ANLISE POR INJEO EM FLUXO: APLICAO DE ENZIMAS COMO REAGENTES ANALTICOS

Prof. Dr. Heberth J. Vieira

CONCEITO
As enzimas so protenas especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja aumentam a velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas esto associadas a biomolculas, devido as suas extraordinria especificidade e poder cataltico.

CLASSIFICAO
1. Oxidoredutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons Desidrogenases e Oxidases) 2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e Transaminases) 3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente Peptidases) 4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico Dehidratases e Descarboxilases) 5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos - Epimerases) 6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia - Sintetases)

Mudana da conformao da enzima induzida pela ligao com o substrato. O exemplo mostra a hexoquinase antes (a)e depois (b) de se ligar ao substrato, a glicose. A molcula da enzima consta de dois domnios, que se aproximam, encaixando o substrato.

PONTO DE SATURAO
Todas as enzimas apresentam o efeito da saturao, porm variando consideravelmente no que diz respeito concentrao requerida para produzi-lo.

V max[ S ] Km [ S ]

Equao que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reao varia em funo da concentrao do substrato.

Enzima Catalase Hoxoquinase Quimiotripsina H2O2 Glicose Frutose

Substrato

Km (mM) 25 0,15 1,5 2,5 12,0 32 122 9,0 0,12 2,0 57 0,025 0,018 0,9 0,1 0,04 4,0

N-benzoltirosinamida N-formiltirosinamida N-acetiltirosianamida Gliciltirosinamida HCO3Glutamato a-cetoglutarato NH4+ NADox NADred Aspartato a-cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Anidrase carbnica Glutamato desidrogenase

Aspartato amininotransferase

MECANISMO DA AO ENZIMTICA
a. Enzima como catalisador b. Inibio Enzimtica b.1. Inibio Reversvel b.1.1. Inibio Reversvel Competitiva b.1.2. Inibidor Reversvel no Competitivo c. Inibio Irreversvel d. Cofatores

a. Enzima como catalisador

O princpio de catalisador diminuir a energia de ativao. A enzima se liga a uma molcula de substrato em uma regio especfica denominada stio de ligao. Esta regio um encaixe que apresenta um lado envolvido por cadeias de aminocidos que ajudam a ligar o substrato, e o outro lado desta cadeia age na catlise.

Estado de transio

Energia de ativao

Reao no catalisada

Energia

Substrato (S)

Reao catalisada Produto (P)

Progresso da reao

b. Inibio Enzimtica b.1. Inibio Reversvel

Existem vrios modos que esto envolvidos com ligao no covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo qual diminuem a atividade enzimtica e como eles afetam na cintica da reao.

b.1.1. Inibio Reversvel Competitiva

Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catlise, ela poder aceitar esta molcula no seu local de ligao, mas no pode levar ao processo cataltico, pois ocupando o stio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete pelo mesmo local do substrato. O efeito da reao modifica o Km, mas no altera a velocidade.

b.1.2. Inibidor Reversvel no Competitivo

b.1.2. Inibidor Reversvel no Competitivo

Ocorre quando um molcula ou on pode se ligar em um segundo local na superfcie enzimtica (no no stio ativo). Isto pode distorcer a enzima tornando o processo cataltico ineficiente. O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que no se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque inibe a ligao do complexo ES e no da enzima livre. O efeito da reao modifica a velocidade e o Km permanece constante.

Classificao das Enzimas:

considera tipo de reao e substratos

1. xido-redutases ( Reaes de xidoreduo).

Transferncia de eltrons Se uma molcula se reduz, h outra que se oxida. grupos aldedo gupos acila grupos glucosil grupos fosfatos (quinases) Transformam polmeros em monmeros. Atuam sobre: Ligaes ster Ligaes glicosdicas Ligaes peptdicas Ligaes C-N Entre C e C Entre C e O
Entre C e N

2. Transferases (Transferncia de grupos funcionais)

Nomenclatura oficial das enzimas dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) :

3. Hidrolases (Reaes de hidrlise)

ATPase (Adenosinatrifosfatase): EC 3.6.1.3 - uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contm fosfato..........3.6.1 - esse anidrido ATP..................3.6.1.3

4. Liases (Adio a ligaes duplas)

5. Isomerases (Reaes de isomerizao)

Nmeros identificam o tipo de reao e o tipo de substrato alvo

6. Ligases (Formao de laos covalentes com gasto de ATP)

Entre C e O Entre C e S Entre C e N Entre C e C

Enzimas
O Brasil tem uma grande variedade de vegetais que podem constituir em fontes inesgotveis de enzimas para serem aplicados nas mais diversas reas do conhecimento

Enzimas
Em qumica analtica, por exemplo, eles podem ser usados na construo de diversos tipos de biossensores e/ou procedimentos enzimticos de anlise. H uma tendncia recente de utilizao de tecidos de vegetais e/ou extratos brutos no lugar de enzimas purificadas na confeco de biossensores e/ou procedimentos enzimticos de anlise

Fonte de enzimas

Ascorbato oxidase
A grande maioria dos trabalhos descritos para determinao enzimtica de cido L-ascrbico utilizam a enzima ascorbato oxidase (EC: 1.10.3.3). A ascorbato oxidase catalisa a oxidao do cido L-ascrbico na presena de oxignio molecular produzindo o cido deidroascrbico e gua.

