Este trabajo estudi el contenido de compuestos fenlicos, actividad antioxidante y el contenido de vitamina C, en diferentes estados de madurez del fruto

de tres variedades de guayaba de Colombia. Se trabaj con dos de alta produccin silvopastoril, la regional roja (RR) y la regional blanca (RB) y una de carcter promisorio como es la variedad guavat victoria (GV). se evaluaron el contenido de fenoles libres, capacidades antioxidantes por ABTS+ y DPPH, FRAP, decoloracin del -caroteno y el contenido de vitamina C por HPLC.

determinar el poder antioxidante de la Psidium guajava L. en diferentes estados de madurez

Cuantificar fenoles por el mtodo de UVvisible Medicin de la actividad antioxidante por diferentes tcnicas . Determinar el contenido total de vitamina C por HPLC

Estudio botnico Farmacognstico : Psidium guajaba L.

Clasificacin cientfica Reino: Plantae Divisin: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Rosidae Orden: Myrtales Familia: Myrtaceae Subfamilia: Myrtoideae Tribu: Myrteae Gnero: Psidium Especie: P. guajava

Nombre binomial Psidium guajaba L.

Propiedades:

Cualidades nutritivas

Antiescorbticas
Remineralizantes Accin astringente: TaninosFlavonoides. Propiedades antioxidantes: Flavonoides - Taninos

Composicin Qumica y Principios activos Hojas Raz Fruto Corteza

taninos (9-10%),contienen grasa (6%), triterpenoides, flavonoides.

taninos (10-20%, leucocianidinas, esteroles, cumarinas

El fruto es rico en vitamina C, contiene tambin cido cinamico (0.4 mg/Kg) y cido3-hexenoico (0.2mg/Kg).polifenoles, taninos, terpenos, glicsidos.

taninos elgicos (12-30%) conformados por casuarinina, estaquicerina, estrictinitinina, hexa-HO-difenilglucosa, casuarina

Las plantas sintetizan una gran variedad de productos secundarios que contienen un grupo fenol. Estas sustancias reciben el nombre de compuestos fenlicos, polifenoles o fenilpropanoides y derivan todas ellas del fenol, un anillo aromtico con un grupo hidroxilo.

Estructura qumica del fenol

Existen dos rutas bsicas implicadas en la biosntesis de compuestos fenlicos: la ruta del cido shikmico y la ruta del cido actico

Eritrosa 4-fosfato (de la ruta de las pentosas fosfatos )

cido fosfoenolpirvico (de la gliclisis)

Ruta del cido Shikmico

Fenilalanina

Acetil coA

cido cinmico

Ruta de Poliacetatos

Fenoles simples cidos Fenlicos Cumarinas Lignanos Taninos

Flavonoides

Quinonas

 FENOLES SENCILLOS

ACIDOS FENOLICOS cido benzoico CUMARINAS

TANINOS

LIGNANOS

 QUINONAS

FLAVONOIDES

ANTOCIANOS

Un antioxidante es una sustancia que cuando est presente en concentraciones bajas, en comparacin con la de la sustancia oxidable, retrasa o previene significativamente la oxidacin de dicha sustancia

TIPOS DE ANTIOXIDANTES

enzimticas

No enzimticas.

Peroxido dismutasa (SOD),Ascorbato peroxidasa (APX), catalasa(CAT)

Acido ascrbico, glutatin, tocoferoles, carotenoides, compuestos fenlicos.

Interaccin directa con especies reactivas.

Prevencin de la formacin enzimtica de especies reactivas.

Actan previniendo la formacin de ROS y RNS inhibiendo la sntesis o la actividad de enzimas prooxidantes involucradas en la generacin de especies reactivas.

Los polifenoles son capaces de inhibir la NOX. MPO y XO

Activacin o induccin de la actividad de

enzimas antioxidantes. Superoxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa y sulfoxi-metionina

Como parte de defensa antioxidante, el organismo bio-sintetiza ciertas enzimas cuya funcin es remover especies reactivas, principalmente ROS.

