Tcnicas para Anlise de Metablitos

Wilma Oliveira

Cromatografia
Chroma graphe= escrita em cores. Tcnica usada pela primeira vez para separar pigmentos de flores e folhas.

M. S. Tswett

Cromatografia
um mtodo fsico-qumico de separao de uma mistura

atravs da interao dos compostos com as fases estacionria

e mvel.

Depende da afinidade, solubilidade e foras intermoleculares.

Partio.

CROMATOGRAFIA

PLANAR

COLUNA

CENTRFUGA

CCD

CSC

GASOSA

CP

CG

CGAR

LQUIDA

CLSSICA

CLAE

Cromatografia em coluna lquida clssica

Fase mvel: solventes polares e
apolares.

Fase estacionria: SiO2, Al2O3,

lquida e resinas oferecidas por fabricantes*.

Cromatografia lquida de alta eficincia CLAE ou HPLC

Coluna cromatogrfica

Fluxo

Detector

Cromatograma

Sinal

Tempo

Coluna cromatogrfica

Fluxo

Detector

Cromatograma

Sinal

Tempo

Coluna cromatogrfica

Fluxo

Detector

Cromatograma

Sinal

Tempo

Coluna cromatogrfica

Fluxo

Detector

Cromatograma

Sinal

Tempo

Coluna cromatogrfica

Fluxo

Detector

Cromatograma

Sinal

Tempo

Cromatograma

JINMAO Y, 2007

Detectores - HPLC
Espectrofotmetro UV Visvel; ndice de refrao; Fluorescncia;

Eletroqumico;
Espectrometria de massas.

Cromatografia gasosa - CG
Fase mvel: gs inerte e puro. He, N2, H2 ou Ar.

Detectores -CG
Condutividade trmica; Captura de eltrons; Ionizao em chama;

Espectrometria de massas.

Espectrometria de massa - MS
Consegue detectar a composio de diferentes tecidos do corpo e substncias pequenas.

Espectrometria de massa - MS
Usa-se um campo magntico para separar os ons moleculares segundo suas massas;

Espectrograma

Detectores de MS
Quadrupolar; Magntico/eletrosttico; Tempo de vo (TOF);

Ressonncia Magntica Nuclear - RMN

De forma geral, estuda direta ou indiretamente compostos ou fenmenos qumicos; Na metabolmica, elucida a estrutura dos metablitos;

Usada para estudar processos dinmicos de molculas,

interaes e reaes entre molculas.

Ressonncia Magntica Nuclear - RMN

LUZYANIN, K; ABRANTES, M., 2010

Ressonncia Magntica Nuclear - RMN

LUZYANIN, K; ABRANTES, M., 2010

Ressonncia Magntica Nuclear - RMN

LUZYANIN, K; ABRANTES, M., 2010

Metabolmica Microbiana e em Animais

Sandra da Luz

Metabolmica microbiana
Importncia
Validado

Pontos crticos

Ambiente Crescimento

condies controlveis

Preparao da amostra e medio dos metablitos Medir a quantidade real de metablitos em um dado momento.

Metabolmica microbiana
Espcie mais estudada
Relao entre o metabolismo e a regulao global

Escherichia coli
Cromatografia de camada delgada 14C-glicose

Glutamato Aspartato Adenosina

Nveis variam com as taxas de crescimento especfico Diferentes condies de quimiostase

Tweeddale et al., 1998

Preparao da amostra
Quenching celular
Ex.: S. cerevisiae (converso)
Glicose citoslica 1 mmol/s ATP 1,5 mmol/s
Koning e Van Dan, 1992
Nveis dos metablitos variam

Alterao brusca da temperatura ou presso

Ex.: E. coli Metanol frio (-40oC) e nitrognio lquido
Villlas-Bas et al., 2005

Preparao da amostra
Extrao Robustez da membrana Reao das enzimas Estresse fsico Metanol Clorofrmio
Etanol em ebulio Clorofrmio-metanol
Canela et al., 2009

S. cerevisiae

Preparao da amostra

Legendas dos mtodos de anlise que podem ser usados na anlise metabolmica: GC cromatografia gasosa; CE electroforese por capilaridade; HPLC cromatografia lquida de alto desempenho; NMR ressonncia magntica nuclear; DIMS espectrometria de massa de injeco directa; FT-IR - espectroscopia de infra-vermelhos com transformada de Fourier; MS espectrometria de massa; ESI ionizao por electrospray; RI ndice de refraco; UV ultra-violeta.

