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PURIFICACION DE PROTEINAS
Purificacin de Protenas
Objetivo:
Lograr aislar la protena de inters
Una protena de inters puede existir en muy pequea proporcin dentro de la muestra original
Purificacin de Protenas
Ensayo de actividad
Debe ser una prueba especfica para la protena de inters A ms especfico el ensayo, mejor calidad de purificacin
Purificacin de Protenas
Extraccin de las protenas de las clulas
Fraccionar las clulas en sus componentes
Determinar en dnde se encuentra en mayor cantidad la protena de inters Centrifugacin diferencial
Purificacin de Protenas
Estrategias de separacin:
Por solubilidad Por tamao Por carga Por afinidad de unin
Mtodos de Separacin
Mtodos que separan la protena entre 2 fases:
Generalmente (pero no siempre):
Un slido (precipitado) Un lquido (sobrenadante)
Mtodos que separan protenas a diferentes tasas de movimiento sobre algn material, como una columna de cromatografa o electroforesis Mtodos que separan las protenas por filtracin:
Las protenas pasan por orificios muy pequeos
Filtros Columnas
Mtodos de Separacin
Los mtodos de 2 fases separan las protenas con menor eficiencia que los mtodos de tasa de movimiento La ventaja es que son ms fciles de aplicar en grandes cantidades de material Por eso son utilizados en etapas iniciales de purificacin, antes de aplicar mtodos que son ms difciles de realizar con volmenes grandes de muestra
PRECIPITACION DE PROTEINAS
Precipitacin de Protenas
En disolucin acuosa, los residuos hidrofbicos de las protenas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga elctrica, en funcin del pH del medio. En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga elctrica de cada grupo, de tal manera que la protena presenta una capa de solvatacin formada por el agua de hidratacin, que es el agua retenida por las cargas elctricas de la superficie de las protenas. Los AA polares sin carga tambin se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrgeno.
Precipitacin de Protenas
Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin.
desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo ruptura de los puentes de hidrgeno
Precipitacin de Protenas
Precipitacin de Protenas
Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.
Estado nativo
Estado desnaturalizado
Precipitacin de Protenas
Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Cualquier alteracin de la estructura nativa que modifique su interaccin con el disolvente y que provoque su precipitacin dar lugar a una estructura desnaturalizada. En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.
Precipitacin de Protenas
La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie prdida de las propiedades biolgicas
Precipitacin de Protenas
Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria.
Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible.
El proceso mediante el cual la protena desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalizacin.
Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas la protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.
En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita.
La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso sea irreversible.
Precipitacin de Protenas
Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes
agentes fsicos: temperatura agentes qumicos: detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica
Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en:
la polaridad del disolvente la fuerza inica el pH la temperatura
Efecto del pH
Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos a la fuerza inica Adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos
Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados.
Efecto de la Temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan Un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada
Efecto de la Temperatura
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan Un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada
DIALISIS
Filtracin Molecular
Filtracin convencional:
separa partculas suspendidas en fluidos las suspensiones pasan a travs de un material poroso, en el cual las partculas quedan retenidas y pueden ser separadas del fluido
Filtracin molecular:
Uso de membranas semipermeables Permite separar molculas disueltas en funcin de su tamao
Dilisis
La dilisis es uno de los mtodos de filtracin molecular ms utilizados Se coloca una solucin acuosa que contiene molculas de distintos tamaos dentro de una bolsa de dilisis que se encuentra a su vez sumergida en un gran volumen de un buffer determinado Las molculas pequeas del soluto (excepto aquellas que se encuentran fuertemente cargadas) pasan libremente a travs de la membrana, hasta alcanzar el equilibrio. Reemplazando la solucin externa repetidas veces, puede lograrse reducir la concentracin de las molculas pequeas a valores prcticamente despreciables. El agua pasa tambin libremente a travs de la bolsa, ocasionando as concentracin o dilucin, dependiendo de si la solucin interna se encuentra ms o menos concentrada que la externa (efecto osmtico).
