CROMATOGRAFA

Sylvia V. Copaja C. Semestre Otoo 2013

DESARROLLO DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA En 1940, Martn y Synge desarrollaron la cromatografa de particin. Los componentes de la muestra son distribuidos entre dos fases lquidas. En la misma publicacin los autores sugieren de que un gas puede ser utilizado como fase mvil, es as como se desarrolla la cromatografa de gases (GC). Muy pronto surgen los primeros inconvenientes, ya que la tcnica solo permite el anlisis de muestras voltiles y termoestables

Es as como a comienzo de los aos 60 surge la posibilidad de utilizar un lquido como fase mvil y nace la cromatografa lquida (LC).

En LC la difusin de la fase mvil es lenta, comparada con la GC.

Por lo que la separacin no es del todo eficiente, por esto se concluye que disminuyendo el tamao de las partculas de la fase estacionaria, la eficiencia de la separacin mejora notablemente, obtenindose picos ms angostos, como se muestra en la siguiente figura

Sin embargo, con la disminucin del tamao de las partculas y el aumento de la densidad del empaque, fue necesario aumentar la presin para ayudar a la fase mvil a pasar a travs de la columna Esta cromatografa lquida a altas presiones se denomin: HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY Debido a que la presin por si misma no ayuda a los procesos de separacin se modific este nombre por: HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATROGRAPHY

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION HPLC La cromatografa lquida moderna comparada con la tcnica clsica se caracteriza por: Columna reusables de dimetro pequeo (2-5 mm) Columnas rellenas con partculas muy pequeas (3-50 m) Altas presiones de la fase mvil y velocidad de flujo controlado.

Detectores especiales, con deteccin continua para cantidades de muestras pequeas Instrumentos automatizados En general se conocen los siguientes tipos de cromatografa lquida de alta resolucin:

Cromatografa de reparto
Cromatografa de adsorcin. Cromatografa inica. Cromatografa de exclusin por tamaos o en geles.

REPARTO EN FASE NORMAL

REPARTO EN FASE INVERSA

Algunas caractersticas equipo HPLC son 1.- Versatilidad

deseables

en

un

Para ello debe estar equipado con: Sistema de operacin de alta presin Diversos detectores

Sistemas para recolectar fracciones a la salida de la columna.

Programadores de la fase mvil Controles de temperatura para la columna y el detector Controladores de flujo

2.- Rapidez Para obtener rapidez en el anlisis es necesario contar con, materiales de relleno de columna de alta eficiencia y que el instrumento posea sistemas de bombeo de alta presin para la fase mvil.

3.- Reproducibilidad Es caracterstica esencial si se quiere obtener del instrumento un funcionamiento efectivo a largo plazo

El instrumento debe proveer un control adecuado sobre los parmetros de operacin, tales como el flujo de la fase mvil, la temperatura, presin, composicin de la fase mvil, etc., para ello debe estar provisto de controles de temperatura y flujo, sistema de bombeo de alta presin, programadores de fase mvil, etc

4.- Sensibilidad Un buen instrumento, ha de ms de trabajar con pequeas cantidades de muestra, debe generar seales de intensidad apreciables La sensibilidad debe ser del orden de los nanogramos Alcanzar un caudal del eluyente razonable con columnas rellenas partculas de tamao entre 3 y 10 m, que son comunes en HPLC, requiere de presiones altas Como consecuencia e estas elevadas presiones, el equipo necesario para HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro

Limitaciones de un equipo HPLC Accesorios Caros Experiencia de aprox. 6 meses Falta de un detector universal

Ventajas en HPLC
Velocidad minutos Alta resolucin Alta sensibilidad (108 10)

INTRUMENTACION En la siguiente figura se presenta un diagrama esquemtico RESERVORIO FASE MOVIL BOMBAS FILTROS INTRODUCCION DE LA MUESTRA COLUMNA DETECTOR \ COMPUTADOR PROCESADOR DE DATOS

COLECTOR DE FRACCIONES

La fase mvil Excepto en la cromatografa de exclusin por tamaos, la fase mvil juega un rol muy importante en el sistema LC. En cromatografa lquida se puede utilizar una sola sustancia como fase mvil durante el anlisis o una mezcla de dos o ms sustancias. As, se puede mantener constante la composicin de la fase mvil durante el anlisis o cambiarla.

