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by Rene Jackstadt, Simone Rh, Jens Neumann, Peter Jung, Reinhard Hoffmann, David Horst, Christian Berens, Georg W. Bornkamm, Thomas Kirchner, Antje Menssen, and Heiko Hermeking
A protena AP4 um fator de transcrio em hlice-loop-hlice leucina-zper que forma homodmeros, que se ligam ao E-box CAGCTG (Hu et al.,1990; Jung and Hermeking,2009)
Alvo direto de c-MYC Upregulation de c-MYC hallmark de cncer colorretal AP4 est upregulated em tumores colorretais que hiperexpressam c-MYC Down-regulation de p21 (cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor) (Jung et al., 2008, Muzny et al., 2012)
Transio epitlio-mesenquimal
Programa de regulao celular implicada na capacitao de clulas epiteliais para invadir, disseminar e resistir apoptose Fatores de transcrio: Snail, Slug, Twist, and Zeb1/2 Clulas de metstases distncia apresentam alteraes em seu formato e na capacidade de se ligarem a outras clulas e matriz extracelular Perda de E-caderina est associada a maior potencial de invaso e metstase Hiperexpresso de N-caderina observada em carcinomas invasivos (Hanahan e Weinberg, 2011)
Microarray Heat map de mRNA (1458) diferencialmente regulado aps infeco por Ad-AP4 vs Ad-GFP Pico 24horas
AP4 coordena a expresso de grande nmero de genes que podem afetar TME e proliferao
Validation of AP4-mediated differential gene expression. PCR quantitativo (mRNA) para confirmar induo ou represso de 30 genes selecionados Imunoblot Deteco de protenas
Quantificao da protena CDK2 em clulas de linhagem do osteossarcoma Quantificao da protena LGR5 em clulas de linhagem do osteossarcoma
pRTR was generated by replacing the KRAB repressor domain containing Tet trans-silencer of the pRTS (Bornkamm et al.,2005) vector with an alternative trans-silencer containing a CtBP-recruiting PLDLS repression motif (Molloy et al., 2001) and a relaxed effector specificity (Krueger et al., 2006), together with an IRES-coupled Puromycin-resistance gene. To generate the episomal pRTRAP4-VSV vector, the AP4-VSV ORF was isolated from pcDNA3-AP4-VSV (Jung et al., 2008) and ligated into the pUC19-SfiI shuttle vector via BamHI and NotI restriction sites, released with SfiI, and the resulting fragment of interest was ligated into pRTR. All plasmids were verified by sequencing
Expresso de AP4 confinada s pores basais das criptas, contendo clulas progenitoras e clulas tronco
p21, diretamente reprimido por AP4, exclusivamente expresso nas camadas superiores das criptas
Expresso de SNAIL, CKS2 e CD44 tambm est confinada s clulas da poro basal das criptas Possivelmente genes regulados por AP4 em clulas de linhagem de cncer colorretal so reguladas por AP4 no clon normal
Jung, 2008
Comparison of the distribution of AP4-binding motifs with ChIP signals, transcription units, and c-MYC motifs on chromosome 11. Para identificar genes diretamente regulados por AP4, foi realizada genome-wide chromatin immunoprecipitation (ChIP) seguida de next generation sequencing (ChIP-seq) em clulas DLD-1 aps ativao de AP4
Comparao da distribuio de motifs de ligao de AP4 com a distribuio de leituras de ChIP-seq Comparao da distribuio de motifs de ligao de AP4 com genes conhecidos
Genome-wide analyses of AP4 occupancy. Localizao dos ChIP signals 38% >5 kbps ou downstream 10% < 5 kbps 52% regies intragnicas Proporo de genes diferencialmente expressos com ligao de AP4 na regio promotora e resultados de expresso de mRNA
Comparao de ChIP signals derivados de AP4 nos promotores de genes induzidos e reprimidos por AP4
Anlise de 485 ChIP signals em proximidade com TSS com pelo menos 25 leituras sobrepostas (MEME multiple em for motif elicitation)
AP1 motifs foram detectado em 41% dos ChIP signals derivados de AP4
SP1 motifs foram detectados em 36% dos ChIP signals derivados de AP4
AP4 coopera com SP1 e AP1 na regulao transcricional de alvos gnicos em comum
Analysis of AP4 occupancy at selected promoters. Resultados da anlise de Chip-seq em 7 promotores selecionados * CAGCTG motifs preditos com bioinformtica CAGCTG motifs
Anlise qChIP indica que h ligao de AP4 no promotor de CDH1/Ecaderina na ausncia do motif CAGCTG
Imunoblot
Microscopia confocal de clulas DLD-1 com expresso ectpica de AP4 Deteco de E-caderina e -catenina por imunofluorescncia indireta Deteco de F-actina por Alexa Fluor 647labeled Phalloidin
Imunoblot (HT29)
qPCR de RNA Ensaio dual luciferase Atividade transcricional em clulas transfectadas com um gene luciferase sob controle de um promotor Atividade do reporter catenina/TCF4
Imunoblot (SW480)
qPCR (SW480)
SW480: expresso alta de AP4 constitutiva miRNA: silenciamento gnico via represso de translao ou degradao do RNA alvo
Imunoblot (DLD-1)
siRNA interfere com expresso de genes especficos com sequncia de nucleotdeos complementares
Imunoblot (DLD-1)
AP4 e SNAIL funcionam de maneira independente AP4 fator de transcrio com capacidade para induo de TEM
Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350
2013 Jackstadt et al.
A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.
Microscopia confocal de clulas DLD-1 com expresso ectpica de AP4 Deteco de E-caderina por imunofluorescncia indireta
A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.
Imunoblot
A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.
Wound healing
A circuitry involving c-MYC, AP4, and SNAIL regulates EMT and invasion.
A induo de SNAIL pelo c-MYC em grande parte mediada por AP4, mas tambm h um componente AP4-independente
Jackstadt R et al. JEM 2013;210:1331-1350
2013 Jackstadt et al.
Imunoblot
Imunoblot
Imunoblot SW-620-Luc
Requirement of AP4 for metastasis in a xenograft mouse model. Bioluminescncia Camundongo NOD/SCID 9 semanas aps injeo
Bioluminescncia
Funo de AP4 e SNAIL necessria para crescimento de metstases de clulas de CCR nesse modelo animal
2013 Jackstadt et al.
Association of AP4 with metastasis and poor patient survival. Estudo caso controle 55 pacientes com metstase heptica sincrnica vs 55 pts SED em5 anos
Expresso elevada de AP4 apresentou correlao com grau de diferenciao e presena de metstases distncia e linfonodal
2013 Jackstadt et al.
Sobrevida cncer especfica em 5 anos de acordo com expresso de AP4 Alta: 50% Intermediria: 70% Baixa: 80%
Gray, 2011
Solin, 2013
Obrigado