Tincin de Gram

Kilmara Ayala Kiara Caballero

Tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas.

Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884.

Se utiliza para referirse a la morfologa celular bacteriana como para realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana.

Cmo visualizo las bacterias?

Bacteria Gram positiva Se visualizan de color moradas. Bacteria Gram negativa Se visualizan de color rosa o rojo.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es Peptidoglicano.

La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodoyoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2cristal violeta.

Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen.

La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une Peptidoglicano). La delgada capa de Peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.

Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms Peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.

Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Habitualmente se utiliza un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica (coloracin de contraste), en la que las clulas gramnegativas se presentan rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.

El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua. Decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.

Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

El cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas a travs de la pared bacteriana.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la Safranina o la Fucsina.

Explicacin

El Lugol acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.

Alcohol-acetona, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.

3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta yodo.

2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gramvariables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Bacterias resistentes a la tincin Gram:

Bacterias de naturaleza grampositiva que tien como gramnegativas

Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y Esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

Edad de la bacteria.

Causas que alteran la tincin de Gram

Errores del operador.

Uso de antibiticos.

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao.

Bacilos
Grandes variaciones morfolgicas.

Espirales
Treponemas, Borrelias.

Tincin GRAM: Bacterias Gram Positivas

Cocos Grampositivos

Staphylococcus sp, como S. aureus

Racimos: forma tpica de

Cadenas: forma tpica de

Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus

grupo B.

Micrococcus sp

Ttradas: forma tpica de

Bacilos Grampositivos

Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Gruesos: Forma tpica de

Finos: Forma tpica de Listeria sp

Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Ramificados: Forma tpica de

Tincin GRAM: Bacterias Gram Negativas

Cocos Gramnegativos

meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con

morfologa de diplococos.

Diplococos: Forma usual de Neiseria sp, como N.

Cocobacilos: Forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gramvariable.

Bacilos Gramnegativos

Bacilos finos: Forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: Forma usual de

Haemophilus sp, como H. influenzae