Dilisis
Dilisis inversa:
concentracin de material dentro de la membrana de dilisis la membrana de dilisis llena es enterrada en un polmero seco y soluble en agua que no pueda penetrar en la membrana, por ejemplo, polietilenglicol o carboximetilcelulosa el agua abandona la bolsa para equilibrarse con la fase externa tambin puede utilizarse sacarosa, pero debido a que sta es una sustancia dializable, puede entrar en la bolsa de dilisis cuando el agua es eliminada
Muestra inicial: 50 ml de una solucin de protena en buffer que contiene sulfato de amonio 1 M
PROCEDIMIENTO 1
Se llega a equilibrio la bolsa se hincha hasta 100 ml en 3 y 5 h. la bolsa se hincha hasta 110 ml no hay hinchamiento de la bolsa
[sulfato de amonio] en el equilibrio = 95 mM [sulfato de amonio] en el equilibrio = 9.3 mM [sulfato de amonio] en el equilibrio = 0.9 mM
Reemplazar el dializado por agua pura Reemplazar el dializado por agua pura
PROCEDIMIENTO 2 Dializar contra 5 litros de agua Dializar contra 5 litros de agua la bolsa se hincha hasta 110 ml no hay hinchamiento de la bolsa [sulfato de amonio] = 20 mM [sulfato de amonio] en el equilibrio = 0.4 mM
Ultrafiltracin
Una modificacin importante de la membrana de dilisis es el Diaflo (Amicon). Esta membrana est formada por un polmero muy fino con un tamao de poro que vara entre 0.2 y 10 nm, montado sobre una capa de soporte gruesa (.05.25 mm de espesor), con poros muy grandes. Estas membranas pueden utilizarse para procesos de concentracin (empleando una membrana a travs de la cual slo pase agua), y de eliminacin de sales en preparaciones para cromatografa, y fraccionamiento por tamao molecular. La velocidad de flujo a travs de estas membranas es tan baja que debe aplicarse presin (aire comprimido o nitrgeno, hasta a 5 atmsferas). Por lo general, para utilizar estas membranas se necesitan soportes especiales. Con este mtodo se pueden concentrar volmenes de 50 ml a 5 ml o de 200 ml a 10 ml en una hora o menos, especialmente si la concentracin final es an relativamente baja (la velocidad de filtracin cae rpidamente a medida que la concentracin de la sustancia que se quiere concentrar crece).
Ultrafiltracin
Otra forma de ultrafiltracin consiste en aplicar vaco o fuerza centrfuga al recipiente en que se encuentra la membrana semipermeable cargada con la muestra.
CENTRIFUGACION
Centrifugacin
La centrifugacin es un mtodo que permite separar las partculas presentes en un medio lquido o semilquido, utilizando una fuerza de aceleracin, que imprime a las partculas una velocidad y un movimiento diseccionado, aprovechando de su densidad caracterstica
Cada partcula, cuerpo o molcula tiene un tamao (volumen), y tiene una masa; ambas confieren a dicha sustancia una densidad. (Densidad) = Masa/Volumen
Centrifugacin
Se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulacin en el fondo del mismo de las partculas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran. As, despus de la centrifugacin la muestra, homognea, se habr separado en dos fracciones : sobrenadante, fraccin homognea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo. La fuerza centrfuga es aplicada a cada partcula de la muestra la cual ser sedimentada en un ndice que es proporcional a la fuerza centrfuga aplicada.
Centrifuga
Las centrfugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentacin en poco tiempo de las partculas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea Cada partcula de la muestra la cual ser sedimentada en un ndice que es proporcional a la fuerza centrfuga aplicada En general se diferencian en funcin de los mrgenes de aceleracin a que someten a las muestras en : centrfugas (de pocas g a aprox. 3000 g), supercentrfugas (o centrfugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrfugas (de 15000 g a 600000 g) En las centrfugas se suele controlar la temperatura de la cmara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la friccin. En las ultracentrfugas, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vaco en la cmara de la centrfuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.
Rotores
En una centrfuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos :
Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposicin perpendicular al eje de giro. As pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro. Rotor de ngulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sita paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es tpico de ultracentrfugas y se emplea en separaciones de molculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).
Parmetros Importantes
Los parmetros a tener presentes en cualquier centrifugacin, que determinarn las condiciones son :
Volumen de solucin a centrifugar, que determinar el tipo de tubos y rotores a emplear.
