Facultad de Ciencias Agroalimentarias y del Ambiente. Departamento de Tecnologa de Alimentos Contenido Fermentacin lctica, fermentacin actica y fermentacin ctrica.

Elaborado por: Popita

Introduccin
Fermentacin:
El trmino fermentacin es entendido de forma distinta en el contexto de la biologa celular que en el contexto industrial. En el sentido biolgico la fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, que no requiere oxgeno, siendo el producto final un compuesto orgnico.
En el contexto industrial, se denomina fermentacin a un proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza en condiciones aerbicas como anaerbicas. En la industria la fermentacin puede ser oxidativa, es decir, en presencia de oxgeno, pero es una oxidacin aerbica incompleta, como la produccin de cido actico a partir de etanol.

Tipos de fermentacin:
Fermentacin alcohlica. Fermentacin lctica. Fermentacin actica. Fermentacin butrica. Fermentacin malolctica. Fermentacin maloalcohlica. Fermentacin propinica. Fermentacin cido-mixta. Fermentacin ctrica.

Fermentacin lctica.
La fermentacin lctica Es un tipo de fermentacin en la cual el cido lctico es el producto principal de la fermentacin de la glucosa. En ella las 2 molculas de cido pirvico formadas en la gliclisis son reducidas por 2 molculas de NADH para formar 2 molculas de cido lctico como producto final de la reaccin, teniendo un rendimiento energtico de 2 ATP por molcula de glucosa.

Para que se inicie a partir de la lactosa es necesario que se produzca una escisin hidroltica (la enzima hidroltica cataliza la escisin o desdoblamiento de un enlace mediante hidrlisis) de la misma, por accin de una enzima: lactasa. C12H22O11 -------- 2C6H12O6

Bacterias cido lcticas (BAL):

Son bacterias Gram (-), no esporuladas, inmviles, anaerobias aerotolerantes. Son bacterias catalasa negativa. La mayora son mesfilas, pero tambin hay algunas pocas termfilas. Su metabolismo es fermentador.

Clasificacin.
Las bacterias cido lcticas pertenecen al phylum Firmicutes que comprende alrededor de 20 gneros: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenooccus, Vagococcus y Weisella son los principales miembros de las BAL, siendo Lactobacillus el ms grande de estos gneros.

Segn su fermentacin:
Bacterias homofermentativas El grupo homofermentativo compuesto de Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus y Streptococcus. Utilizan la ruta Embden-Meyerhoff-Parnas al convertir 1 mol de glucosa en dos moles de cido lctico, adems que se producen ms del 85% de cido lctico a partir de glucosa.

 Bacterias heterofermentativas Producen solamente 50% de cido lctico. Estas fermentan 1 mol de glucosa para formar 1 mol de cido lctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2. 1 mol e ATP es generada por mol de glucosa. Este grupo est compuesto por los gneros: Lactococcus, lactobacillos, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus.

Segn su temperatura
Mesfilas -Temperatura ideal de incubacin 20-25C. -volumen de cultivo lquido 1-2%. -Tiempo de incubacin: 18-20 horas. -Acidez final 0.8% de cido lctico.

Especies: Lactococcus lactis subs lactis, Lactococcus lactis subs cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides subs cremoris.
Se utilizan en la elaboracion de: Kumis, Quesos semi-madurados

 Termfilas: -Temperatura ideal de incubacin: 40-45C. -Volumen de cultivo lquido 2-3%. -Tiempo de incubacin: 2-4 horas. -Acidez final 0.9% de cido lctico.

Especies: Lactobacillus delbruekii subs bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum y Streptococcus salivarius subs thermophilus.
Se utiliza en la elaboracin de: yogurt, y quesos madurados

Microorganismos ms usados
De las BAL, Lactobacillus delbrueckii es el microorganismo ms utilizado en la produccin a gran escala de cido lctico, ya que tiene la ventaja de producir nicamente ismeros L (+), consumir eficientemente glucosa y ser un microorganismo termfilo con temperatura ptima de crecimiento 41.5C, lo que reduce costes de enfriamiento y esterilizacin, as como riesgos de contaminacin microbiolgica en el fermentador. Este microorganismo crece bien a un pH entre 5,5 y 6,5 por lo que el cido producido debe ser continuamente neutralizado.

