DNA ZOLASYONU

HAZIRLAYAN EVK GREL DANIMAN SERBLENT YT

DNA ZOLASYONU
Nkleik asitlerin izolasyonu ou molekler biyoloji ve rekombinant DNA almalarnn ilk basamadr. rnein molekler biyolojide en ok kullanlan yntem olan PCR iin ilk basamak nkleik asitlerin izolasyanudur. Nkleik asitlerin kalitesi ve safl PCR analizleri iin en nemli faktrlerdir.

DNA ZOLASYONU

DNA ZOLASYON YNTEMLERNDE BRBRN ZLEYEN TEMEL AAMA BULUNMAKTADIR:

1. 2. 3.

Hcrenin paralanmas (lizasyon) ile DNAnn aa kmas. DNA-protein kompleksinin ayrlmas ve DNAnn znr duruma getirilmesi. DNAnn basit enzimatik ve/veya kimyasal yntemlerle, RNA ve dier makromolekllerden ayrlmas.

HCRE LZASYONU VE DNANIN SERBEST KALMASI

HCRE LZASYONU VE DNANIN SERBEST KALMASI

EDTAl tplere alnm kandan 400 l baka bir tpe alnr ve zerine 1000 l TE (Tris EDTA) eklenir. EDTA kann phtlamasn engellerken, TE eritrositlerin paralanmasndan sorumludur. 12000 rpmde 1 dk santrifj yaplr.

HCRE LZASYONU VE DNANIN SERBEST KALMASI

Santrifj ileminden sonra st ksmda kalan spernatant atlr. Alt ksmda kalan hcrelere 80 l SDS (sodium dedocyl sulfate) eklenir. SDS bir deterjan trevidir ve hcre zarndaki lipitleri eriterek hcredeki DNAnn serbest kalmas iin kullanlr.

HCRE LZASYONU VE DNANIN SERBEST KALMASI

SDSnin eklenmesini takiben lizatn zerine 90 l NaCl ve 10 l Proteinaz K konulur. NaCI proteinler etrafndaki sular ekerek proteinlerin kelmesini salar. Proteinaz K ise hcre zarndaki ve sitoplazma ierisindeki proteinleri paralar.

HCRE LZASYONU VE DNANIN SERBEST KALMASI

Hazrlanan lizat 56 Cye ayarl su banyasonda yarm saat bekletilir. Bunu ilemin amac lizattaki hcrelerin ekirdek membranlarnn paranlamasn salamaktr.

DNA-PROTEN KOMPLEKSNN AYRILMASI VE DNANIN ZNR HALE GELMES

DNA-PROTEN KOMPLEKSNN AYRILMASI VE DNANIN ZNR HALE GELMES

Lizatn zerine 250 l Fenol, 250 l Etanol eklenir ve 2500 rpmde 2 dakika santrifj yaplr. Spernatant baka bir tpe aktarlr. Fenol DNAya bal olan proteinleri (histonlar) degrede eder. Etanol ise gradient fark oluturarak DNAnn degrede olan proteinler ile birlikte dibe kmesini engeller. Baz durumlarda Etonol yerine izopropanol kullanlabilir.

DNA-PROTEN KOMPLEKSNN AYRILMASI VE DNANIN ZNR HALE GELMES

Spernatant zerine 200 l EDTA eklenir. EDTA bir ok metal iyonunu balayabilen bir maddedir. DNAazn almas iin gerekli Mg iyonlarn balayarak DNAnn degrede olmasn engeller.

DNANIN RNA VE DER MAKROMOLEKLLERDEN AYRILMASI

Spernatant zerine 10 l RNaz H enzimi ve 50 l %99luk souk Etanol eklenir ve 11000 rpm de 1 dakika santrifj yaplr. RNaz H enzimi spernatant ierisindeki RNA molekllerini degrede eder. Souk Etanol ierisinde DNA degrede olmu ve ya olmam RNA ve protein molekllerinden ok daha hzl dibe ker.

