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Karina Orozco
ADN
Es el material gentico presente en todas las clulas y algunos virus
Cmo lo estudiamos?
Virus
Fagos: infectan bacterias (T-pares, l)
Fago virulento: ltico Fago temperado: lisgeno
Grandes cantidades en poco tiempo (1011 partculas de fago/ml de cultivo bacteriano Genomas pequeos
Endonucleasas de restriccin
Enzimas que cortan al ADN en lugares especficos (secuencias palindrmicas)
SfiI
TaqI
aLa
Streptomyces fimbriatus
Thermus aquaticus
GGCCNNNNNGGCC
TCGA
enzimas tiene el nombre de acuerdo a la especie de la que se aislaron, seguida de un nmero para distinguir las diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (ej. HpaI and HpaII). b Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia en una sola de las hebras del DNA. N representa cualquier base
Electroforesis
Digestin con Eco RI
Electroforesis en gel
Electrodo (-)
Electrodo (+)
Electroforesis
Visualizacin: se tien (bromuro de etidio) y fotografan
Mapas de Restriccin
ADN se trata con diferentes endonucleasas de restriccindiferentes tipos de corte. til para genomas pequeos (virus, plsmidos)
Vectores de transferencia
Medio de transferencia para clonacin de genes Ej. Fagos, plsmidos, BACs, YACs
bacterifagos
Transbordan segmentos hasta de 15 kb Tiene un sitio de restriccin para insercin del DNA Infectan a cultivos de E. coli
Cada fago forma una calva nica y se aisla cada ADN recombinante
Plsmidos
Pequeas molculas de DNA circular que se replican independientemente dentro de una bacteria Poseen tres zonas de inters: Origen de replicacin Gen de resistencia a antibiticos (ampicilina) Donde se inserta el DNA a clonar
1. 2. 3.
Plsmido
plsmidos
Manipulacin ms fcil que con fagos Se tratan el plsmido y DNA con endonucleasa de restriccin Se unen con la ligasa Se coloca el plsmido recombinado en clula huesped Se reproducen la bacteria y el plsmido
csmidos
Contiene secuencias de fago l para ser empaquetado dentro de un fago Posee origen de replicacin y gen resistencia a antibiticos
ADN recombinante
Molcula que contiene ADN de fuentes diferentes
Molculas de ADN de fuentes diferentes se tratan con la misma endonucleasa de restriccin (digestin) Los fragmentos obtenidos se insertan en el vector de transferencaia y sellan con ADN ligasa Se obtiene el ADN recombinante y se introduce a una clula (transformacin o transfeccin) para clonarlo o amplificarlo Se seleccionan las clulas con el ADN recombinante de inters (marcador)
Se identifican los clones que contienen el ADN de inters (sonda radiactiva de ADN)
PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa Mtodo ms rpido para aislar y clonar (amplificar) cidos nucleicos En un termociclador Reactivos:
Taq polimerasa (polimerasa termorresistente) dNTPs Primers (cebadores) para iniciar sntesis de DNA
Secuenciacin de ADN
Determinar el orden lineal de las bases en el ADN
Mtodo de Sanger
Utiliza dideoxinucletidos Separa fragmentos por electroforesis
Genomas
Se han secuenciado varios genomas (humano 2003) Evolucin, fisiologa y enfermedad Cuntos genes? Cundo y en qu tejidos se expresan? 1-2% genoma humano codifica protenas normalmente Qu protenas se producen, cmo funcionan e interactan con otras? Protemica
Genomas
La secuencia de bases entre individuos solo difiere un 0.3% Variaciones: SNPs o polimorfismos de un nico nucletido Utilidad: base gentica de enfermedades:
Cncer de colon y mama Diabetes Alzheimer
FISH
Sonda de ADN radiactiva se hibrida con ADN desnaturalizado Diagnstico: evidencia una mutacin puntual o delecin