COMPOSICION FASE MOVIL CONSTANTE ELUCION ISOCRTICA COMPOSICION FASE MOVIL VARIABLE ELUCION EN GRADIENTE

La elusin en gradiente es utilizada en muestras cuyos componentes tienen diferentes polaridades, as un cambio en la polaridad de la fase mvil durante el anlisis mejorar la separacin.
Los cambios de fase mvil en el tiempo pueden ser de diversas formas, como se muestra en las siguientes figuras

Eligiendo una fase mvil El parmetro ms importante para elegir una fase mvil en cromatografa lquida es la solubilidad de la muestra. Si los componentes de la muestra no son solubles en la fase mvil, ellos podran no fluir por la columna. Otros parmetros importantes en la eleccin de una fase mvil son: Viscosidad Compresibilidad ndice de refraccin, Absorcin ultravioleta, Presin de vapor Punto de explosin

Las caractersticas fase mvil son:

ms importantes de toda

No degradar ni disolver la fase estacionaria Tener baja viscosidad

Ser compatible con el tipo de detector utilizado

Selectividad de la fase mvil Si el soluto interacta fuertemente con la fase mvil, el podra fluir rpidamente y tener un valor de K pequeo Las fuerzas de atraccin entre el soluto y la fase mvil son de cuatro tipos: Fuerzas de dispersin Interacciones Dipolo-Dipolo inducido Enlace de hidrgeno

Interacciones electrostticas

PREPARACION DE LA FASE MVIL La consideracin ms importante en la preparacin de la fase mvil es tener la seguridad de que se encuentra libre de partculas que puedan tapar los filtros, las vlvulas y la columna, llegando a daar el sello de las bombas

Los solventes grado HPLC tienen alta pureza, sin embargo, para una mayor seguridad se pueden filtrar utilizando filtros de 0,45 a 0,20 m
La segunda consideracin que se debe tener es des gasar la fase mvil, este procedimiento es necesario para prevenir las burbujas en todo el sistema

Los gases se pueden remover de la fase mvil burbujeando Helio, ultrasonicando o ultrasonicando con vaco. SISTEMAS DE BOMBEO

La funcin de una bomba HPLC es proveer un flujo continuo y reproducible en la columna Debido a que el tamao de las partculas es tan pequeo, la resistencia del empaque de la columna al flujo del lquido es considerable por esto la presin es del orden de los 5000 psi

Los requisitos para un sistema de bombeo HPLC son rigurosos e incluyen La generacin de presiones por encima de 600 psi Un flujo libre de pulsaciones

Un intervalo de flujo de 0,1 mL a 10 mL

El control y reproducibilidad de flujo excelente Componentes resistentes a la corrosin

Se utilizan tres tipos de bombas: Bombas recprocas, bombas de jeringa o desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante Las ms comunes 90% son las bombas recprocas, que consisten en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor Hay dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente controlan el flujo del disolvente hacia adentro y hacia fuera de un cilindro

Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 L) sus altas presiones a la salida, su fcil adaptacin a la elusin con gradiente y sus flujos constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente

CAMARA DE INYECCION
Esta parte del instrumento exige cuidadoso diseo puesto que debe resistir altas presiones, tener un volumen pequeo y sus cavidades deben ser bien barridas por la fase mvil

La muestra debe ser introducida como tapn, para obtener picos angostos En estas cmaras se introduce la muestra generalmente por medio de vlvulas inyectores o vlvulas de Loop

PROGRAMADORES DE FASE MVIL FASE MOVIL A BOMBA A FASE MOVIL B BOMBA B

\ GRADIENTE PROGRAMADO Y CONTROLADO CAMARA DE MEZCLADO COLUMNA

Los programadores de la fase mvil son de dos tipos, dependiendo del lugar en que esta ubicada la cmara de mezclado:

Cmara de mezclado solo permite gradiente lineal.

