PRECIPITAO DE PROTENAS

INTRODUO

Uso: purificao de protenas de diferentes fontes Precipitados: agregados proticos de molculas de diferentes tamanhos; Precipitao: operao na qual uma perturbao, qumica ou fsica, em uma soluo, promove a formao de partculas insolveis; Remoo do precipitado: separao slido-lquido; Tradicionalmente usado tambm como etapa de concentrao; Etapa preliminar em diversos procedimentos de purificao; Pode se empregada como etapa nica;

Vantagens:

Facilidade de operao Equipamentos relativamente simples Facilidade de ampliao de escala Grande nmero de agentes precipitantes (sendo muitos de baixo custo ou usados em concentraes pequenas)

As tcnicas de precipitao basicamente em dois grupos:

se

dividem

Reduo da solubilidade da molcula alvo pela modificao da soluo: Adio de sais (sulfato de amnio) em altas concentraes, de solventes orgnicos (etanol, ter e acetona) e de polmeros noinicos (polietilenoglicol). Reduo da solubilidade por alteraes da molcula alvo: Mudana da carga das protenas (adio de cidos e bases), uso de precipitantes aninicos ou catinicos.

Constituio e estrutura das PROTENAS

Constituio Aminocidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as protenas. Os 20 aa das protenas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o carter cido ou bsico do aa em soluo. Estrutura (quatro nveis) : Estrutura primria: refere-se sequncia dos aminocidos na cadeia linear peptdica. Estrutura secundria: refere-se ao grau de ordenao espacial da cadeia polipeptdica. So estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Estrutura terciria: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundria. Envolve a otimizao de vrias interaes (hidrofbicas, eletrostticas e de van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios grupos na estrutura da protena.

As estruturas secundria e terciria conferem protena a sua estrutura tridimensional.

Estrutura quaternria: envolve a associao de subunidades tercirias de protenas. Para sua estabilizao concorrem ligaes inicas, pontes de hidrognio, foras de van der Waals, pontes bissulfeto e interaes hidrofbicas.

Representao esquemtica das estruturas das protenas

Estrutura primria Estrutura secundria Estrutura terciria Estrutura quaternria

Solubilidade de Protenas
Determinam a solubilidade Regies Hidrofbicas (Apolares)

Regies Hidroflicas (Polares)

Alm dos aa, ons ferro e cobre, oligossacardeos e lipdeos conferem diferentes solubilidades s protenas.

Princpios de Solubilidade

Solubilidade: resultado global das interaes atrativas e repulsivas entre molculas do solvente e do soluto; favorecida quando h interaes repulsivas entre molculas de soluto e atrativas entre molculas do soluto e do solvente; Interaes entre soluto e solvente so no covalentes => interaes eletrostticas e foras de Van der Waals; Interaes eletrostticas: base da solubilidade de molculas polares neutras e com cargas em solventes polares;

pH: grande influncia => altera o grau de dissociao dos grupamentos;

Carga total zero leva a um aumento da agregao devido menor repulso.

perfis de solubilidade em diferentes valores de pH O ponto de solubilidade mnima igual ou prximo ao ponto isoeltrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a protena possui carga global igual a zero.

pH e distribuio de cargas:

+ + pI

- -

De modo geral, o solvente aquoso, e, alterandose as propriedades do meio por mudanas na fora inica e no pH, por adio de solventes orgnicos miscveis e polmeros orgnicos, alterase a solubilidade das protenas.

Desnaturao X Precipitao

A desnaturao compreende a destruio da estrutura terciria de uma molcula de protena e a formao de cadeias polipeptdicas ao acaso. - as variveis pH, temperatura e solventes orgnicos, dependendo dos valores, causam desnaturao das protenas. A precipitao compreende a modificao da estrutura tridimensional da molcula de protena. - as mesmas variveis, dependendo dos valores, causam precipitao das protenas.

A precipitao deve permitir que a conformao adequada da protena seja recuperada, para que esta possa exercer sua funo bioqumica aps o processo.

PRECIPITAO POR SAIS

Neutralizao das cargas superficiais reduo da camada de hidratao => agregao dos resduos hidrofbicos

com

Salting-out: adio de sais que promovem o aprisionamento de molculas de gua, que tornam-se escassas, e o consequente consumo das molculas de gua nas regies hidrofbicas. Estas, expostas, se interagem e se agregam.

Regio Hidrofbica (Apolar)

Regies Hidroflicas (Polares)

Sais mais adequados so aqueles que apresentam elevada solubilidade. Os mais usados so:

citrato de sdio sulfato de sdio sulfato de amnio

Salting-in: a reduo na concentrao de sais induz interaes inicas e agregao entre molculas de protena.

Globulinas se precipitam sob fora inica baixa

Mtodo mais comumente usado para separao de protenas o da adio de sais neutros (salting out)

Esquema explicativo da precipitao por salting-in.

Primeira descrio quantitativa do salting out foi feita por Cohn, em 1925: log S = - KS ( I )

Onde: S = solubilidade da protena (mol/L) I = fora inica do meio (mol/L) = constante que representa a solubilidade da protena quando I = 0 (mol/L) KS = constante de salting out
Misturas de protenas no obedecem equao!

PRECIPITAO POR SOLVENTES

A solubilidade das protenas varia com a distribuio dos resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da molcula;
lcoois de cadeia inferior, acetona, teres e outros so usados como precipitantes desde incio do sculo XIX; Aplicao clssica: fracionamento das protenas do plasma sanguneo por etanol frio (Mtodo de Cohn)

MECANISMO

Principal efeito: da constante dieltrica do meio

+ + + + -+ + ++ + + - + Regio Hidrofbica Solvente Orgnico

Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre superfcies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgnico.