Naturaleza qumica de la solucin, que determinar la naturaleza del tubo a emplear Diferencial de densidad entre la partcula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleracin) sedimentar. Cuando el diferencial es muy pequeo se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.
Parmetros Importantes
Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podr centrifugar la muestra.
Son especialmente importantes el ngulo de giro, el radio mnimo, medio y mximo, y la velocidad mxima de giro.
La relacin entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleracin (fuerza centrfuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresin siguiente : RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2
Para conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la frmula de fuerza de centrifugacin relativa:
Centrifugacin Diferencial
La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que difieren en su densidad de la del medio.
Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas.
Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimentan de nuevo las partculas ms densas presentes y as sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y obtener una coleccin de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de diferente tamao y/o densidad.
Sedimentacin
La sedimentacin es el transporte de partculas en un campo de fuerza de centrifugacin. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromolculas y organelas celulares.
Coeficiente de sedimentacin Los principios bsicos de la teora de sedimentacin, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentacin de una esfera en un campo gravitacional, para as mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a travs del lquido. Coeficiente de sedimentacin 1 dr S = ----- X -----W2 r dt W : velocidad del rotor Dr/dt : ndice de movimiento de dos partculas (cm/s)
Velocidad de Sedimentacin
Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas para realizar una centrifugacin en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Despus de un tiempo las diferentes poblaciones de partculas se sitan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeo orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamente de la ultracentrifugacin preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentacin de una partcula (medida en unidades Svedverg, S).
Los coeficientes de sedimentacin son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 1013s. De esta manera, una partcula cuyo coeficiente de sedimentacin es medido en 1012s.= 10x10-13s., es decir que tiene un valor de 10S. Una partcula en un campo gravitacional se comporta segn la LEY DE STOKES d2 ( hP - hL ) V = ____________ x g 18 n
Donde: V = velocidad de sedimentacin d = dimetro de la partcula hP = densidad de la partcula hL = densidad del lquido n = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional Se cumple: - La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula - La velocidad de sedimentacin es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula - La velocidad de sedimentacin es 0, cuando la densidad de la partcula e igual a la densidad del medio circundante - La velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio - La velocidad de sedimentacin aumenta al aumentar la fuerza del campo centrfugo El coeficiente de sedimentacin es una constante caractristica de cada organelo o macromolcula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor. El tiempo de centrifugacin hasta la clarificacin de una organela se define por: K T (horas) = --S Donde: S= coeficiente de sedimentacin de la organela K= constante del rotor. ( depende del ngulo de inclinacin del tubo de centrifugacin con respecto al eje de rotacin)
Differential centrifugation separates a mixture of particles (macromolecules, cell organ-elles, and cells) that differ in mass or density. The most dense particles collect at the bottom of the tube as a pellet. The least dense particles remain in the liquid supernatant, which can be transferred to another tube. (
Rate-zonal centrifugation separates particles or molecules that differ in mass but may be similar in shape and density (e.g., RNA molecules). Here two particles of different mass separate into two zones.
Figure 4.15. Zonal Centrifugation. The steps are as follows: (A) form a density gradient, (B) layer the sample on top of the gradient, (C) place the tube in a swinging-bucket rotor and centrifuge it, and (D) collect the samples. [After D. Freifelder, Physical Biochemistry, 2d ed. (W. H. Freeman and Company, 1982), p. 397.]
Subcellular components move up or down when centrifuged in a gradient until they reach a position where their density matches their surroundings. Although a sucrose gradient is shown here, denser gradients, which are especially useful for protein and nucleic acid separation, can be formed from cesium chloride.
Figure 9.4. Isolation of rough ER When cells are disrupted, the ER fragments into small vesicles called microsomes. The microsomes derived from the rough ER (rough microsomes) are lined with ribosomes on their outer surface. Because ribosomes contain large amounts of RNA, the rough microsomes are denser than smooth microsomes and can be isolated by equilibrium density-gradient centrifugation.
Figure 4.7. Satellite DNA Equilibrium centrifugation of Drosophila DNA in a CsCl gradient separates satellite DNAs (designated I IV) with buoyant densities (in g/cm3) of 1.672, 1.687, and 1.705 from the main band of genomic DNA (buoyant density 1.701).
Hematocrito