Existen tres rutas metablicas de degradacin de carbohidratos a lctico: Ruta homofermentativa: Su nico producto final es el cido lctico. Su ecuacin global es:
Glucosa + 2ADP + 2Pi --------- 2 cido lctico + 2 ATP

Ruta heterofermentativa: Su producto final no es exclusivamente cido lctico. Su ecuacin global es:
Glucosa + ADP + Pi ---- cido lctico + etanol + CO2 + ATP

Ruta bifidum: Bifidobacterium bifidum produce 1.5 moles de acetato y una de lactato por mol de glucosa.

Materia prima
Los amilceos son fuente de polisacridos (principalmente almidn) baratos, abundantes y renovables. Las materiales amilceos utilizados incluyen el sorgo (4.08 % almidn), la paja de trigo (54% almidn), el maz, la yuca (27% almidn), el ame, la papa. Sin embargo estos materiales deben ser hidrolizados hasta azucares fermentables. Es la melaza que contiene sacarosa (31%), glucosa (9.5%), fructosa (10%) y nitrgeno (0.95%). Este es un sustrato completo para la produccin de cido ctrico.

 El lactosuero es uno de los principales subproductos de la industria lctea, contiene aproximadamente 4.8% p/v de lactosa, 0.8% p/v de protena, 0.5% de grasa, 0.6% p/v de minerales y vitaminas y 0.05% de cido lctico. Los dos tipos comunes de suero son el dulce y el cido exitosamente usados en la produccin de cido lctico, suplementado son extracto de levadura y con glucosa.

Parmetros de relevancia en la produccin de cido lctico

pH: el pH ptimo para la produccin de cido lctico vara entre 5.0 y 7.0. Un pH menor a 5.7 ha sido ptimo para las cepas de Lactobacillus. El pH de la fermentacin puede fijarse al comienzo y permitirse disminuir debido a la produccin del cido, o puede ser controlado por titulacin, extraccin, absorcin o electrodilisis del cido lctico. Temperatura: la temperatura que da mayores productividades es en algunos casos menor que la temperatura que resulta en el mayor rendimiento y concentracin de cido lctico. Para el lactobacollus casei y L. paracasei la temperatura ptima es de 37 y 44 C.

 Inmovilizacin y recirculacin de clulas: las clulas de BAL pueden ser rerciculadas o inmovilizadas en soportes slidos. La recirculacin de clulas ha dado mayores concentraciones de cido lctico y rendimientos iguales y mayores. Fuente de carbono: azcar puro (bajo costo en purificacin pero alto costo de obtencin), se obtiene el producto ms puro. La glucosa arroja mayores concentraciones de cido lctico y rendimiento que otros azcares.

 Fuente de nitrgeno: Las concentraciones de la fuente de nitrgeno en el medio de cultivo se encuentran, por lo general, entre 10 y 25 gr/L, mostrando que la adiccin de nutrientes y concentraciones ms alta de estos, tienen un efecto positivo en la produccin de cido lctico.

Procesos de obtencin:
Fermentaciones continuas: -Al sustrato puro se le adiciona una fuente de
vitaminas y de cofactores, se utiliza una mezcla de de 10 a 15% de glucosa, cantidades menores de fosfato de amonio, extracto de levadura y 10% neutralizante. -El medio se inocula y se agita sin aireacin para optimizar la neutralizacin del cido formado.

-La fermentacin dura entre 2 a 4 das y se termina cuando todo el azcar es consumido, con el fin de facilitar la purificacin.

-Al final de la fermentacin el medio es ajustado a pH 10 y si se utiliza carbonato de calcio, el medio es calentado para solubilizar el lactato de calcio y coagular protenas presentes.

-Posteriormente el medio se filtra para eliminar sustancias insolubles, as como biomasa. -El cido libre se obtiene por adicin de cido sulfrico seguido de filtracin para eliminar el sulfato de calcio formado.
-El cido lctico es entonces concentrado por evaporacin.

Debido a que el tipo de fermentacin descrito (en discontinuo) est limitado por el dao que sufren las clulas por la acumulacin en el medio de fermentacin de la forma no disociada del cido, se han investigado otros modos de fermentacin como son: Fermentaciones batch (lote): el proceso batch consiste en realizar una alimentacin inicial con todos los nutrientes necesarios para el microorganismo dentro del reactor, para que este se reproduzca en forma exponencial hasta el momento en que se agote el sustrato. Fermentaciones fed-batch (lote alimentado): el proceso fed-batch consiste en suministrar los nutrientes al microorganismo durante el proceso fermentativo sin la eliminacin del medio agotado, esta corriente de alimentacin puede ser suministrada de forma continua, con flujos variables o constantes, o de forma discontinua en forma de pulsos.

