TEMA 1: INMUNOENSAYO,conceptos bsicos. ANTICUERPOS-ANTIGENOS.

INTRODUCCION- INMUNOENSAYO es una prueba que usa complejos de Antigenos-Anticuerpo,llamados INMUNOCOMPLEJOS,para cuantificar un ANALITO(sustancia objeto de anlisis)determinado,que puede ser un Antigeno o Anticuerpo,usando para la medicin una molecula como marcador que hace parte de la reaccin con el INMUNOCOMPLEJO . La tcnica se basa en la gran SENSIBILIDAD y ESPECIFICIDAD de los Anticuerpos por sus Antigenos y se usan los Anticuerpos MONOCLONALES o de sueros POLICLONALES (obtenidos de animales),siendo mas especficos los monoclonales.

continuacion
ANTICUERPO.- Es una Glucoprotena del tipo Gammaglobulinas producida por el cuerpo en respuesta a una sustancia extraa.tambin existen protenas o anticuerpos contra las molculas del cncer.Se encuentran presentes en la sangre u otros fluidos corporales y como receptores unidos a las membranas de los Linfocitos B . Su estructura bsica esta formada por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras de menor tamao,aunque la estructura general de todos los anticuerpos es semejante una pequea porcin del apice de la protena es extremadamente variable,la cual permite la existencia de millones de anticuerpos ,cada una de estas variantes se unen a diferentes antigenos.

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La nica parte del antgeno reconocido por el anticuerpo se denomina EPITOPO.

ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO

1.- Region Fab 2.- Region Fc 3.- Cadena Pesada con un domino variable(VH),seguido por un dominio constante (CH1) ,una regin bisagra,y dos constantes 4.- Cadena ligera con un dominio variable (VL) y uno constante(CL) 5.- Lugar de unin al antgeno (paratopo). 6.- Region bisagra.

MonomeroIgD,IgE,IgG/Dimero IgA/Pentamero Ig M

 ANTIGENO.Es la sustancia extraa o propia que el cuerpo esta tratando de combatir .algunos Test de inmunoensayos determinan la presencia de antigenos directamente en vez de buscar anticuerpos.ejm para medir la concentracion de una droga teraputica . ANALITO . Es toda sustancia capaz de ser medido en una prueba de laboratorio..En las pruebas de Inmunoensayo ,el analito puede ser tanto un Anticuerpo como un Antigeno .

PREPARACION ACS POLICLONALES Y MONOCLONALES

Antisuero Policlonal (suero sanguneo que contiene los Acs deseados) se genera en animales,siendo los mas comunes ovejas,conejos o cabras.Los animales producen el antisuero-igual que un ser humano-como mecanismo de defensa al ser expuesto a un antgeno.El antisuero contiene una mezcla de anticuerpos,cada uno de los cuales puede unirse a diferentes puntos de unin del antgeno o epitope. Preparacion : Se inicia cuando se le inyecta a un animal una solucin que contenga el Antigeno de inters o sustancia Inmunogena.Transcurrido un tiempo,en algunos casos con multiples inyecciones,el sistema inmunolgico del animal comienza la produccin de Acs.Se toma la sangre del animal y se separa el suero.Este suero es rico en Acs que reconocen el Antigeno y se le denomina ANTISUERO .

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El Antisuero por lo general contiene una mezcla de Anticuerpos que reconocen y se unen al mismo antgeno,pero pueden combinarse con diferentes EPITOPES. Un antgeno que contenga multiples puntos de unin para los Acs.se le denomina antgeno MULTIVALENTE .Estos tipos de anticuerpos,presentes como una mezcla diversa,se denominan anticuerpos POLICLONALES .

continuacion
Los Anticuerpos Monoclonales se diferencia de los anticuerpos policlonales en que son muy especficos para un EPITOPE simple en un antgeno multivalente.Se producen a partir de una lnea celular simple usando tecnologa para hibridomas y lneas celulares de mieloma de raton.Los hibridomas son clulas tumorales productoras de anticuerpos que producen varias copias del mismo anticuerpo y se desarrollan fcilmente en poblaciones celulares de laboratorio. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales es que la lnea celular Hibridoma que los produce es potencialmente inmortal y que puede producir los mismos anticuerpos en forma constante e indefinida .

PREPARACION ACS MONOCLONALES .

**Las hibridomas se producen en multiples etapas : Inyectando un antgeno especifico a un animal husped (raton) Aislando clulas productoras de anticuerpos (clulas B)del bazo de raton. Fusionando estas clulas B con un tipo especifico de celula tumoral que se desarrolla faciilmente en poblaciones y produce anticuerpos. Aislando hibridomas logrados(celulas fusionadasque produzcan anticuerpos especficos para el antgeno de inters.

conclusiones
En los Inmunoensayos,ambos anticuerpos Monoclonales y Policlonales se usan para detectar antigenos ,cada uno con fortalezas especificas para aplicaciones particulares .es probables que los Inmunoensayos que detectan anticuerpos en sueros de pacientes supongan la deteccin de anticuerpos policlonales generados por el sistema inmunolgico del paciente .

TECNICAS DE INMUNOENSAYOS
Se trataran cuatro categoras de tcnicas de inmunoensayo : INMUNOENSAYO NO COMPETITIVO INMUNOENSAYO COMPETITIVO INMUNOENSAYOS HOMOGENEOS INMUNOESNSAYO HETEROGENEOS.