La accin antioxidante de todas estas enzimas se traduce en una disminucin de estado redox celular.

ACCION ANTIOXIDANTE DE VITAMINA C

reacciona directamente con O-2

El acido deshidroascorbico tiene la capacidad de ser nuevamente reducido a acido ascorbico para seguir actuando como compuesto antioxidante.

El ascorbato tambin es capaz de reaccionar con los radicales OH, y 1O2.

Ciclo de Halliwell-Asada. Mecanismo de la actividad antioxidante del acido ascorbico La reduccion del acido dehidroascorbico a acido ascorbico se lleva a cabo mediante la oxidacion del glutation (GSH) al glutation disulfuro (GSSG).

METODO DE FOLIN CIOCALTEU (cuantificacin de fenoles)

Mezcla de: fosfomolibdato y fosfotungstato

Funciona midiendo la cantidad de sustancia analizada que se necesita para inhibir la oxidacin del reactivo

reaccionar con cualquier sustancia reductora.

ANLISIS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

Ensayo del radical DPPH

Ensayo del radical ABTS

ensayo FRAP

El descenso de absorbancia a 517 nm, asociado a la desaparicin de la forma radical del DPPH (2,2difenil-1-Picrilhidrazilo).

La decoloracin de la disolucin de ABTS+

(2,2-azinobis(3-etilbenzo

tiazolin-6-sulfonato)

determinada e a 734 nm, debida a la reduccin del catin radical por los compuestos dadores de electrones.

La capacidad de los antioxidantes para reducir complejo de Fe(III) con la 2,4,6-tris(2-piridil)-striazina al correspondiente complejo de Fe(II) en medio cido.
El color azul resultante puede medirse a 593 nm.

Mecanismo de estabilizacin del catin radical ABTS+ (arriba), reaccin del catin radical ABTS+ con el trolox (centro) y mecanismo de estabilizacin del radical formado en el trolox (abajo).

Reaccin de transferencia de electrones del compuesto polifenlica (AH) sobre radical DPPH. Mecanismos de transferencia de electrones e intercepcin de radicales libres.

Reaccin de reduccin del complejo [Fe(III)(TPTZ)2]+3 y aparicin del cromforo [Fe(II)(TPTZ)2]+2 cuantificable a 593 nm.

Mecanismo de la actividad antioxidante del -caroteno, deslocalizacin de electrones en la cadena hidrocarbonada de los compuestos carotenoides.

Psidium guajava
GUAYABA
Tres Variedades de Guayaba

Regional Roja

Regional Blanca

Guavata Victoria

I: Inmadura ; II: Pintona; III: Madura ; IV: Sobremadura

La variable a analizar:

Contenido de Fenoles libres Actividad Antioxidante Determinacin de Vitamina C

 Masa de Fruta: 1,5g

Proporcin masa fruta etanol 1:10

Tiempo: 30 minutos Temperatura: 50 C

Centrifugo Llevando a un volumen final de 25 mL

Utilizacin: a)Determinacin del contenido de fenoles libres b)Ensayos de medida de actividad antioxidante

Cuantificacin por el mtodo de Folin Ciocalteu

Patrn: Acido Glico Solucin Stock 1.0mM de Ac. Glico Agua destilada (Rango de concentracin 0-6 mg/L) 100L de la mezcla anterior 750L de Reactivo Folin Ciocalteu 10% v/v 750L de 2 3 6% masa
Tiempo: 2 horas Temperatura: 18C

Lecturas de absorbancia a 765 nm (Espectrofotometro Genesys 10 UV)

Muestra:
Lectura
Extracto obtenido de la Fruta Diluido al 40% v/v en agua (mismas condiciones)

Blanco:

(Resultados expresados en mg de acido glico/100g de fruta)

Se utilizo 100 L de agua destilada (Bajo las mismas condiciones)

Lectura

Resultados:mg eq. de Ac. Glico/g fruta entera en base hmeda.

