Mtodos Cromatogrficos

Definiciones Bsicas

Que es una cromatografa

Definiciones Bsicas

Cromatografa
Es

un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (la fase mvil) se mueve en una direccin determinada. un grfico u otra representacin de la respuesta del detector, de la concentracin del analito en el efluente ode otra magnitud utilizada para medir una propiedad del efluente frente al tiempo

Cromatograma
Es

Definiciones Bsicas

Cromatgrafo
Sistema

instrumental para llevar a cabo la separacin cromatogrfica

Fase Estacionaria (Lecho cromatogrfico o Sorbente)

Una

de las dos fases que forman un sistema cromatogrfico, puede ser un slido, un gel o un lquido. un fluido que penetra a travs o a lo largo del lecho estacionario en un direccin determinada, puede ser un lquido o un gas

Fase Mvil
Es

Definiciones Bsicas

Cromatografa en columna

Es una tcnica de separacin en la que el lecho estacionario esta dentro de un tubo

Cromatografa en plano Es una tcnica de separacin en la que la fase estacionaria es un plano o est sobre un plano. Este plano puede ser un papel (cromatografa en papel) o bien una capa de partculas slidas que recubren un soporte, como por ejemplo una placa de vidrio (Cromatografa en placa fina, TLC)

Definiciones Bsicas

Cromatografa de gases (GC)

Es

una tcnica de separacin en la que la fase movil es un gas, la cromatografa de gases se lleva a cabo siempre en columna.

Cromatografa de lquidos
Es

una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un lquido. La cromatografa de lquidos en la que se utilizan presiones de entrada relativamente altas, se suele denominar HPLC

Mecanismos cromatogrficos de Separacin

Adsorcin

La separacin se basa en las distintas afinidades de adsorcin de los componentes de la muestra hacia la superficie de un slido activo (fase estacionaria). La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (GC) o en las diferencias de solubilidad de los componentes en la fase mvil y en la fase estacionaria (cromatografa de lquidos) La separacin se basa en la capacidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra

Reparto

Intercambio inico

Mecanismos cromatogrficos de Separacin

Exclusin
La

separacin se basa en la diferencia de tamao de las molculas. utilizado en cromatografa Lquida en el cual la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria utilizado en cromatografa Lquida en el cual la fase estacionaria es ms polar que la fase mvil

Fase Inversa
Procedimiento

Fase Normal
Procedimiento

Mecanismos cromatogrficos de Separacin

Elucin Isocrtica
Procedimiento

en el cual la composicin de la fase mvil permanece constante durante el proceso de elucin en el cual la composicin de la fase mvil cambia continuamente o por pasos, durante el proceso de elucin

Elucin con gradiente

Procedimiento

Migracin de los solutos

Para un soluto A, el equilibrio de distribucin se describe por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia desde la fase mvil a estacionaria La constante de equilibrio para este proceso se denomina constante de distribucin

Amovil Aestacionar ia
Concentracin Molar del soluto en la fase estacionaria

C K C

S
Concentracin Molar del soluto en la fase mvil

La cromatografa en la que es aplicable la constante de equilibrio se denomina Cromatografa lineal y, en este caso los picos son Gaussianos y los tiempos de retencin son independientes de la cantidad del analito inyectado

modelo de cromatagrafia tomando encuenta solo la contante de reparto

t1
Si K= 1/2 Fase Movil Fase Estacionaria t4 22 44 22 0 0 t6 7 4 29 29 15 0 0 0 11 100 0 66 33 t2 0 0 0 33 t5 22 22 44 0

t3
66

11

15

Efecto de las velocidades de migracin y del ensanchamiento de Bandas sobre la resolucin de picos cromatograficos

Cromatograma caracteristico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeo de la izquierda representa una especie que no se retiene en la columna, y de esta forma alcanza el detector casi inmediatamente despus del inicio de la elucin. Por tanto, su tiempo de retencin tM, es aproximadamente igual al tiempo que emplea una molcula de la fase movil para pasar a travs de la columna.