SOLVENTES

Devem ser miscveis em gua, no reagir diretamente com as molculas e ser bons precipitantes; Mais usados: metanol, etanol e acetona; Outros: n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e outros lcoois, teres e cetonas;

VARIVEIS QUE AFETAM O PROCESSO

Temperatura: 20 30 C estimulam a xxxxxxxxxxxxxxxxxdesnaturao < 0 C pode garantir que xxxxxxxxxxxno haja desnaturao Adio do solvente temperatura => deve ser lenta e sob refrigerao

Concentrao de sais: concentraes dificultam interaes eletrostticas => dificuldade de precipitao => % solvente pH: prximo ao pI favorece a precipitao

PRECIPITAO FRACIONADA

Meios a serem purificados, em geral, constituem misturas Precipitao fracionada corresponde precipitao em duas ou mais etapas Na primeira removem-se protenas indesejveis menos solveis e, nas seguintes, precipitam-se uma ou mais molculas-alvo Em um estgio: til como tcnica de concentrao Fracionada: aplicao industrial para purificao; Na precipitao fracionada em geral varia-se a concentrao do agente precipitante, mas tambm podese variar outros fatores; Os estgios so chamados de cortes (em geral, dois);

30% v/v

50% v/v

Representao terica dos perfis de solubilidade de uma molcula de interesse e outras presentes no meio, em concentraes crescentes de precipitante.

pH 4,6 100

% Recuperao

80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 % etanol (v/v)

xilanase beta-xilosidase protenas totais

Recuperao (%) das enzimas: xilanase (), -xilosidase () e protenas totais ().

Parmetros de Avaliao

Recuperao de protenas totais:

Rp = teor de protenas aps precipitao x 100

teor de protenas inicial
Recuperao de atividade:

Ra =

atividade aps precipitao x 100 atividade inicial

Aumento de pureza:

AP =

atividade especfica aps precipitao atividade especfica inicial

Resultados obtidos aps precipitao fracionada com etanol das enzimas xilanase, -xilosidase e protenas totais.
-xilosidase Amostra Inicial 20% etanol 60% etanol 80% etanol RP1 (%) 71 12 18 Xilanase RA2 (%) 8 74 6 AP3 1,0 0,1 5,9 0,4

Amostra
Inicial 20% etanol 60% etanol

RP (%)
71 12

RA (%)
6 7

AP (AEf/AEini)
1,0 0,1 0,6

80% etanol
1Recuperao

18

81

4,4

de protenas totais; Atividade; 3Aumento de pureza.

2Recuperao

de

PRECIPITAO POR POLMEROS

PEG (polietilenoglicol), polmero de alta massa molar, neutro e miscvel em gua, disponvel em diversos graus de polimerizao;

Em geral, propores de polmero (15 a 30%); 4000 g/mol ou mais so os mais eficientes Mecanismo: excluso da protena do meio aquoso; Concentrao depende do tamanho da molcula a ser precipitada e da massa molar do polmero, sendo inversamente proporcional concentrao da protena; Remoo do polmero: ultrafiltrao, dilise, adio de etanol.

Polieletrlitos: polmeros inicos solveis em gua; usados devido ao baixo custo e pouca concentrao residual; Poliction polietilenoimina e polinion cido poliacrlico Mecanismo: agregao protena (floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas); PRECIPITAO PELA TEMPERATURA Mecanismo:1) diminuio: reduo na solubilidade; 2) aumento: desnaturao => exposio de grupos hidrofbicos que interagem e formam complexos insolveis;

PRECIPITAO ISOELTRICA Resulta da atrao eletrosttica das protenas quando estas esto prximas a seu pI; Mtodo bastante simples: ajuste do pH Prximo ao pI a repulso eletrosttica mnima => precipitao isoeltrica, por interao entre as zonas hidrofbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturao

Obs: Mtodo til para precipitar protenas indesejveis e otimizar outros tipos de precipitao;

Outros tipos de precipitao

Por afinidade: uso de interaes especficas e seletivas da molcula-alvo com algum ligante; Ex.:Cibracon blue em metilmetacrilato para purificar lactato desidrogenase. Por ons metlicos: ons metlicos polivalentes podem ser usados eficientemente na precipitao: mangans, ferro, cobalto, nquel, cobre, zinco e cdmio. Mecanismo: mudanas do pI e formao de ligaes cruzadas com outras protenas.

Principais mtodos de precipitao de protenas

Precipitante
Sais neutros (salting-out)

Princpio
Interaes hidrofbicas pela reduo da camada de hidratao da protena Excluso da protena da fase aquosa reduzindo a quantidade de gua disponvel para a solvatao da protena

Vantagens
- Uso universal - Baixo custo

Desvantagens
- Corrosivo - Liberao de amnia em pH alcalino - Aumento da viscosidade

Polmeros noinicos

- Uso de pequenas quantidades de precipitante

Calor

- Baixo custo interaes hidrofbicas e - Simples interferncia das molculas de gua nas ligaes de hidrognio,

- Risco de desnaturao

Polieletrlitos

Ligao com a molcula de protena atuando como agente floculante

Neutralizao da carga global da protena pela alterao do pH do meio Formao de complexos

- Uso de - Risco de pequenas desnaturao quantidades de precipitante

- Uso de - Risco de pequenas desnaturao quantidades de precipitante - Uso de - Risco de pequenas desnaturao quantidades de precipitante - Facilidade de reciclagem - Facilidade na remoo do precipitado - Risco de desnaturao de protenas - Inflamvel e explosivo

Precipitao isoeltrica

Sais metlicos

Solventes orgnicos

Reduo da constante dieltrica do meio aumentando as interaes eletrostticas intermoleculares