Ulises Ordaz robles

CROMATOGRAFA.

OBJETIVOS

El alumno comprender que las propiedades fsicas de las sustancias dependen del tipo de enlace y sus fuerzas intermoleculares El alumno conocer y comprender los diferentes tipos de enlaces qumicos y sea capaz de determinar su influencia sobre las propiedades fsicas de las sustancias al realizar diferentes ensayos en el laboratorio El alumno conocer las diferentes fuerzas intermoleculares que existen, y determinara la influencia que estas tienen sobre las propiedades de las sustancias experimentalmente

QU ES?
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil.

En 1906 Tswett defini la cromatografa como: Mtodo en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente. Recientemente la I.U.P.A.C define la cromatografa de forma ms amplia como: Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es mvil. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido soportado en un slido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una pelcula, etc...

ANTECEDENTES E HISTORIA DE LA CROMATOGRAFIA

La cromatografa se utiliza por primera vez en un laboratorio en 1850 cuando el qumico F. F. Runge, que trabajaba con tintas, descubri que los cationes orgnicos se separaban por migracin cuando se depositaba una disolucin que los contena sobre un material poroso, como papel.

En 1906 el botnico ruso Miguel Tswett (1872-1913) en 1906 y eligi el trmino cromatografa procedente de las palabras griegas khromatos(color) y graphos (escrito) ya que utiliz el trmino cromatografa para describir la separacin de pigmentos vegetales en distintas zonas coloreadas.. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el campo de la qumica orgnica e inorgnica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los mtodos cromatogrficos adquieren extensin mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elucin y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.
Al mismo tiempo la cromatografa se aplicaba en el campo de la bioqumica, y as Martin consigue separar algunos aminocidos acetilados.

FASES EN LA CROMATOGRAFIA
Las separaciones cromatogrficas se consiguen mediante la distribucin de los componentes de una mezcla entre la fase fija y la fase mvil. La separacin entre dos sustancias empieza cuando una es retenida ms fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms rpidamente en la fase mvil. las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin que se dan entre las dos fases y que pueden ser :
1.-La adsorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial. 2.- La absorcin, que es la retencin de una especie qumica por parte de una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera,absorcin pura, o a reaccionar qumicamente con la misma, absorcin con reaccin qumica, considerando ambas como un fenmeno msico y no superficial.

CLASIFICACION DE LAS TCNICAS CROMATOGRAFICAS

1 De acuerdo con la forma del lecho cromatogrfico: Cromatografa plana
se utiliza para medir el grado de pureza de alguna muestra, la identificacin de alguna sustancia conocida en una mezcla por comparacin y para obtener la medida semi cuantitativa de alguna sustancia en alguna mezcla.

Se realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina o en capa delgada porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rgido.
En este tipo de cromatografa la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte, la dificultad que presentaba el mtodo era el crear una capa homognea, sin ningn tipo de rugosidad. La cromatografa en capa fina tuvo valor limitado hasta que Stahl estandariz el mtodo para elaborar capas finas por mtodos mecnicos.

 Cromatografa en columna Este tipo de cromatografa sirve para la purificacin de substancias contaminadas con alguna otra sustancia F.M. lquida, F.E. slida: columnas de varios mm de dimetro y varios cm de F.M. gas, F.E. slida: columnas de unos 5 mm de dimetro y 1-20 m de F.M. gas, F.E. lquida: columnas capilares, con menor dimetro y 30-100 m (incluso ms) de longitud. longitud. longitud.

Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos momentos a lo largo de la elucin: 1.- Muestra depositada sobre el lecho cromatogrfico 2.- La muestra penetra en el lecho 3.- Se aade fase mvil 4.- Comienza la separacin de los componentes de la muestra 7.- Eluye el primer componente 9.- Eluye el segundo componente

2 DE ACUERDO CON EL ESTADO FSICO DE LAS FASES

fase mvil
lquida cromatografa lquida Cromatografa lquido-slido Cromatografa lquido-lquido gaseosa cromatografa de gases Cromatografa gas-slido Cromatografa gas-lquido

slida fase estacionaria lquida

CROMATOGRAFA DE GASES Con fase mvil gaseosa. Cromatografa gas-lquido Cromatografa gas-slido

Cromatografa lquida Con fase mvil lquida. Cromatografa lquido-lquido Cromatografa lquido-slido HPLC Cromatografa lquida de alta presin o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase estacionaria muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta). [HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High Performance Liquid Chromatography]

3 DE ACUERDO CON EL MECANISMO DE SEPARACIN

STA ES UNA CLASIFICACIN CONCEPTUAL; EN LA PRCTICA, EL MECANISMO QUE RIGE LA SEPARACIN PUEDE SER MIXTO
Cromatografa de adsorcin Diferente afinidad de adsorcin de los componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo. La adsorcin es la capacidad de las superficies para fijar molculas. La F.E. es siempre slida. Ejemplos: almina, gel de slice, carbn activo, fosfato clcico, hidroxiapatito..

