Anlisis de Restriccin, Mapa de restriccin

Anlisis
Depende de:
Tamao de los fragmentos Grado de resolucin Los pasos a seguir
Digestin con la enzima en un tampn a T y Temperatura, deteccin de la digestin con EDTA y T de almacenamiento. Carga en un gel de concentracin adecuada al tamao de fragmento, comparacin con marcador de peso Electroforesis, estudio de bandas resultantes.

Caractersticas de las Secuencias de Reconocimiento de las ER

La longitud del sitio de reconocimiento y corte varia (4-8 nt) Diferentes ER pueden tener el mismo sitio de Reconocimiento. Se conocen como Isoesquisomeros. (Sac I y Sst I) Sitios de reconocimiento puede ser ambiguo o no ambiguo. (Bam HI / Hinf I)

El sitio de reconocimiento para una enzima puede contener el sitio de restriccin para otra. (Bam HI y Sau3A I) La mayoria de los sitios de reconocimiento y corte son palindromicos

Bases Tericas de enzimas de restriccin

La actividad de las enzimas de restriccin depende de unas condiciones precisas :
pH Temperatura Concentracin de sal Iones

Una unidad enzimtica (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas:
3-5 u/ug de ADN genmico 1 u/ug de ADN plasmico

Reaccin enzimtica
Buffer (10X) DNA (1 g) Enzimas H2O 2 L 1 L 2 unidades _________
20 L Volumen total

Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I,

Organizacin del gel cargado con ADN/Enzimas de restriccin

Marcador DNA/Eco RI

A
Marcador

B
DNA uncut

C
DNA/BAM HI

D
DNA/ECO RI

E
DNA/HIN DIII

F
DNA/KPN I

Mapeo con enzimas de restriccin

Un mapa de restriccin es una descripcin de los sitios de corte de una

ER en un fragmento de DNA
Caracterizar un DNA desconocido Prerrequisito para su posterior manipulacin

Como se puede hacer un mapa de restriccin?

Digestin de DNA con varias enzimas de restriccin

Digestin parcial de un DNA marcada en un extremo.

Identificacin molecular
2) Cortes con 2 enzimas de restriccin permitieron discriminar entre varias especies del gnero Penicillium : Penicillium expansum, Penicillium solitum, Penicillium viridicatum, Penicillium brevicompactum

Fragmentos de restriccin con Taq I

M1 M2 7

Ps

Pb Pv Pc

10

12 M2

Pv

Fragmentos de restriccin con Hind III

M1 M2 Pc

Pb Ps

P7 PC AN P12 P13 P14 P15 P16 P17

Pv M1

Enzimas de restriccin

Enzimas de restriccin

Tests sencillos de paternidad

Marcador
Madre Hijo
Padre alegado

Enzimas de restriccin

Mix Marcador

Marcador Madre Hijo

Padre alegado

Mix Marcador

Digestin doble

Mapeo con enzimas de restriccin

Mapeo con enzimas de restriccin

Mapeo con enzimas de restriccin

Digestin parcial de un DNA marcada en un extremo

Hay tres ingredientes obligatorios en el mismo tubo:

1. DNA: Libre de contaminantes tales como fenol o etanol. Sal en exceso interfiere con la digestin de muchas enzimas, aunque algunas son mas tolerantes a la sal. 2. Un buffer apropiado: Diferentes enzimas cortan ptimamente en diferentes buffers, debido a las diferentes preferencias en fuerza inica.. 3. La enzima de restriccin: Otros: BSA, DTT.

Vectores y enzimas de restriccin. En un plsmido (P) de 3 Kbp se quiere clonar un fragmento de DNA (D) de ratn de 1,5 Kbp. Tanto P como D se tratan con los enzimas de restriccin EcoRI y HindIII y posteriormente se aade DNA ligasa. Para determinar el tamao de las molculas circulares resultantes despus de la ligacin se dispone de dos enzimas de restriccin: - PvuII: Es capaz de cortar una vez en P y ninguna en D - DdeII: No corta en P y tiene una nica diana en D Representa grficamente la movilidad electrofortica que presentaran en un gel de agarosa: A. El plsmido sin cortar B. El inserto sin cortar C. El plsmido cortado por EcoRI + HindIII D. El plsmido resultante de la ligacin cortado por Dde + PvuII

EcoRI(30)
MCS

HindIII (50)

P (3Kbp) PvuII (2200)

EcoRI

D (1.5Kbp) DdeII
(1 Kbp) (0.5 Kbp)

HindIII

Vectores y enzimas de restriccin. Deducir el mapa de restriccin de un bacterifago de DNA lineal, a partir de los siguientes datos:
Enzima de restriccin Bam HI Hind III Sma I Fragmentos obtenidos (Kb) 5 5 2 10 10 13 5 3 8 10

Bam HI + Hind III

Bam HI + Sma I Hind III + Sma I

5*
2 2

* Intensidad de banda mayor de la esperada para su peso molecular (al ser observada bajo luz UV)

En una poblacin de centeno se ha aislado un gen de secuencia nica. Se extrae el ADN genmico de 10 plantas diferentes de la poblacin, se digiere con EcoRI, los fragmentos producidos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa y se transfieren mediante un Southern (transferencia en condiciones desnaturalizantes) a una membrana de niln. Posteriormente, se hibrida esta membrana empleando como sonda radiactiva el gen de secuencia nica de centeno clonado en un vector bacteriano. Por ltimo, se realiza una autorradiografa colocando una pelcula fotogrfica junto a la membrana y se revela obtenindose los resultados indicados en el siguiente esquema :