Procesos de separacin:
Extraccin reactiva: usa la reaccin entre el extractante y el material a ser extrado. El extractante en la fase orgnica reacciona con un material en fase acuosa y el complejo que reacciona es solubilizado en la fase orgnica. El acido lctico es recuperado de la capa orgnica mediante una desorcin. Esterificacin y destilacin reactiva: la esterificacin es el nico proceso de separacin que separa el cido lctico de otros cidos orgnicos. El cido lctico de alta pureza puede ser separado mediante la formacin de un ster al reaccionar el cido lctico con alcohol. Posteriormente, la purificacin del ster se da por destilacin o extraccin y luego se realiza su conversin en cido lctico. La destilacin simultnea con esterificacin-hidrlisis es llamada destilacin reactiva.

Aplicaciones en la industria alimentaria

La fermentacin lctica es usada en todo el mundo para producir variedad de comidas: Mundo Occidental: yogur, panes de pan fermentado, chucrut, encurtidos de pepino y aceitunas. Medio Oriente: verduras en escabeche. Corea: kimchi (mezcla fermentada de col china, rbanos, rojo Pimienta, ajo y jengibre). Rusia: kfir. Egipto: rayab de laban y zeer de laban (leche fermentada), kishk (mezcla de leche fermentada y cereal).

 Nigeria: gari (mandioca yuca fermentada). Sudfrica: magou (avena de maz fermentada). Tailandia: nham (cerdo fresco fermentado). Filipinas: balao de balao (mezcla de langostino y arroz fermentado). Pickles: verduras (col, nabo, remolacha roja, pepinos) sometidas a una fermentacin lctica. La choucroute es la ms conocida y disponible.

Fermentacin actica
Se puede definir como la oxidacin bioqumica del etanol contenido en un sustrato alcohlico, para formar cido actico. Esta oxidacin es producida por bacterias acticas, que realizan dicha transformacin exotrmica para tomar energa para su desarrollo. La oxidacin del etanol se realiza en dos etapas: en la primera el etanol se oxida a acetaldehdo y en la segunda el acetaldehdo a cido actico.

El ataque del alcohol por las bacterias se produce en presencia de oxgeno, es decir en aerobiosis, la transformacin global producida puede resumirse as:
CH3 CH2OH + O2 + Acetobacter aceti ------- CH3 - COOH + H2O

Este proceso se utiliza para la fabricacin de vinagre y es adems el causante de la alteracin conocida como picado actico de los vinos.

Bacterias acticas
Lo que caracteriza a las bacterias acticas es su notable capacidad de oxidar el etanol a cido actico a pH cido. Son aerobias estrictas y Gram negativas. Las que se utilizan para la produccin de vinagre pertenecen al gnero Acetobater, las principales especies, en orden de importancia segn su rendimiento fermentativo, son: Aceti, Pasteurianum, Suboxydans, Oxydans, etc. Para que las bacterias acticas puedan desarrollarse de forma adecuada, el medio debe estar oxigenado, es decir en continuo y constante contacto con el aire, as como a temperaturas superiores a 20 C.

Procesos de obtencin
Fermentacin oxidativa: La reaccin qumica general facilitada por estas bacterias es:

C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O

Una solucin diluida de alcohol, inoculada con Acetobacter y mantenida en un lugar clido y aireado se har vinagre en el transcurso de algunos meses. Los mtodos industriales de preparacin de vinagre aceleran este proceso al mejorar el suministro de oxgeno a las bacterias.

La mayor parte del vinagre hoy en da es hecho en cultivo de tanque sumergido, descrito por primera vez en 1949 por Otto Hromatka y Heinrich Ebner. En este mtodo, el alcohol se fermenta a vinagre en un tanque agitado continuamente, y se suministra oxgeno burbujeando aire a travs de la solucin.

Usando aplicaciones modernas de este mtodo, se puede preparar vinagre de 15% cido actico en slo 24 horas en un proceso por lotes, incluso de 20% en 60 horas.