Cmara de mezclado que permiten todo tipo de gradientes. Las ventajas que ofrece una elusin en gradiente son:

Anlisis ms rpido Mejores separaciones Mayor simetra en los picos cromatogrficos Mejor detectabilidad

Por otra parte las desventajas son:

Difcil de efectuar cromatografa lquido-lquido Necesidad de regenerar la columna

Incompatibilidad con el detector en ciertos casos.

Registradores Su funcin es representar en un registro grfico la seal dada por el detector Controles de temperatura En muchos casos el control de temperatura que requiere la columna no necesita ser superior a 2 C, sin embargo, para trabajos ms precisos o cuando la metodologa lo requiere ser necesario un control ms exacto

Colectores de fracciones

Uno, del los mayores atractivos de la cromatografa lquida es la facilidad con que se pueden recolectar los componentes de la muestra analizada.

Lo ideal es trabajar con columnas ms grandes y detectores que no destruyan los componentes separados.

COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS En todo sistema cromatogrfico, ya sea en fase lquida o gaseosa la columna es el corazn del sistema puesto que en ella se lleva a cabo la etapa de separacin de los componentes de la mezcla en estudio.

Caractersticas generales
Bsicamente la columna consiste en un segmento de tubo de algn material inerte, de dimetro uniforme y capaz de resistir altas presiones. De entre todos los materiales, el acero inoxidable es el ms utilizado

La capacidad de la columna depende de su longitud, dimetro y material de relleno Hay columnas analticas y columnas preparativas. Las columnas analticas son muy eficaces, son de dimetro pequeo (2 a 3 mm) y efectan anlisis muy rpidos, su capacidad en cambio es muy limitada y la muestra debe ser entonces de tamao muy reducido, lo que exige un detector muy sensible

Las columnas preparativas materiales de mayor capacidad

se

rellenan

con

Estas columnas efectan la separacin en forma ms lenta y con una eficiencia menor Aunque no forman parte de la columna como tal, las conexiones entre columnas, as como entre la columna y el detector o inyector, deben adems de ser hermticas, tener un volumen muy pequeo

TEMPERATURA DE LA COLUMNA La columna puede ser utilizada a temperatura ambiente o temperatura elevada En cromatografa lquida, la temperatura puede ser utilizada por cuatro razones:

Reducir la viscosidad de la fase mvil, par mejorar los efectos de transferencia de masa
Aumentar la solubilidad de la muestra en la fase enlazada para obtener una ms alta eficiencia del sistema

 Aumentar la migracin de los iones en la cromatografa de intercambio inico Aumentar la solubilidad de la muestra en la fase mvil

FASES ESTACIONARIAS Todas las separaciones cromatogrficas realizadas por la fase estacionaria son

En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos de rellenos:

Partculas peliculares
Partculas porosas Las primeras consisten en bolas de vidrio o de polmero, no porosas, esfricas con un dimetro de 30 a 40 m

En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de intercambio inico Las bolas tambin se tratan qumicamente para obtener una capa superficial orgnica Por lo general los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn formados por micro partculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado

Al igual que en cualquier proceso cromatogrfico, la separacin en cromatografa lquida, se lleva a cabo mediante interacciones entre la muestra y la fase estacionaria La fase estacionaria puede ser un slido poroso del tipo de los usados en cromatografa de adsorcin, intercambio inico o exclusin Todos difieren en su composicin estructura y tamao de partcula qumica,

Los rellenos ms ampliamente utilizados, hoy da en HPLC son las llamadas fases enlazadas las que poseen larga duracin y no requieren acondicionamiento o restauracin de la fase mvil.

Las fases enlazadas se preparan por reaccin qumica entre los grupos hidroxilos de la superficie de las partculas de slice y una molcula orgnica lineal o un organosilano C18-Si-Cl3

SiOH +
H2O

Si-O-Si-C18 + 3HCI

El material enlazado puede ser: Octadecil-Si-O-Si; Ciano-Si-O-Si; Amino- Si-O-Si; Fenil-Si-O-Si.

En la figura se muestran algunas de estas fases enlazadas: