler, RNA ve dier makromolekllerden ayrlmas, ***DNAnn analizi

 Denatrasyon: ift zincirli DNA molekl yksek pH veya yksek scaklk etkisinde brakldnda sarmal yapsnda znmeler meydana gelir. Renatrasyon: Koullar tekrar normal duruma getirildiinde iki iplik sarmal yapy oluturmak zere birleir.Yani denatrasyon geri dnmldr.

*Enzimler(RNase) RNAy yok etmek iin, *Enzimler (Proteases) DNA moleklne bal olarak bulunan proteinleri yok etmek iin, *zopropanol ve etanol: Nkleik asitlerin ktrlmesinde, *Amonyum slfat ve sodyum slfat:Proteinlerin ktrlmesinde, *Etil asetat, Toluen, SDS membran yapsn bozmada, ***zole edilen DNA +4Cda uzun sre saklanabilir.

Kromozom DNAsnn izolasyonu

*Bakterilerden kromozom (genom) DNAs izolasyonu, *Mayalardan kromozom DNAs izolasyonu, *Memelilerden kromozom DNAs izolasyonu, *Bitkilerden kromozom DNAs izolasyonu Kromozom d DNAnn izolasyonu *Plazmid DNAs izolasyonu *Organel DNAs izolasyonu

Bakterilerden kromozom(genom) DNAs izolasyonu,

Organizma: E. coli , B. Subtilis Yntem : 1) LB(Luria Bertani) besiyerine tek koloniden ekim yaplr ve 150 devir/dakika hzda, 37Cde bir gece bekletilir. 2)Bakteri kltrnn 1.5 mlsi 10.000 rpm de 5 dakika santrifj edilir. 3)Spernatant atldktan sonra Tris EDTA (TE ph:8) tamponu iinde zndrlr. 4)zelti zerine Sodyum Dodesil Slfat (SDS) ve proteinaz K eklenir ve 37Cde 1 saat bekletilir (bu aamada hcreler paralanr). 5)zerine NaCI ile NaCI/CTAB (setil trimetil amonyum bromr) zeltileri eklenerek 65 Cde 10 dakika bekletilir.

6)Eit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek 10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir. 7)Spernatant alnarak zerine fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek 10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir. 8)Spernatant ayr bir tpe alnarak izopropanol eklenir ve DNA knceye alt-st edilerek kartrlr. (Bu aamada DNAnn iplikikler eklinde keldii gzlenir) 9)DNA, 15.000 rpmde 10 dakika santrifjlenir. 10)Pelletin zerine etanol eklenerek DNA ykanr ve alkol geri boaltlr. 11)Tpn az ak durumda oda scaklnda (10-15 dak.) ya da 60 Cde birka dakika bekletilerek alkol tamamen uurulur. 12)kelti Tris-EDTA (pH:8) iinde yavaa vurularak zndrlr.

Mayalardan kromozom DNAs izolasyonu

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) Organizma: Schizosaccharomyces pombe veya Sacchromyces cerevisiae Yntem: Maya kltr uygun besiyerine ekilir ve 30Cde 180 devir/dakika hzda 24-30 saat remeye braklr. Kltrdeki hcreler 10.000 rpmde 5 santrifjlenir. kelti su iinde zndrldkten sonra tplere blnr ve 10.000 rpmde, 5 santrifjlenir. Spernatant atlr ve ok az kalan st sv ile pellet pipetlenir. zerine gerekli tampon(A) ,kloroform,fenol ve asitle ykanm cam boncuk eklenir. Vorteksde 2 kartrldktan sonra TE buffer eklenir ve 14.000-15.000 rpmde 5 santrifjlenir. Spernatant yeni bir tpe alnp etanol eklenir ve kartrlr. 15.000 rpmde 52 santrifjlendikten sonra RNase eklenir ve 30Cde 5 bekletilir. Daha sonra sodyum asetat ve saf etanol eklenerek -20 Cde 1-3 saat bekletilir. 15.000 rpmde 10 santrifjlendikten sonra kelti TE veya distile su iinde zndrlr.