Cromatografa de reparto
Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografa de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases mvil y estacionaria (caso de la cromatografa lquida). Ejemplos: en cromatografa plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte slido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de slice, celulosa en polvo...

Cromatografa de intercambio inico Diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Qu significa intercambio de iones? La F.E. posee carga elctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga opuesta. Intercambio aninico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la muestra (de ah la palabra intercambio). Intercambio catinico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la muestra. Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. slida): intercambiadores catinicos carboximetilo (CM) sulfopropilo (SP) fosforilo sulfonato carboxilato intercambiadores aninicos dietilaminoetilo (DEAE) dietil-(2 hidroxipropil)aminoetilo polietilenimina

La F.E. suele llamarse resina (de intercambio inico.

Cromatografa de exclusin Tambin se llama de exclusin molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma o carga entre las molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamao. En este caso, se la llama tambin cromatografa de exclusin por tamao, de filtracin en gel, de permeacin en gel o de tamiz molecular. Ejemplos: para la separacin de protenas y polisacridos se usan como F.E. polmeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los ms comunes son dextranos (marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos materiales, en forma de pequeas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un retculo o matriz tridimensional, con poros de tamao definido.

Aplicaciones: Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas cromatogrficas). Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la movilidad en la columna de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea para determinar masas moleculares. Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra proteica (p.ej., las sales inorgnicas en un desalado de la muestra, eliminacin del exceso de reactivos tras tratar una protena en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos,...). El resultado es similar a una dilisis, pero ms rpido. (ms aplicaciones en Freifelder, 1991)

Cromatografa de afinidad Variedad particular de cromatografa en la que la separacin se basa en la especificidad biolgica singular de interaccin entre un componente de la muestra y otra molcula unida a la F.E.; los ejemplos ms comunes son las interacciones enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo y ligando-receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plstico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo, antgeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacridos, lectinas (protenas con afinidad por oligosacridos)...

4 ALGUNAS TCNICAS ESPECIALES

Cromatografas de fase normal y de fase invertida Fase normal: cuando la F.E. es ms polar que la F.M. Fase invertida: cuando es ms polar la F.M. Anlisis isocrtico La composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo del proceso de elucin. Elucin con gradiente La composicin de la fase mvil se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elucin (respectivamente, gradiente continuo y gradiente escalonado o en etapas). Cromatografa bidimensional Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas adicionales de separacin bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la cromatografa plana, en direccin perpendicular.

ETAPAS EN LA REALIZACIN DE UNA CROMATOGRAFA

Cromatografa en columna Cromatografa plana (papel o capa fina)

1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.

1.1.- Equilibrado de la columna. 2.- Aplicacin de la muestra. 3.- Elucin: a) Lavado de componentes no retenidos. b) Liberacin, desplazamiento o elucin propiamente dicha de los componentes retenidos.

1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.

2.- Aplicacin de la muestra. Secado. 3.- Desarrollo de la cromatografa.

4.- Recoleccin de fracciones o anlisis del efluente en continuo.

5.- Anlisis, cuantificacin o revelado. 6.- Regeneracin de la fase estacionaria.

4.- Secado de la placa. 5.- Revelado y cuantificacin en su caso.

RECOGIDA DEL EFLUENTE

El efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeas porciones o fracciones, comnmente con la ayuda de un dispositivo mecnico llamado colector de fracciones. Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un nmero determinado de gotas o un cierto volumen. A continuacin el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una clula fotoelctrica; cada gota interrumpe el haz de luz y as se cuenta.

DETECCIN

Los componentes de la muestra separados se detectan en el efluente: Mediante su anlisis en continuo. Por ejemplo:
midiendo absorbancia a 280 nm para protenas

midiendo absorbancia a 260 nm para cidos nucleicos

midiendo radiactividad

O bien mediante el anlisis de las fracciones una vez recogidas. cualquier tipo de anlisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimtico, ensayo biolgico...)