 Fermentacin anaerbica El proceso metablico se basa en la conversin del etanol, bajo la accin de la alcohol deshidrogenasa, en acetaldehdo y del acetaldehdo hidratado en cido actico por la accin de la acetaldehdo deshidrogenasa:
C 2 H 5 OH CH 3 CHO + H 2 O CH 2 CH(OH) 2 CH 3 COOH+ H 2 O

-Producto: vinagre (solucin diluida de cido actico) -Materia prima : etanol purificado diluido. -Fuente de nitrgeno y una combinacin apropiada de minerales. -Micro organismos empleados: bacterias cido-Lcticas los gneros Acetobacter y Gluconobacter.

Algunas especies de bacterias anaerbicas, incluyendo miembros del gnero Clostridium, pueden convertir los azcares en cido actico directamente, sin usar etanol como intermediario. La reaccin qumica total llevada a cabo por estas bacterias puede ser representada por: C6H12O6 3 CH3COOH Ms interesante desde el punto de vista de un qumico industrial es el hecho que estos acetgenos pueden producir cido actico a partir de compuestos de un carbono, incluyendo metanol, monxido de carbono, o una mezcla de dixido de carbono e hidrgeno: 2 CO2 + 4 H2 CH3COOH + 2 H2O

Aplicaciones en la industria alimentaria

El cido actico es usado como: Conservante, previniendo el crecimiento de bacteria y hongos. As mismo, es agregado en la mayonesa para incrementar el efecto de inactivacin contra la salmonella. Un ingrediente verstil de las comidas como resaltador de sabor o condimentos. Un ablandador de carnes.

Fermentacin citrica
Generalidades del acido ctrico: El acido ctrico producido actualmente rebasa las 300000 toneladas al ao. A diferencia de muchos otros productos que previamente eran elaborados por mtodos microbiolgicos y en la actualidad se producen por va qumica, este cido se produce en su totalidad por fermentacin.

Microbiologa del cido ctrico:

Varios microorganismos han sido descritos como productores de cido ctrico predominando los gneros de Aspergillus y Penicillium. En 1917 Currie demostr que especies de Aspergillus niger acumulaban cido ctrico a la par con cido oxlico. Posteriormente definieron las condiciones de cultivo que reducan considerablemente la produccin del cido oxlico contaminante. A partir de entonces, variedades de A. niger han dominado la produccin industrial, fundamentalmente porque su fisiologa es ms conocida que la de otros hongos y porque utiliza materias primas de bajo costo como melazas de caa.

Durante la dcada de los 60 surgieron varios reportes de levaduras, en particular miembros del gnero Candida, con capacidad productora del cido ctrico a partir de hidrocarburos, con rendimientos cercanos al 100%. Esta lnea, sin embargo, pronto fue relegada debido al creciente precio del petrleo. Avances posteriores revelaron que levaduras, as como bacterias, pueden acumular acido ctrico a partir de glucosa, abriendo un nuevo campo de estudio en el que se trabaja intensamente.

Aspectos nutricionales
Los factores nutricionales ms importantes para una produccin exitosa son la concentracin y tipo de carbohidratos y el contenido de metales. Carbohidratos: El medio industrial ms usado son las melazas, tanto de caa como de remolacha. Esta ltima son en ocasiones preferidas por presentar un mayor contenido de nitrgeno. Se requiere una concentracin particularmente alta de azcares entre 140-240 g/l. Concentraciones menores conllevan a acumulacin de cido oxlico y una baja relacin ctrico/biomasa.

 Fuente de nitrgeno y fosfato: Esta debe ser baja, del orden 0.1-0.4 g/l y proporcionado preferiblemente por sales de amonio como sulfato o nitrato. Se ha reportado que un consumo total del nitrgeno en el medio es prerrequisito para el inicio de la acumulacin de cido ctrico. En ocasiones el contenido de nitrgeno puede ser alto en tanto el fosfato se mantenga bajo. El fosfato juega un papel regulador importante de reacciones metablicas. El contenido recomendado se encuentra entre 0.1 y 0.2 %. Concentraciones mayores promueven el crecimiento vegetativo a costa del rendimiento en cido ctrico.