Ascorbato oxidase
Eletrodo de Clark.

O2 + 4 e + 2 H2O 4 OH

Oxalato oxidase
A oxalato oxidase (EC: 1.2.3.4) catalisa a oxidao do cido oxlico produzindo dixido de carbono e perxido de hidrognio. Essa enzima encontrada em polpa de banana, tecido de espinafre e sementes de alguns vegetais.

lcool desidrogenase
No procedimento para determinao de lcool etlico usando alcool desidrogenase (EC: 1.1.1.2), um biossensor pode monitorar a espcie eletroativa NADH produzida na reao enzimtica , enquanto que o consumo de oxignio na reao NADH pode ser monitorado com um eletrodo para oxignio do tipo Clark.

lcool desidrogenase

O2

Tirosinase
A tirosinase (EC: 1.14.18.1) catalisa a oxidao tanto de monofenis (e.g. tirosina, fenol, pcresol), como difenis (e.g. catecol, L-dopa, dopamina, adrenalina). distribuda na natureza e encontrada nos tecidos de kiwi, arroz, abacate, pra, ma, morango, uva, folha de espinafre, palmito, banana, batata inglesa, batata doce, pssego, manga, berinjela, inhame entre outros.

Tirosinase

Tirosinase
Sistema para deteco amperomtrica de fenol

Tirosinase

Peroxidase
A peroxidase (PER; EC: 1.11.1.7) encontrada em tecidos de vegetais e animais. A PER catalisa a oxidao pelo perxido de hidrognio de alguns substratos como mono e difenis, polifenis, aminofenis, entre outros. conhecida como uma enzima termoestvel que pode ter sua atividade regenerada aps tratamento trmico.

Peroxidase
Diversas so as fontes dessa enzima como pssego, tomate, soja, rabanete, abobrinha, nabo e aspargo.

Determinao de paracetamol

Quim. Nova, Vol. 26, No. 1, 39-43, 2003

Determinao de paracetamol

Determinao de paracetamol

Urease
A urease (EC: 3.5.1.5) obtida do feijo de soja foi a primeira enzima a ser cristalizada em 1926, por J. B. Sumner. Essa enzima catalisa a hidrlise da uria, formando o on amnio e bicarbonato. Encontra-se principalmente em sementes de feijo.

Urease

Trends in biotechnology, Volume 18, Issue 10, 1 October 2000, Pages 433437

Enzimas colinesterases
As colinesterases so importantes enzimas presentes nos invertebrados e nos insetos, atuando no sistema nervoso central, controlando impulsos e transmisses dos estmulos nervosos. Esto divididas em duas classes, sendo:
acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7)(AChE) e butirilcolinesterases (EC 3.1.1.8 )(BuChE)

Enzimas colinesterases
As AChE sao enzimas da classe das hidrolases, sendo que a hidrlise do seu substrato natural, o neurotransmissor acetilcolina (AX), se processa formando o complexo enzima substrato (EH-AX), produzindo posteriormente a molcula de colina (HX) e a enzima acetilada (EA), hidrolisando rapidamente a acido actico (AOH), liberando ento a enzima livre (EH), de acordo com a reao:

Enzimas colinesterases

As colinesterases tambm hidrolisam steres de tiocolina, tais como acetiltiocolina, butiriltiocolina, propioniltiocolina, acetil-metiltiocolina, bem como o-nitrofenilacetato, indofenilacetato e -naftilacetato. BuChE possuem preferncia por butiril steres, como a butirilcolina.

Enzimas colinesterases
Tm sido utilizadas como ferramentas para a construo de biossensores para monitoramento de compostos txicos, como os pesticidas organosfosforados e carbamatos, e os metais pesados, constituindo uma alternativa aos mtodos comumente utilizados em qumica analtica.

Enzimas colinesterases
Neste processo, o inibidor (I) geralmente apresenta caractersticas estruturais e afinidades semelhantes s do substrato (S) ao qual ele est interferindo, competindo com este pelo mesmo stio de ligao da enzima (E).