 Ensayo

de Actividad Antirradicalaria por Bloqueo de Radicales Libres (ABTS) ABTS:(2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)

Se preparo una mezcla compuesta por:

7.0mM ABTS 0,45mM 2 2 8

Condiciones: Oscuridad Tiempo: 16 horas Temperatura: 18 C

Volumen de lo anterior y etanol

Lectura: 734 nm

Reactivo de Catin Radical ABTS*

PATRON

TROLOX Rango de concentraci n de 0 a 20 M

Se preparo: 950 L Reactivo Catin radical ABTS 50 L Solucin Trolox

Volumen final: 1ml Condiciones: Incubacin por 30 minutos Temperatura: 30C

Extractos Etanolicos de la fruta

Blanco

Dilucin al 40% v/v en etanol

Mismas condiciones Tiempo de incubacin: 60 minutos

50L de etanol

Lectura

Lectura a 734nm con un espectrofotmetro Genesys 10UV

Resultados: umol equivalente de trolox/g fraccin comestible en base hmeda.

 Ensayo

de Actividad Antirradicalaria por Bloqueo de Radicales Libres (DPPH)

DPPH: 2,2-difenil-1-Picrilhidrazilo
1mM Solucin Stock DPPH + Etanol Solucin anterior, se diluye en etanol Lectura: Absorbancia de 1.00 a 517nm

PATRON: Trolox. Rango de concentracin de 0 a 25 M

950 L Reactivo radical DPPH + 50 L Solucin Trolox
Volumen final 1ml
Incubacin 30 minutos a temperatura ambiente

Extractos Etanolicos de la fruta

Blanco

Dilucin al 40% v/v en etanol

Mismas condiciones Tiempo de incubacin: 90 minutos

50L de etanol

Lectura

Lectura a 517 nm con un espectrofotmetro Genesys 10UV

Resultados: umol equivalente de trolox/g fraccin comestible en base hmeda.

 Ensayo

de Capacidad Reductora(FRAP)

Preparacin de solucin:
TPTZ(2,4,6-tris(2-piridil)-striazina) en concentracin 10mM disuelto en HCl 40 mM

Preparacin del complejo frrico:

2,5 ml Buffer de 3 2,5 ml solucin TPTZ Volumen final: 100ml

2,5 ml 3 . 62

 TROLOX PATRON Rango de concentracin de 0 a 35 M

Se preparo: 950 L Reactivo FRAP 50 L Solucin Trolox

Volumen final: 1ml Condiciones: Incubacin por 10 minutos Temperatura: 37C

Extractos Etanolicos de la fruta

Blanco

Dilucin al 40% v/v en etanol

Mismas condiciones Tiempo de incubacin: 30 minutos

50L de Agua

Lectura

Lectura a 593nm con un espectrofotmetro Genesys 10UV

Resultados: umol equivalente de trolox/g fraccin comestible en base hmeda.

Se preparo dos emulsiones

a)Emulsin Blanco Referencia 0.20 ml 3 0.6 ml Tween 20 0,04 ml Ac. Linoleico E. Blanco Referencia 0,20 ml -caroteno (1 mg/ml) Volumen final de 100 ml con agua desionizada Las dos se mantuvieron en ultrasonido por cinco minutos

b)Emulsin Solucin Coloreada

Se prepararon tres soluciones a partir de las emulsiones previamente descritas.

1. Solucin Blanco 2. Solucin Control
3,5 ml de emulsin blanco 0,5 ml mezcla de metanol

3,5 ml de emulsin coloreada 0,5 ml de metanol

Incubaci n a 50C, durante dos horas

3. Solucin Muestra

3,5 ml de emulsin coloreada 0,5 ml de Ac. glico

EXTRACCION DE LA VITAMINA C TOTAL DE LA FRUTA FRESCA

Extraccin con agua desionizada
Masa de Fruta: 2 g 1 ml de extracto Volumen final 10ml (Fase mvil)

Los extractos se centrifugaron

1ml solucin
Incubacin por dos horas Filtracin

anterior 1.0 mg de

ditiotreitol
(En frasco mbar)