 Contenido de metales Los ms importantes son Fe, Mn. Otro metal de importancia es el Cu funciona como antagonista de Fe y Mn reduciendo el efecto negativo de exceso de estos metales. Finalmente, un medio bajo en metales favorece el crecimiento del hongo en forma de partculas o pellets. En el cultivo sumergido esta morfologa es preferible porque resulta en medio de menor viscosidad, en comparacin al crecimiento filamentoso, que se traduce en menores costos de aireacin y agitacin.

Aspectos fisico-qumicos
Temperatura: esta se debe controlar entre 25 - 30C. Temperaturas mayores favorecen la acumulacin de oxlico. pH: el pH al inicio de la fermentacin se ajusta a 3.5 4.5 para favorecer el desarrollo celular y se mantiene en 2 durante la etapa productiva. Un pH superior a 4 favorece la formacin de oxlico y glucnico, este ultimo debido a la accin de glucosa oxidasa extracelular activa a pH alto.

Aireacin: la aireacin del medio es de suma importancia. Una abundante oxigenacin es necesaria para garantizar una produccin adecuada.

Procesos industriales.
Cultivo superficial El medio de melazas se prepara diluyendo a un contenido de 14 20% (p/v) en azcares y se pasteuriza. El ferrocianuro requerido para precipitar metales es entonces agregado, as como el fundamento de fsforo. El medio se vierte en charolas de aluminio con capacidad de 500 a 1000 L y una profundidad de lquido de no ms de 200 cm para promover un buen intercambio de gases. La inoculacin se efecta con esporas depositadas por aspersin en la superficie del medio. Las charolas son posteriormente colocadas en anaqueles dentro de la cmara.

El aire renueva el oxigeno necesario, remueve el CO2 producido y permite controlar la temperatura dentro de la cmara. La germinacin de las esporas ocurre a los dos das de inoculacin y la fermentacin dura un total de 9 a 12 das. Al final de esta, el micelio es separado por filtracin, lavado para promover el cido ctrico adherido y el lquido obtenido se mezcla con el licor residual antes de enviarse a las reas de separacin.

Cultivo sumergido Despus de los pretratamientos para remover metales es necesario esterilizar el medio de melazas con vapor a un mnimo de 120C debido a la sensibilidad del proceso a contaminaciones por bacterias.

La inoculacin se realiza indistintamente con esporas o con cultivo vegetativo crecido separadamente en un tanque de alrededor del 10% el volumen del fermentador. Cuando se inocula con esporas es recomendable agregar surfactantes que garanticen su rpida suspensin en el seno del medio.
Durante la fase de crecimiento se presenta un espumado excesivo que es controlado con el uso de rompedores mecnicos o agentes qumicos.

 La fermentacin se lleva a cabo a 25-30C dependiendo de cepa y tiene una duracin total de 5 a 8 das o hasta que la produccin empieza a ser incosteable. Al trmino de sta el medio es filtrado y el licor enviado a recuperacin El mtodo de cultivo sumergido es ms eficiente y menos intensivo en mano de obra que el de superficie pero requiere de un monitoreo constante y un control preciso.

Recuperacin
El primer paso en la recuperacin del acido ctrico consiste en la filtracin del micelio usando filtros rotatorios o similares. En caso de que la concentracin de cido oxlico sea significativa es necesario separar este cido como oxalato de calcio agregando Ca(OH)2 - cal- a 80C. Este paso es importante debido a la toxicidad del oxlico cuando el producto final se dedica a la alimentacin. La cristalizacin directa del cido ctrico no es posible debido a la presencia de residuos micelares y polisacridos originalmente presentes en la melaza. Consecuentemente varias purificaciones son necesarias.

La primera consiste en precipitar el cido en forma de citrato tricalcio por adicin de cal a 90C. El precipitado es filtrado y lavado para ser posteriormente acidificado a 50C con H2SO4, generando el cido libre. El CaSO4 formado es separado por filtracin y el lquido que contiene el cido ctrico es desionizado en de intercambio y decolorado con carbn activado. La solucin obtenida es concentrada al vaco. En Europa la cristalizacin final se produce a temperaturas de 20-25C para generar el cido monohidratado que es separado por centrifugacin. En Estados Unidos la cristalizacin se efecta por evaporacin dando como resultado la forma anhdrida del cido. Para su uso en alimentos se requiere una cristalizacin final en agua.

Aplicaciones en la industria de alimentos