Continuacion
Todos los inmunoensayos requieren el uso de material marcado para medir la concentracin de Ag o Ac presente .UNA MARCA es una molcula que reacciona como parte del ensayo por lo tanto un cambio en la seal puede medirse en la sangre. Las MARCAS incluyen un compuesto radioactivo, una ENZIMA que hace que cambie el color de una solucin, o una sustancia que produzca luz. La MARCA puede aplicarse durante la fabricacin del reactivo tanto al Ac como el Ag. Las tecnologas de inmunoensayo utilizan diferentes formatos para distinguir el complejo antgeno-anticuerpo de la marca libre no unida.

INMUNOENSAYO COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS

I.COMPETITIVO El analito sin marcar(generalmente antgeno) en la muestra se mide por su capacidad para competir con un antgeno marcado en el i nmunoensayo.El antgeno sin marcar bloquea la capacidad del antugeno marcado de unirse ,puesto que ese punto de unin en el Ac ya se encuentra ocupado. El I. COMPETITIVO DE UN SOLO PASO, tanto el reactivo del antgeno marcado (Ag*) como la muestra sin marcar(o analito de la muestra) compiten por una cantidad limitada de anticuerpo .

Inmunoensayo competitivo de un solo paso .

EL INMUNOENSAYO COMPETITIVO DE DOS PASOS .

La concentracin de anticuerpos del reactivo se encuentra presente en exceso comparada con la concentracin de antgeno.El reactivo del anticuerpo primero se incuba con una muestra que contenga antigenos de inters,luego en el segundo paso,se agrega el Ag marcado .Recuerde que la menor concentracin del antgeno marcado unido indica mayor concentracin de antgeno presente en la muestra.El inmunoensayo de dos pasos proporcionan una sensibilidad mejorada,comparados con el Inmunoensayo de un solo paso .

Inmunoensayo competitivo de dos pasos

Inmunoensayo no competitivo (sndwich)

INMUNOENSAYO NO COMPETITIVO (SANDWICH)

Los I. no competitivos generalmente proporcionan el nivel mas alto de sensibilidad y especifidad del ensayoy se aplican a la medicin de ANALITOS crticos como pueden ser los MARCADORES CARDIACOS Y DE HEPATITIS,se reconoce como SANDWICH,ya que el ANALITO esta unido entre dos reactivos de anticuerpos muy especficos,tambin pueden utilizar las tcnicas de un paso o dedos pasos.emplea etapas de lavado en el que se aisla y se lava el complejo sndwich para quitar el exceso del reactivo marcado no unido y cualquier otra sustancia que interfiera . I.NO COMPETITIVO DE DOS PASOS generalmente ofrece la mayor especificidad y sensibilidad de todos los dems .

TECNICAS DE INMUNOENSAYO HOMOGENEAS Y HETEROGENEAS

TECNICA DE INMUNOENSAYO HOMOGENEO Esta tcnica se ha aplicado a la medicin de pequeos analitos como por ejemplo las DROGAS DE ABUSO Y TERAPEUTICOS. Debido a que las tcnicas no requieren la separcion de la unin Ab-Ag* del Ag* libre,generalmente son mas fciles y mas rapidas de realizar . TECNICAS DE INMUNOENSAYO HETEROGENEO Requiere la separacin de los complejos no unidos ,a menudo utilizando un reactivo de fase solida como una particula megnetica ouna esfera plstica .

Inmunoensayos homogneos y heterogeneos

TECNICAS DE INMUNOENSAYO: RIA Y EIA

.RIA - El desarrollo de los inmunoensayos comenz en los aos 60 con la aplicacin de RADIOINMUNOENSAYOS(RIA) .Aqui utilizan isotopos radiactivos como marca,y la concentracin de radioactividad medida indica la concentracin de ANALITO presente . La tcnica de I.no competitivo(sndwich) la concentracin de marca tiene relacin directa con la concentracin de antgeno presente ,mientras que en el I. competitivo ,la concentracin de antgeno tiene relacin inversa con la concentracin de antgeno

LOS RIA UTILIZAN UNA MARCA DE ISOTOPOS RADIACTIVOS.

continuacion
Los RIA todava se usan en la actualidad,particularmente para la deteccin de cantidades muy bajas de analito.Sin embargo,debido a las complicaciones inherentes al manipuleo y de los desechos de los materiales radioactivos en el laboratorio clnico, EL RIA se usa con menos frecuencia que otro tipo diferente de inmunoensayo,denominado inmunoensayo enzimtico (EIA) .

EIA,ELISA O ENZIMOINMUNOENSAYO
Representa una aplicacin popular del inmunoensayo sndwich heterogneo de fase solida que combina un reactivo marcado ENZIMA-ANTICUERPO con un ANTICUERPO UNIDO A UNA FASE SOLIDA .Un ENSAYO ELISA es un tipo de EIA.Inicialmente ,se utilizaban como material de base solida tanto las placas de microtitulo.Una placa de microtitulo es simplemente una placa plstica cuadrada con pocillos de poca profundidad recubiertos con un ANALITO . Hacia fines de la dcada del 70 y dirante los 80 y 90 ,se lograron importantes avances en la autoimatizacion y sensibilizacin de los inmunoensayos en EIA en particular.

conclusiones
Las tecnologas de inmunoensayospor polarizacin de fluorescencia (FPIA) e inmunoensayo por microparticulas (MEIA)representaron a las tecnologas predominantes durante algunos aos .Mas recientemente ,la tecnologa del inmunoensayo Magntico Quimiluminiscente (CMIA) se ha aplicado como rutina debido al significativo aumento de sensibilidad .Cada una de estas tcnicas ser tratada mas adelante .