CINETICA ENZIMATICA

Dr. Ronald Navarro Oviedo Departamento Acadmico de Biologa U.N.S.A

1. IMPORANCIA DE LA CINETICA ENZIMATICA

Conocer la velocidad de la reaccin Conocer el mecanismo de accin variando las condiciones de la reaccin Conocer las mejores condiciones para la accin de la enzima y el efecto de varios factores sobre esta. Ayuda a entender muchos fenmenos biolgicos Sin un conocimiento de la cintica de una enzima no se puede saber cmo trabaja en trminos qumicos o cmo funciona en la clula

2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN ENZIMTICA

Son varios y determinan las curvas de progreso de las reacciones enzimticas Por tanto, es difcil derivar las ecuaciones cinticas que representan las curvas de progreso [E], [S], pH, Temperatura, inhibidores, activadores, fuerza inica, constante dielctrica, etc.

EFECTO DE LA ( E)

La velocidad es proporcional a la [ E]) v = k[ E] Esto se da en la gran mayora de casos (caso normal) Pero hay desviaciones en algunos casos

[E]

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBA: hay dos posibles causas

a) Presencia de pequeas cantidades de alguna impureza altamente txica en uno de los componentes de la mezcla, pero no en la solucin enzimtica misma Ejm. Iones metlicos pesados, presencia de pequeas de Cu en el buffer o en el agua destilada usada

Efecto de las impurezas txicas en los reactivos, pero no en la solucin enzimtica

[E]
Proporcional a la impureza txica

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBA

b) Presencia de un activador disociable o coenzima en la preparacin enzimtica E + A EA Por tanto el porcentaje de la enzima que est en la forma activa aumenta conforme aumenta la concentracin del activador en la mezcla de incubacin (el activador est siendo aadido junto con la enzima, por tanto una cantidad creciente de la enzima estar en la forma activa)

Efecto de un activador o coenzima que est en la preparacin enzimtica. Arilsulfatasa

Concentracin constante y ptima de ClNa o.o5 M

B
mg p-NO2f /hora

Arilsulfatasa parcialmente purificada y dializado frente a ClNa

ml enzima (dializada frente a ClNa)

Efecto de un activador o coenzima disociable. Ficina

Con activador cianuro

Con activador tioglicolato

Sin activador

[E]

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBA

Un caso interesante se da cuando la enzima ctiva consiste en un complejo de subunidades que son inactivas individualmente. Al aumentar la concentracin se favorece la agregacin

Efecto de la asociacin de subunidades. Fosfofructoquinasa

200 MATP + 200 M AMP

A
V (moles por minuto

+ 500 M ATP

C
500 M ATP + 500 M citrato

[E] g por ml
El

AMP se une a la forma agregada, y empuja el equilibrio hacia la forma activada El citrato se une a la forma inactiva El ATP se une a ambas formas, pero a altas concentraciones favorece la disociacin

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJO

Es mas comn que el caso anterior; hay varias causas posibles. a) Hay una limitacin en la capacidad del mtodo para estimar la actividad de la enzima en lugar de una disminucin de la actividad de la enzima Ejm. Cuando el mtodo depende de la adicin de una segunda enzima, la actividad de esta ltima pone un lmite a la primera

Limitacin de la velocidad por el mtodo de prueba

v B

[E]

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJO

b) Puede haberse aadido una enorme cantidad de enzima P. ej. Si la enzima tiene alta afinidad por una coenzima, toda estar unida a la enzima y no estar disponible para reaccionar con las otras enzimas u otras molculas enzimticas. Ejm. Lactato deshidrogenasa

Efecto de una cantidad muy grande de enzima en un sistema complejo. Ejm. Lactato deshidrogenasa
Velocidad (M de O2 en 10 minutos)

[E] log de los mg de deshidrogenasa

Lactato

+ lactato deshidrogenasa + NAD+ + flavoprotena + azul de metileno + O2

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJO

c) Se ha medido el cambio en un periodo de tiempo dado, en lugar de las velocidades iniciales Se debe al agotamiento del S y formacin de inhibidores. Ejm. Aldolasa

[E]

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJO

d) La preparacin enzimtica contiene un I irreversible que se combina con la E para dar un complejo inactivo EI: E + I EI Por lo tanto, el % de enzima inactiva aumenta conforme aumenta la [I] en la mezcla de incubacin

Efecto del inhibidor reversible en la preparacin enzimtica. Arilsulfatasa

Con extracto dializado (se elimina el fosfato)

B
de p-nitrofenol por hora

A
Hidrlisis por un extracto no dializado (inhibicin por fosfato)

ml de enzima (extracto crudo de hgado)

Sustrato:

p-nitrofenilsulfato

Efecto del inhibidor reversible aadido a la preparacin enzimtica. Tripsina

A
Unidades de tripsina encontradas Solucin pura de tripsina

B
Solucin de tripsina + inhibidor de tripsina

ml de solucin de tripsina

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO

El estudio de la cintica enzimtic se inici en 1902 con el trabajo de Adrian Brown acerca de la hidrlisis de la sacarosa por la invertasa de levadura (hoy b-fructofuranosidasa) Sacarosa + H2O Glucosa + Fructosa A altas concentraciones de sacarosa la velocidad es independiente de la sacarosa, por eso propuo que la reaccin total est compuesta de dos etapas en las cuales el S forma un complejo con la E, el cual se descompone en productos y E E + S

k1

k-1

ES

kp

P + E

V = d[P]/dt = kp[ES] Velocidad total d produccin de [ES] d[ES]/dt = k1[E][S] - k-1[ES] - kp[ES]

Sin embargo, esta ecuacin no puede ser integrada explcitamente sin hacer simplificaciones. Hay 2 posibilidades 1. Suposicin del equilibrio (1913) Leonor Michaelis y Maude Menten, usando los datos de Victor Henry, asumieron que k-1 kp, de modo que la primera etapa de la reaccin alcanza el equilibrio Ks = k-1/k1 =[E][S]/[ES] 2. Suposicin del estado estable (1925) Briggs y Haldane d[ES]/dt = 0

1. Ecuacin de Henri, 1903

V = K[S]/1 + [S]/Ks Ks = k-1/k1 = [E][S]/[ES] La derivacin de la ecuacin de Henri en las suposiciones que:

Suposiciones de Henri

1. La enzima es un catalizador (propuesto por Berzelius en 1833 1837) 2. La enzima y el sustrato reaccionan rpidamente para formar un copmplejo ES (propuesto en 1902 por Brown) 3. Un solo S y un solo complejo ES estn implicados y el complejo ES se rompe directamente para formar E libre y producto 4. La E, el S y el complejo ES estn en equilibrio; es decir, la velocidad con que se disocia ES a E + S es mucho mayor que la velocidad a la que ES se rompe para formar E + P (suposicin del cuasi equilibrio o equilibrio rpido; k-1 >> kp) 5. La [S] >> [E], de modo que la formacin de un complejo ES no altera la [S] 6. La velocidad total de la reaccin est limitada por la descomposicin del complejo ES para formar E libre y producto 7. La velocidad se mide durante los estados muy tempranos de la reaccin, de modo que la reaccin inversa es insignificante ( se mide velocidad inicial)

2. Ecuacin de Michaelis-Menten (1913); Briggs-Haldane (1925)

v Vmax

Vmax/2

Km

[S]

3. Ploteo de v frente a pS (=-log S) Kuhn (1923)

v

Vmax

Vmax/2

pKm

pS

4. Ecuacin de Hanes-Woolf (1932): multiplicando todo la ecuacin anterior por [S]

[S]/v

1/Vmax Km/Vmax -Km [S]

5. Ecuacin de Woolf Augustinsson Hofstee (1932): a partir de la ecuacin de Michaelis dividiendo numerardor y denominador por [S] y simplificando

Vmax

-Km

Vmax/Km

v/[S]

6. Ecuacin de Lineweaver Burk (1934): dobles inversas

1/v

Vmax/Km 1/Vmax -1/Km 1/[S]

7. Ecuacin de Eadie Scatchard (1949): a) dividiendo numerador y denominador por [S]; b) dividiendo ambos miembros por Km
Vmax/ Km

v/[S]

-1/Km

Vmax

8. Mtodo de Dixon (1972)

v eT

S0

S1

S2

Km

S3

Km

S4

Km

S5 Vmax

[S]

9. Mtodo de Eisenthal, Cornish-Bowden (1974)

Vmax v

Km

[S]

Figura

8 Efecto de la concentracin del sustrato pNPP sobre la actividad de la Fac-IV de trigo (Triticum aestivum L.) var. Gaviln. Representacin grfica de Michaelis-Menten Las condiciones de ensayo se indican en 2.6 y 2.8.3 (Tasis Salvador Galdos Galvan, 2002)

Figura 9 Efecto de la concentracin del sustrato pNPP sobre la actividad de la Fac-IV de trigo (Triticum aestivum L.) var. Gaviln. Representacin grfica de dobles recprocas de Lineweaver-Burk. Las condiciones de ensayo se indican en 2.6 y 2.8.3 (Tasis Salvador Galdos Galvan, 2002)

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la fosfatasa acida de quinua (Faq-I)

En este grfico se representa la ecuacin v = Vmax [S] / KM + [S], segn la cintica de Michaelis-Menten, la cual muestra la variacin de la velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato. Tesis: Jos Arce Flores, 2002)

Representacin grfica de Lineweaver-Burk

La figura muestra la grfica de dobles inversas, en la que se representa 1/v frente a 1/[S], segn la ecuacin 1/v = KM/Vmax[S] + 1/Vmax. La extrapolacin de los datos nos permite calcular los valores de Vmax y KM. (Tesis: Jos Arce Flores, 2002)