Procesamiento de Muestras

Txicos

que requieren pocos procesos de extraccin. Ej: T. Voltiles Txicos que necesitan procesos de extraccin, concentracin y limpieza de extracto. Ej: T.O.F Txicos que requieren mineralizacin. Ej: Tox. Minerales

CONSIDERACIONES GENERALES
Anlisis orientado : Procedimientos de extraccin y determinacin especificas para una determinada sustancia . Cuando los antecedentes del caso apuntan hacia la misma o si se quieren hacer determinaciones cuantitativas. Anlisis de drogas desconocidas: Esta modalidad implica la aplicacin de un screening para descartar el mayor nmero de txicos posibles e incluir un nmero reducido de ellos, hasta lograr la identificacin, pudiendo posteriormente aplicar una tcnica directa para aumentar la posibilidad de identificarlas.

Orientativos en placa o tubo. Poco especficos pero muy sensibles ejemplo Reactivo de TRINDER para salicilatos o FPN para triciclicos De screening CCD. Permiten ir descartando y afinando la bsqueda. Gran sensibilidad poco especificidad. De confirmacin, GCMS o HPLC De cuantificacin GC-MS, GC-FID, HPLC; etc.

Etapas

Preparacin de la muestra: Este paso es crucial en los anlisis. Generalmente involucra la homogeneizacin de las muestras, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrlisis (cida, bsica o enzimtica), precipitacin, centrifugacin, etc. Aislamiento del analito: El mtodo de aislamiento depender de la naturaleza del txico que se quiere aislar. Extracciones con sales y con solventes, o sea los mtodos de salting out. Extraccin en fase slida (SPE),

Concentracin del extracto: El objetivo de este paso es colocar el analito en el menor volumen posible y de esta manera aumentar la sensibilidad de los anlisis.
Identificacin del analito: En la identificacin del analito existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las tcnicas que se utilicen para la deteccin de las mismas. nivel primario: que utiliza tcnicas de separacin e identificacin como la cromatografa en capa delgada (TLC) y la espectrofotometra UV nivel secundario: (GC-MS, HPLC-MS).

Molienda y Liofilizacin: Para muestras slidas como hgado o contenido gstrico. Trituracin con Acido Tartrico y sulfato de Sodio Anhidro. Posterior Liofilizacin.

Hidrlisis Enzimtica: Se le aade a la muestra 60ul de una mezcla de Glucuronidasa /Arilsulfatasa y 1ml de buffer fosfato de pH=6 y se encuba 14hs a 37 C.

Hidrlisis Alcalina: Se le aade a la muestra 1ml de NaOH 0,1M y se coloca 24hs a 60 C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato.

Se la aade 1ml de H2SO4 0.05N y se encuba 12hs a 37C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato. Las columnas se activan con 2ml de metanol y 2ml de buffer fosfato de pH=6 lentamente y no dejando que se seque, se aplica la muestra, se lava la columna con 0,5ml de buffer fosfato y 1ml de una mezcla de buffer fosfato:metanol (80:20) y 1ml de cido actico 1M. Se espera 2 min y se deja secar bien la columna, se centrifuga si es necesario. Se eluye con 1ml de una mezcla de Hexano:Acetato de Etilo (80:20) (con esta mezcla se eluye el THC). Posteriormente se eluye con una mezcla de diclorometano:isopropanol:amonaco (80:20:2). (esta mezcla eluye drogas bsicas).

Tipos de Extracciones

Extraccin Lquido-Lquido en ampollas

ter de petrleo para Plaguicidas ter Etlico para Drogas de Carcter cido Cloroformo alcalino para D.C. Bsico

Extraccin slido-lquido: Columnas de Extrelut NT20, NT3 o bien SPE para HPLC, etc

Acondicionamiento de la columna Aplicacin de la muestra. Lavado de la columna Ajuste de pH (si se lo requiere) Secado de la columna. Elucin de la droga. Concentracin del extracto.

A T ambiente y con corriente de N2. Redisolver el extracto y proceder a limpieza segn la extraccin, neutra cida o bsica por columnas con fluorosil arena lavada, etc. o por diferentes densidades o por diferentes pH.

As se obtiene un extracto limpio

FRACCIN ETER DE PETRLEO CIDO: Se agrega al extracto seco 5ml de alcohol al 30% v/v, se filtra en fro y sobre la solucin se hace la investigacin toxicolgica. FRACCIN ETER ETLICO CIDO: Agregar 10ml de agua destilada, calentar levemente para favorecer la disolucin del residuo. Enfriar. Llevar a pH=3 con cido sulfrico al 1% . Extraer con 20ml de ciclohexano:cloroformo (25:75). Agitar durante 5min. Filtrar la mezcla orgnica en un embudo de papel de filtro conteniendo una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro, para eliminar los vestigios de humedad. Evaporar y retomar en 1ml de metanol. FRACCIN ETER ETLICO ALCALINO y FRACCIN CLOROFORMO ALCALINO : Tomar el residuo con algunos mililitros de cido sulfrico 5%. Extraer con ter etlico. Desechar la fraccin orgnica. Alcalinizar la fraccin acuosa restante con amoniaco y extraer 3 veces con porciones de 10ml de ter etlico. Filtrar ,evaporar y retomar con 1ml de metanol.

Inmunoensayos Los mas utilizados son el IEE (Inmuno Ensayo Enzimtico), el RIE (Radio inmuno Ensayo), IEF (Inmuno Ensayo Fluorescente), y el IEA (Inmunoensayo por Aglutinacin). Las reacciones de coloracin directamente en la orina tienen un uso limitado, solo algunas drogas pueden ser ensayadas por ejemplo: salicilatos, hidrocarburos halogenados, paracetamol, etc. Ejemplo 2 gotas de orina+Cloruro frrico 5% (2 gotas) Violeta: posibles salicilatos

-EXTRACTO FUERTEMENTE CIDO: Tricloruro frrico Folin-Ciocalteu Liebermann Nessler Diazotacin Koppanyi-Zwikker -NEUTRO: Koppanyi Zwikker Liebermann Nessler -BSICO: P-Dimetilaminobenzaldehdo Cloruro frrico Formaldehdo Sulfrico Forrest FPN Mandelin Marquis

REACCIONES CROMTICAS

En el screening por TLC y HPTLC se utilizan placas de silicagel 60 GF254nm (con indicador de fluorescencia), y lo que vara son las fases mviles y los sistemas de revelado.

Placas Silicagel GF 254 Cloroformo:Acetona (8:2)

1) Uv 254 y 366nm. 2) Acetato de cobalto en metanol 0.5% 3) HgSO4 (5g deHgO + 20ml de H2SO4) 4) Trinder o Cl3Fe

Placas Silicagel GF 254 Metanol:Amoniaco (100:1,5) 1) UV 254 y 366nm 2) Rociado con HCl 10% 3) Observacin UV 366nm (fluorescencia) 4) NQS 5) IodoplatInato 6) Draggendorf

. Cuantificacin del analito:

Una vez identificado el analito la cuantificacin del mismo se puede realizar por una tcnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para anlisis. (GC-MS, HPLC-MS).

BIBLIOGRAFA

-Caferata Nores La prueba en el proceso penal -Gisber Calabuig Tratado de medicina legal y toxicologa -Tratado de criminalstica, tomos I y II, La qumica analtica en la investigacin del delito.