Memelilerden Kromozom DNAs izolasyonu,

Materyal: Kan Yntem 1)Kan rnekleri phtlamay nleyen EDTA ieren zel tplere alnr. 2)Uygun tampon eklendikten sonra 12.000 rpmde 1 santrifjlenir. 3)Spernatant atldktan sonra tekrar ayn tampon eklenerek 12.000 rpmde 1daha santrifjlenir. 4)kelti zerine sodyum asetat, SDS ve proteinaz K eklendikten sonra 55Cde 1 saat bekletilir. 5)Sre sonunda fenol/kloroform/izomil alkol eklenir ve 30 sn vorteklendikten sonra 12.000 rpmde 2 santrifjlenir. 6)Spernatant yeni tpe alndktan sonra etanol eklenir ve -20 Cde 15 bekletilir. 7)Daha sonra 12.000 rpmde 2 santrifjlenir ve spernatant atldktan sonra TE tamponu eklenir ve 55 Cde 10 bekletilir. 8)nce sodyum asetat daha sonra souk saf etanol eklenir ve 12.000 rpmde 1 santrifjlenir. 9)Spernatant uzaklatrlr ve alkol ile muamele edildikten sonra 12.000 rpmde 1 santrifjlenir. 10)Alkol dkldkten sonra vakumda 10 kadar kurutulur. 11)zelti TE iinde zndkten sonra 55 Cde 1 gece braklr.

 Materyal: Taze yaprak dokusu Yntem: 1)Materyalim miktarna gre 2- Mercaptaethanol / CTAB ve NaCI/CTAB ektrasyon tamponlar su banyosunda 65Cye kadar stlr. 2)Daha nce paralanarak toz haline getirilmi dokuya uygun miktarda 2Me/CTAB eklenerek 65 Cde 10-60 dak. tutulur. 3)Eit hacimde kloroform /izoamil alkol (24:1) eklenerek 10.000 rpmde 5 , 4 Cde santrifjlenir. 4)65 Cde stlm CTAB/NaCI zeltisi eklenir ve kartrlr. 5)3. aama tekrarlanr. 6)Tekrar CTAB ktrme tamponu eklenir ve eer kelti gzkr ise bir sonraki aamaya geilir eer gzkmyor ise 65 Cde 30 beklenir. 7)2700 rpmde 5 , 4 Cde santrifjleme yaplr. 8)Spernatant atldktan sonra, kelti yksek tuz ierikli TE tamponunda zndrlr. 9)Daha sonra izopropanol eklenerek 10.000 rpmde 15 da 4 Cde santrifjleme yaplr. 10)zelti etanol ile ykanr, TE iinde zndrlr ve +4de saklanr.

Bitkilerden Kromozom DNAs izolasyonu,

Kromozom d DNAnn izolasyonu

Kromozom d DNA olarak bakterilerde plazmid ad verilen, sitoplazmada genom DNAsndan bamsz replikasyon yapabilen, ift zincirli, genellikle halkasal(ender olarak dorusal) olan DNA moleklleri bulunmaktadr. karyotlarda ise nukleus DNAsndan bamsz kaltm gsteren organel DNAlarna mitokondri (mtDNA) ve kloroplastlarda (ctDNA) rastlanmaktadr. Mitokondri ve Kloroplast DNAs, ift zincirli halkasal bir molekl olamakla birlikte boyutu organizmalara gre deimektedir.

Plazmid DNAs zolasyonu

Plazmitlerin rekombinant DNA teknolojisi almalarnda tayc DNA(vektr) olarak geni apta kullanlmas plazmid izolasyon yntemlerinin gelimesine yol amtr.

1)E. coli tad plazmitte bulunan antibiyotie diren geninin eidine gre, o antibiyotii ieren besiyerinde 15 devir/dakika hzda 37Cde 1 gece boyunca retilir. 2)Bir gecelik kltrler, 7.000 devir/dakika da 10 santrifjlenir ve lizis tamponunda sspansiyon haline getirilir. 3)5 oda scaklnda bekletildikten sonra alkali SDS ile muamele edilir ve yeniden 5 oda scaklnda tutularak hcrelerin paralanmas ve genomik DNAnn denaturasyonu salanr 4)4 Cde soutulmu potasyum asetatla muamele edilerek 5 buz iinde bekletilir 5)13.000 rpmde santrifj edildikten spernatant ksmna kalan plazmid fraksiyonuna absol etanol eklenir. 6)13.000 rpmde 20 Cde tekrar sabtrifj edilerek plazmid DNAs ktrlr. 7)TE tamponunda zdrldkten sonra RNase A eklenerek 37 Cde 1 saat bekletilir. 8)Daha sonra fenol/kloroform/izoamil alkol eklenir ve 13.000 rpmde 5 oda scaklnda santrifjleme yaplr. 9)Spernatant ayr bir tpe alnarak potasyum asetat eklenir ve -20 Cde 1 saat bekletilir. 10)20.000 rpmde 20 4 Cde santrifjleme sonucu elde edilen kelti uygun miktardaki TE iinde zlr.