DNANIN RNA VE DER MAKROMOLEKLLERDEN AYRILMASI

DNANIN RNA VE DER MAKROMOLEKLLERDEN AYRILMASI

Souk etanoln eklenmesiye DNA dibe ker. Bylece spernatanttan ayrlarak pelet oluturur. Spernatant dibe ok fazla yaklalmayarak mikropipet ile alnarak atlr.

DNANIN RNA VE DER MAKROMOLEKLLERDEN AYRILMASI

Pelet ksm steril bir ortama braklarak etanoln umas salanr. Bylece genomik DNA elde edilir.

SAFLATIRILAN DNANIN KALTE KONTROL

DNANIN SPEKTROFOTOMETRE LE SAFLIK DERECESNN BELRLENMES

Nkelik asitler 260 nmde maksimum absorbans verir. Proteinler ise 280 nmde maksimum absorbansa sahiptir. Bu bilgiler gz nnde bulundurularak:

Elde

ettiimiz peletin 260 nmde ki absorbans alnr ve kaydedilir. Daha sonra peletin 280 nmde ki absorbans alnr ve kaydedilir.

DNANIN SPEKTROFOTOMETRE LE SAFLIK DERECESNN BELRLENMES

Elde edilen deerlerden 260 nmde ki deer, 280 nmde ki deere blnr. Sonu;
Eer

1,7-1,8 arasnda ise elde saf DNA elde edilmitir. Eer 2 ise kabul edilebilir saflkta DNA elde edilmitir. Eer 1 ise protein konteminasyonu vardr. Eer 0,5 ile 1,7 arasnda ise RNA kontaminasyonu vardr.

DER DNA ZOLASYON YNTEMLER

SLKA YNTEM

Bu yntem belirli tuz konsantrasyonlarnda DNA'nn silikaya balanmas esasna dayanr. Lizis ile hcreleri patlattktan sonra s proteinaz K ve deterjanlar ile protein sindirilir. DNA silika membranna balanr. Hzl ve toksik madde iermediinden gvenlidir. Fakat ok fazla tp deitirildiinden kontmainasyon riski fazladr.

MAGNETK BONCUK YNTEM

DNA'nn magnetik boncuklara balanmas esasna dayanr. Tm kan rneklerinden DNA izolasyonu otomatize sistem kullanlarak yaplr. Bu sistemin izolasyon prensibi zel polimerlerle kapl manyetik bilye teknolojisine dayanmaktadr. Lkositlerden aa kan DNA'nn balama tamponuyla manyetik bilyelere balanmas salanr ve daha sonra proteinler,tuzlar ve alkoln uzaklatrlmasndan sonra DNA manyetik ak zerinde bilyelerle sv faza alnr.

Bu sistem ok hzldr ve otomasyona uygundur. Artan test says ve eitlilii tan laboratuarlarnda otomatik DNA izolasyonu ihtiyacn gndeme getirmi ve bu amala otomatize cihazlar gelitirilmitir. Otomatik DNA izolasyonu sistemlerinde genellikle bu yntem kullanlmaktadr. Ancak bu manyetik partikller elsyon basamanda yeterince uzaklatrlmassa PCR amplifikasyon reaksiyonunu etkileyebilmekte ve yalanc negatif PCR sonularna yol aabilmektedir.

FTA KAIDI

FTA kad burgoyn tarafndan DNA nn uzun sre saklanmas iin retilmitir. iinde DNA'y nkleaz ve bakterilerden koruyan kimyassallar vardr. Kat zerinde emdirilen kan veya tkrn kurutularak daha sonra ykama ilemine dayanr. ok hzl ve DNA'nn muhafazas ve izolasyonu iin uygundur. Fakat RFLP iin uygun deildir.

FENL KLOROFORM YNTEM

Fenol ve kloroform proteinlerin sekonder yapsn paralayarak onlarn denatre olmasn ve solsyonda presipitasyonunu salarlar. Fenol ekstraksiyonu esnsnda bu prespite olan proteinler bir araya toplanarak sv ve interfazda toplanrlar. Bu solventlerin her biri tek bana bu fonksiyonu yerine getirebilse de ikisi birlikte daha etkili bir ekilde proteini uzaklatrabilirler.

TEEKKRLER