Inyeccin al equipo de HPLC

Extraccin SolidoLiquido (Agua-Pulpa) Extraccin por Amberita XAD 2

AnlisisCompuestos

eluidos con metanol

HCl 1,5M

Compuestos eluidos con agua

Anlisis

HIDROLISIS ACIDA
Acetato de Etilo

Fase Orgnica
Anlisis

Fase Acuosa
Anlisis

 Las variedades RR y RB el contenido de fenoles presenta la tendencia de aumentar hasta el estado maduro.(enzima fenilalaninaamonialiasa). Al llegar al estado sobremaduro se not una disminucin en el contenido de fenoles, Metanol y acetona buenos solventes para la extraccion de antioxidantes polares .

La variedad que present mayor contenido de fenoles libres fue la variedad RB (en estado maduro) con un valor de 305,2 10,2 mg cido glico/100 g de fruta.

 A medida que la fruta madura, se presenta una mayor capacidad de bloqueo de radicales libres ABTS Si se comparan los valores obtenidos con otros autores se observan diferencias notables. Posiblemente los ,efectuados con acetona. La variedad que present mayor capacidad de bloquear los radicales libres ABTS fue la variedad GV seguida de la variedad RB.

 Disminucin de la capacidad de bloquear radicales libres DPPH en el estado sobremaduro. Con solventes fuertemente aceptores de hidrgenos, como el etanol, trabajan muy lentamente con el DPPH. Es un mtodo de baja sensibilidad. El ABTS es menor selectivo con respecto al DDPPH

 La variedad que present mayor capacidad reductora FRAP fue la variedad RB (en estado maduro). En el estado sobremaduro se not una disminucin capacidad reductora FRAP.

 La variedad que present mayor inhibicin de la peroxidacin lipdica fue la RB (en estado pintn).
A pesar de que en variedades tales como la RR y RB, los mayores valores obtenidos son en el estado pintn, en el estado sobremaduro no se presentan diferencias significativas respecto a los otros estados de madurez. Para la variedad GV, se observ un comportamiento diferente .

La variedad que present mayor contenido de vitamina C total fue la variedad RR (en estado maduro). Se obtuvieron mayores valores ya que se utiliz la fruta entera (cscara, casco, pulpa y semillas) . Diversos autores como Bashir (2003) y Abu-Goukh (1993) reportaron valores mayores de vitamina C y fenoles en la cscara de la guayaba respecto a la pulpa.(proteccion)

VARIEDAD Regional roja (estado maduro) Regional roja (estado pinton)

Contenido de vitamina C 277,4mg acido galico/gfruta 274,4mg acido galico/gfruta

Alta correlacin entre el contenido de fenoles y los ensayos de capacidad antioxidante de DPPH, FRAP y ABTS.(Mahattanatawee et al.,2006)

Baja correlacin con el ensayo de b-caroteno y el contenido de vitamina C

Baja relacin entre el contenido de vitamina C y los ensayos de capacidad antioxidante de DPPH y FRAP y

El contenido de fenoles libres y la capacidad antioxidante (nicamente por las tcnicas DPPH y FRAP que fueron las que mejor correlacin tuvieron con el contenido de fenoles). Todas estas fracciones presentan menores valores de contenido de fenoles libres y de actividad antioxidante, en comparacin a los valores obtenidos con el extracto etanolito crudo.

El extracto etanlico obtenido a partir de la RB (en estado maduro) fue la que present mayor contenido de fenoles libres.

La mayor capacidad antioxidante por las tcnicas de DPPH y FRAP se present en el extracto etanlico de la guayaba blanca.
La variedad RR madura fue la que present un mayor contenido de vitamina C total con un valor de 277,43,32 mg /100 g. El estudio de actividad antioxidante en frutas ha permitido identificacion de los compuestos fenolicos,carotenoides y vitamina c.

Se

confirm a la guayaba como una fruta de gran valor nutricional.

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