Organel DNAs izolasyonu,

Organel DNAs izolasyonlarnda en nemli aama ncelikle organelin paralanmam ekilde ayrlmas olduundan dolay,bu olay 2 aamada gerekletirilir. ***Organelin izolasyonu ***Organel DNAsnn izolasyonu

Mitokondriyal DNAnn izolasyonu

Mitokondri zolasyonu Materyal: Somatik hibritlerin eitli bitki dokular Yntem: 1)Taze dokular (yaprak, iek vb.) buzda soutulmu uygun tampon iinde paralanr yada Patates tuberi elektrikli meyve suyu skacandan geirilir ve eit hacimde uygun tampon eklenir. 2)Naylon bir membrandan filtre edildikten sonra byk hcre paralarnn uzaklatrlmas iin 500gde 10 dakika santrifj edilir. 3)Plastitlerin uzaklamas iin spernatant 2600 gde 15 da 2 kez ve bir kez de 10 santrifj edilir. 4)Spernatant alnr ve mitokondrileri ktrmek iin 14.500 gde 15 santrifj edilir. 5)Lizis olmu nkleus paralarn ieren st sv atlr, mitokondrileri ieren kelti buzda soutulmu uygun tampon iinde zndrlr. ***Mitokondri keltisi sv azotta dondurulduktan sonra -80C saklanr yada dorudan DNA izolasyonu yaplabilir.

 Mitokondri DNAs izolasyonu, 1)Mitokondri keltisi lizis tampunu ierisinde zndrldkten sonra Proteinaz K eklenerek 37Cde 1 saat bekletilir. 2)Amonyum asetat ve TE ile doyurulmu fenol/kloroform eklenerek 12.000rpmde 5 santrifj edilir. 3)Spernatant ksm ayr bir tpe alnarak absol etanol alnarak eklenerek -20 Cde bir gece bekletilir. 4)18.000gde 20 santrifjlemeden sonra kelti distile su iinde zndrlr.

DNAnn Analizi
Nkleik asitlerin nanogram veya mikrogram dzeyindeki miktarlarnn belirlenmesinde absorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik yntemler kullanlr Ayrca nkleik asitlerin dorudan grntlenmesinde zgn dizilerde kesim yapan restriksiyon endonkleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluan farkl boyutlardaki DNA paralarnn saptanmasnda elektroforetik yntemler kullanlr.

 Kk DNA fragmentleri iin yksek, byk DNA fragmentleri iin dk agaroz konsantrasyonu kullanlarak DNAnn jelde en uygun ekilde yrmesi salanr. zole edilen DNA genomik DNA ise keskin bir bant eklinde (aa ve yukar ksmna dalan az bir ekilde dalan)grntlenirken,plazmid DNA snn genelde farkl biimi gzlenir(sebep,izolasyon srasnda krlmalardr).

DNAnn enzimatik kesimi

DNAnn enzimatik kesimi restriksiyon endonklezlarla yaplr. DNAda zel nkleotid dizilerini tanyan ve DNAnn her iki ipliini kesen enzimlerdir. Kesim sonucunda kt veya yapkan ulu DNA fragmentleri oluur. Ayn DNA dizisini tanyp kesebilen farkl R.E. vardr ve bunlar izoizomer olarak adlandrlrlar. zellikle genom kitaplnn kurulmasnda veya istenilen boyutta DNA fragmentlerini elde etmek amacyla kullanlr.

 Star aktivitesi: R.Enin uygun olmayan koullarda zel kesim dizilerine benzer dizilerde kesim yapmalar sonucunda istenmeyen fragmentlerinin olumasdr. Star aktivitesini arttran ve inhibe eden koullar bulunmaktadr.