TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

VECTORES

Molculas de DNA que pueden ser utilizadas como vehculo para conducir otras secuencias de DNA: plasmidios, bacterifagos, cosmidios, entre otros.

DNA
plasmids

DNA fragments + enzymes

recombinant plasmids

host cells containing recombinant plasmids

TIPOS DE VECTORES
1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA

2) VECTORES DE EXPRESION- Expresin de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresin gnica

VECTORES DE CLONADO
PLASMIDOS: Lmite clonado 0.1- 10 Kb FAGOS: Derivados del bacterifago Lambda, insertos 8-25 Kb COSMIDOS: Combinacin fago l y plsmido, insertos 35 y 45 kb. YAC (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plsmido F, 75-300 Kb Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb

I. PLASMIDIOS:
Molculas circulares de DNA extracromosmicos.

Se autorreplican.
Se encuentran en bacterias y levaduras. Algunos codifica resistencia a antibiticos, a metales, producen toxinas, entre otros. Reciben en promedio insertos de 5 kb.

Caractersticas generales de los plsmidos como vectores de clonado: Sitios de restriccin nicos

Marcadores genticos

Orgen de replicacin

CONDICIONES PARA SER UTILIZADO COMO VECTOR:

Tamao pequeo de 3 kb. Carecer del gen mob.

Exprese marcadores fenotpicos o de seleccin.

Secuencias de DNA que pueden ser sustituidas por DNA exgeno.

Llevar sitios de policlonaje

(polilinker).

TIPOS DE PLSMIDOS:
a. P. Conjugativos: Pueden transferirse de una clula a otra. Ejem: - Plsmidos F: K-12 - P. parecidos a F : Poseen resistencia a frmacos. Ejm: R 100. b. P. Vectores: - Poseen sitios simple de corte por ER. - Utilizados para un amplio rango de huspedes. Ejm: pBR 322.

c. P. Replicativos: - Plsmidos naturales. - Tienen baja capacidad de clonamiento. Ejm: pRK 290. d. P. Movilizables: Se trasladan utilizando el aparato conjugativo de otros plsmidos. e. P. Conjugativos ayudadores: ayudan a otros plsmidos. Ejm: RP1, RP2, RP4

III. BACTERIOFAGOS O

FAGOS

Entre ellos el fago Lambda . DNA de doble cadena, lineal. Tamao de 48.5 kb.

Recibe tamaos de insertos de

8 a 25 kb. Poseen sitios de reconocimiento donde se inserta el DNA exgeno. El empaquetamiento se realiza

in vitro.
Fago + DNA forneo

OTROS BACTERIOFAGOS:
o Bacterifago M13. su replicacin no produce lisis a la bacteria. Inconveniente que slo permiten la secuenciacin en una nica direccin.

IIII. COSMIDIOS. Plasmidio + secuencia cos del Fago = COSMIDO Tamao de 5 kb. Creados para clonar fragmentos largos de DNA. Recibe tamao de insertos entre 35 - 45 kb. Se mantiene como plsmido en E. coli

IV. VECTORES DE ULTIMA

GENERACIN.
Llevan insertos grandes de DNA de un organismo ( > 50 kb).

Entre ellas:
Cromosomas artificiales de levaduras ( YAC)

Cromosomas artificiales de bacterias (BAC)

Cromosomas artificiales de P1 (PACs), Derivados del Fago PI (insertos > 350 kb). Puede producir deleciones en el DNA exgeno.

YACs

Son vectores de DNA lineares que contienen los elementos esenciales de los cromosomas de la levadura.

Muy estable (se replica como un cromosoma)

Permite el clonado de grandes molculas de ADN

Los BACs se han convertido en una herramienta bsica para hacer mapas fsicos, clonamiento posicional y secuenciamiento Genmico.

FRACCIONAMIENTO DE LOS CIDOS NUCLEICOS

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN (ER)

Llamadas endodesoxiribonucleasas (ENZIMAS DE

RESTRICCIN).
Reconocen y cortan secuencias especficas en el DNA (4 a 8 pb).

Se encuentra en Eubacterias y arqueobacterias.

Se nombra de acuerdo a la especie de donde proviene y n romano para distinguir enzimas diferentes.

Enzimas de restriccin

APLICACIONES: 1. Anlisis molecular y estructura del genoma. 2. Manifestaciones fenotpicas o defectos genticos.

3. Evidencia de degradacin celular.

4. Taxonoma. Relaciones filogenticos

Enzimas de restriccin se clasifican en tres clases, pero la clase II es la que se utiliza en Biologa molecular. CLASE II: - Reconocen y rompen el DNA en secuencias especficas.

- Expresados por dos genes diferentes como dos enzimas separadas. a. Las ER clase II: Cortan ambas tiras del DNA. Requiere de iones de Mg. b. Metiltransferasa clase II: produce modificacin del DNA en forma independiente.

ACTIVIDAD DE LAS ER DE LA CLASE II: UNIDAD DE ENZIMA: cantidad de enzima que digiere 1 ug de DNA en 1 hora a 37 C. PARMETROS DE REACCIN: Temperatura (el ptimo corresponde a la T del organismo), pH y fuerza inica. ESPECIFICIDAD DE LAS ER DE LA CLASE II. 1. Reconocimiento de la secuencia. 2. Posicin del sitio de corte. 3. Influencia de la metilacin.

Otros factores:
Contenido de Guanina/Citosina y distribucin de las bases. Tamao del DNA y secuencia de corte. Longitud y composicin de las bases. Posicin de los sitios de corte. Estructura terciaria del DNA. Modificacin del DNA y ataque por enzimas.

RECONOCIMIENTO DE LA SECUENCIA.
PALINDROMO: secuencia de caracteres que se lee lo mismo de derecha a izquierda y al contrario.
Secuencias palindrmicas: secuencias del DNA con un eje de simetra repetitivo: Ejm: Eco RI CORTE ESCALONADO 5 .............G AA T T C.........3

Y EXTREMOS COHESIVOS 3 ........... C T T A A G........5

corte Hpa I CON EXTREMOS ROMOS 5 .............GTT AA C ..........3

3 ............. CAA TTG ......5

Los fragmentos de DNA producidos por corte con una misma enzima de restriccin pueden ser ligados para formar molculas de DNA recombinante.

FIN