Villas-Bas et al., 2005

Villas-Bas et al., 2005

Metabolmica microbiana
Objetivo
GC /MS-TOF

Quenching e extrao eficiente de metablitos de E. coli

Resultados
Quenching Soluo de metanol a 60% (-48C)

Extrao 100% de metanol (-48C), com mltiplos ciclos de congelamento/descongelamento

Winder et al., 2008

Metabolmica em Animais
Organismos modelo Peixe zebra (Dario rerio); Verme (Caenorhabditis elegans); Mosca da fruta (Drosophila melanogaster)

Sastia et al., 2012

Metabolmica em animais
Peixe zebra
Metodologia
Aplicao de vrios mtodos (GC/MS; LC/MS; RMN)

Sexo influencia no perfil dos metablitos

Indivduos
Quenching

Liofilizados
Extrao

RMN

GC/MS

LC/MS

(Clorofrmio:Metanol) Centrifugado

Amostras (30oC)

Liofilizado
Sobrenadante Ong et al., 2009

Metabolmica em animais
Peixe zebra
Resultados
RMN GC/MS LC/MS

Glicose Aminocidos Piruvato

Colesterol cidos graxos

Lipdios e Fosfolipdios

Ong et al. 2009

Metabolmica em animais
Peixe zebra
Resultados
Trs tcnicas diferentes oferece uma abordagem perspicaz para compreender o fentipo abrangentes do perfil metablico; Dimorfismo sexual poderia ter implicaes significativas funo reprodutiva, o desenvolvimento da doena, o metabolismo de drogas.
Ong et al. 2009

e fornecer informaes

Metabolmica em animais
Peixe zebra

ONG et al. 2009

Metabolmica em animais
Peixe zebra

Ong et al. 2009

Metabolmica na Medicina
Taciana Manso

Metabolmica na Medicina
Mecanismos de ao Medicina

Biomarcadores
Toxicidade e efeitos teraputicos

Metabolmica na Medicina
Doenas potencialmente fatais Distrbios no metabolismo Detectar alteraes em metablitos Conhecimentos fisiopatolgicos

Descoberta de biomarcadores

Metabolmica na Medicina

Diagnstico de diabetes
Transcriptmica

Metabolmica
66 metablitos

Identificou-se 24 vias distintas alteradas

Urina

Metabolismo dos lipdeos Gliconeognese Disfuno mitocondrial Estresse oxidativo Metabolismo dos aminocidos

Biomarcadores
Connor et al., 2010

Doena Cardiovascular
Colina Trimetilamina N-oxide (TMAO) Betaina

Suplementao em camundongos

Soro humano

TMAO
Associao dose-dependente com o risco de doenas cardiovasculares (doena arterial perifrica, doena arterial coronariana e histrico de infarto do miocrdio)

Wang et al., 2011

Metabolmica do Cncer
Biomarcadores sensveis ao cncer

Diagnstico precoce necessrio para melhorar o prognstico

Cncer de Ovrio
Carcinomas invasivos e tumores limtrofes 291 metablitos identificados 51 metablitos
CG / TOF - MS

Modelo de Previso Supervisionado (preciso de 88%)

Biomarcadores especficos Carcinomas: altos nveis de creatinina, lactato, glicose1-fosfato, fumarato e malato. Tumores Limtrofes: nveis dos metablitos diminudos em relao ao carcinoma. Denkert et al., 2006.

Cncer de Pncreas
Metodologias menos invasivas
Soro humano
CG / TOF - MS

18 metablitos

Diferenas entre as fases do cncer

A anlise de metablitos sricos pode facilitar no prognstico do cncer, alm de fornecer marcadores promissores para seu diagnstico.

Outros estudos

Urina e Saliva

Anlise de mltiplas variveis e/ou biomarcadores mltiplos

Nishiumi et al., 2010.

Transtornos Mentais
Esquizofrenia

lquido cefalorraquidiano

RMN

Pacientes no incio do tratamento

Pacientes saudveis

Possvel desregulao da homeostase da glicose no LCR dos esquizofrnicos.

Holmes et al., 2006.

Transtornos Mentais
Esquizofrenia
57% dos pacientes com um episdio psictico tratados com antipsicticos apresentaram clusters similares dos controles sadios. Enquanto que seis dos sete pacientes que tiveram vrios episdios psicticos antes do tratamento foram agrupados com os pacientes com uma crise de esquizofrenia.
O incio do tratamento antipsictico pode influenciar a resposta ao tratamento
Holmes et al., 2006.

Doena de Parkinson
22 metablitos
Sangue RMN

Piruvato

Dados de expresso gnica

Expresso de enzimas do metabolismo do piruvato

Ahmed et al., 2009.

Doena de Parkinson
90%

Algoritmo de Rede Neural

Ahmed et al., 2009.

Metabolmica em Atletas
Compreender o funcionamento de atletas em repouso, durante o treinamento fsico, a prova, recuperao e descanso, permitindo intervenes nutricionais ou no treino visando o incremento da performance fsica. Compreender os mecanismos bioqumicos e biolgicos da resposta metablica ao exerccio fsico atravs de comparaes do metaboloma antes, durante e aps o exerccio fsico.

Perspectivas da Metabolmica
A metabolmica tem sido aplicada a vrios campos da cincia da vida, sendo capaz de fornecer dados experimentais para a identificao de reaes desconhecidas; Esse metodologia surgiu como uma poderosa ferramenta para prever quantitativamente caractersticas fisiolgicas, ao identificar os metablitos importantes para a caracterstica. Elucidao de tais mecanismos ou vias moleculares poder ser alvo da engenharia metablica para modificar esses fentipos em organismos-alvo diferentes.

Obrigada