Teora de la separacin
tr
Alturo de pico

fin

inicio
1.30 1.40de retencin1.50 Tiempo 1.60 1.70

Base

Tiempo de retencin tR Factor de capacidad k Factor de selectividad Resolucin R

Tiempo de retencin

t1

El tiempo de retencin tR, Es el tiempo que toma un componente de la muestra en alcanzar el detector luego de la inyeccin. Un componente que no es retenido por la columna viajar con el mismo flujo que el eluente, alcanzando el detector en el t0, conocido como tiempo muerto o frente del solvente
0

t3
t2

t0
5 10

Factor de capacidad
Cuando se desarrolla un mtodo es importante calcular el Factor de Capacidad, el cual es independiente de las dimensiones de la columna, flujo del solvente y tamao de la partcula.

k
k entrega importante informacin acerca de la calidad de la separacin. Cuando k es pequea, la resolucin es pobre. Si k es muy grande, el tiempo de anlisis puede ser demasiado grande o lo ganado en resolucin puede ser cancelado por ensanchamiento de pico. Idealmente k debe ser entre 2 y 10, pero en la prctica , 1<k< 20, es satisfactorio.

k = (tr t0)/ t0
k puede variar entre 0 e infinito. k en fase reversa disminuye al aumentar el solvente orgnico. k en fase normal disminuye al aumentar el solvente polar

Factor de selectividad
El factor de selectividad de una columna para dos especies 1 y 2 se define como.

t1

= k2 / k1 = (tr2 - t0) / (tr1 t0)

Donde K2 y K1 son las constantes de distribucin
Por definicin, es siempre mayor que 1 es una medida de la selectividad de la columna y en la prctica debe ser entre 1.1 y 1.5

t3
t2 t0
0 5 10

Resolucin
Resolucin R es el grado de separacin entre dos componentes de una muestra.

t1 t2 t0
9.0 10.0

R = ( tr2 tr1) / 0.5 (w1 + w2)

R puede ser calculado desde un cromatograma midiendo los Tiempos de retencin y el ancho de los picos en unidades de tiempo. R debe ser mayor que 1.

w1w2

11.0

12.0

13.0

14.0

15.0

16.0

17.0

R= 1.5 separacin esencialmente completa R= 1.0 el compuesto 1 tiene aprox un 4% del compuesto 2 R= 0.75 separacin incompleta

Eficiencia de columna
La eficiencia de una columna es definida por dos parmetros cuantitativos. Altura del Plato H Nmeros de Platos N Se relacionan por la ecuacin N = L / H Donde L es la longitud de la columna (cm). N y H comnmente son relacionados con la eficacia de la columna. N = 16 (tn/w)2

La eficacia de una columna aumenta cuanto mayor es el numero de platos tericos y menor es la altura de los platos terico.

Ensanchamiento de Banda
Procesos de ensanchamiento de banda intracolumnares y extracolumnares. Si se inyecta 20 ul, estos a medida que avanzan en el sistema cromatograficos sufre sucesivas diluciones. Se deduce que a mayor tiempo de retencin mayor ancho de banda w = tr ((N)1/2/4) Ancho de banda

1.30

1.40

1.50

1.60

1.70

Difusin de Eddy
El ensanchamiento de banda en el eluente es debido a las numerosas caminos por la cuales una molcula puede viajar a travs de la columna. Las longitudes de estas vas pueden ser significativamente diferentes conduciendo a tiempos de residencias variables para molculas de la misma especie. Este efecto, conocido como Difusin de Eddy, da cuenta del trmino A de la ecuacin de Van Deemter. Es dependiente del dimetro de la partcula, del dimetro de la columna y el flujo del eluente.

Difusin Longitudinal
La difusin longitudinal causa el ensanchamiento de banda debido a la difusin del analito desde el centro concentrado hacia zonas ms diludas alrededor del centro. La difusin longitudinal da cuenta del trmino B de la ecuacin de Van Deemter y es inversamente proporcional al flujo del eluente.

Efecto de transferencia de masas

El efecto de transferencia de masa se produce por: las diferentes velocidades del eluyente en un mismo sistema. La difusin de molculas de una muestra a travez de la inclusin de molculas de fase mvil dentro de los poros de la fase estacionaria El ensanchamiento por transferencia de masa se debe a la difusin que tiende a ocurrir perpendicularmente al flujo El efecto de transferencia de masas da cuenta del trmino C en la ecuacin de Van Deemter.

Transferencia de masa en la fase mvil

Transferencia de masa en la fase estacionaria

Ensanchamiento de Banda
A medida que una banda se mueve fuera de la columna, Hay ms tiempo para que ocurra la dispersin y con ello el ancho de la banda se incrementa. Por lo tanto el ensanchamiento est directamente relacionada al tiempo de residencia en la columna y esta inversamente relacionada al flujo del eluente. Las contribuciones de algunos factores al ensanchamiento de banda estn relacionados a la altura del plato H por la ecuacin de Van Deemter.
H = Altura de plato (terico) A = Trmino de difusin de EDDY B = Trmino de difusin longitudinal C = Trmino de Transferencia de masa u = Velocidad del eluente

H cm

Curva compuesta

Hmin
A B

H = A + B / u + Cu

OPT

Flujo cm / s