Enzimas colinesterases
A primeira gerao de biossensores de colinesterases

ChE: acetylcholinesterase ChO: choline oxidase

Enzimas colinesterases
O H2O2 pode ser detectado de diferentes maneiras:
Amperometria (+650 mV versus Ag/AgCl) Mtodo quimiluminescente (luminol).
O NH NH NH2 O O

+ H2O2 4 OH-

catalisador

O O NH2 O

H2O + N2+ hv

Enzimas colinesterases
Segunda gerao

Enzimas colinesterases
Terceira gerao: emprega o uso de mediadores

350 mV vs Ag/AgI.

Biosensors and Bioelectronics, 26,2011, 45144519

Enzimas colinesterases

Biosensors and Bioelectronics, 26,2011, 45144519

Fosfatases
Pesticidas organofosforados e carbamatos podem inibir a reao de hidrolise da glucose6-fosfato catalisada pela enzima fosfatase acida (AP) (E.C. 3.1.3.2), sendo este um processo reversvel. A deteco amperomtrica desta inibio requer um sistema bi-enzimtico com glucose oxidase (GOD), de acordo com a reao:

Fosfatase

Imobilizao de enzimas
A imobilizao de enzimas tem a finalidade de:
manter a atividade cataltica e a estabilidade das enzimas.

A enzima imobilizada torna-se menos susceptvel variao de temperatura, pH e ao de ativadores e inibidores que atuam na enzima em soluo.

Imobilizao de enzimas
A imobilizao consiste em uma etapa crtica na construo de qualquer biossensor. Diversos procedimentos tm sido empregados na construo de biossensores enzimticos, sendo que todos podem ser encaixados na classificao geral dos procedimentos de imobilizao de material biolgico sendo: (a) adsoro; (b) encapsulao; (c) ligao covalente, e (d) ligao covalente cruzada (crosslinking).

Imobilizao de enzimas
nilon, nitrato de celulose, acetato de celulose, resinas, colgeno e policarbonatos.

glutaraldedo e o lcool polivinlico com grupos estirilpiridnico

Imobilizao de enzimas
A tcnica de imobilizao mais : formao de ligao covalente. A reteno da enzima na superfcie do suporte efetuada por ligaes entre os grupos funcionais da enzima e a superfcie do suporte. A desvantagem est na perda de parte da atividade enzimtica, por conta das alteraes nas conformaes dos stios ativos da enzima.

Imobilizao de enzimas
Etapa 1 - Silanizao +
Si NH2

3-aminopropiltrietoxisilano

Etapa 2 - Ativao
O O C H C H

Si

NH2

Glutaraldedo

Etapa 3 - Imobilizao
O Si N CH C H

H2N

Si

CH

Imobilizao vs. FIA

aumento da sensibilidade como resultado da menor disperso da zona de amostra. simplificao do sistema, uma vez que dispensa o uso de um canal adicional que deveria conduzir a soluo do reagente, economia de reagentes uma conseqncia das pequenas quantidades requeridas com reagentes slidos e, de modo ideal, o reagente s deve ser consumido durante a passagem do analito de interesse pelo reator,

Obteno do extrato bruto

Anlise por injeo em fluxo

Mtodo em batelada: A figura ilustra um procedimento analtico tpico onde uma quantidade conhecida de amostra (A) e reagente (R) so misturados em um bquer comum formando o produto AR.

Anlise por injeo em fluxo

Os mtodos de anlise em fluxo compreendem todos os mtodos analticos que so baseados na introduo e processamento de amostras em fluxos.

fonte: www.c2o.org.br

Anlise por injeo em fluxo

A grande vantagem dos sistemas de Anlise em Fluxo justamente a grande reprodutibilidade do processo de mistura de amostra e reagente.

Anlise por injeo em fluxo

Multicomutao
Um sistema de Multicomutao pode ser definido, de forma simplificada, como um sistema no qual comutadores independentes, controlados por computador, controlam os fluxos de amostra, reagentes e solventes atravs de uma rede de tubos interconectados permitindo comutar (redirecionar) os fluxos e portanto implementar diversos procedimentos analticos de forma totalmente automatizada.

Multicomutao
Este conceito permite aliar a alta produtividade da tcnica de injeo em fluxo com a versatilidade da anlise seqencial e economia de reagentes em um nico sistema. O termo "comutao" na anlise em fluxo significa basicamente "mudar a direo de um fluxo". Na prtica isso pode ser feito com o uso de vlvulas solenide de 3 vias ou de estrangulamento.

Multicomutao

Multicomutao

vlvula solenide de 3 vias

Configurao bsica de um sistema em fluxo empregando multicomutao

Multicomutao
A interface (software) permite a visualizao dos sinais transientes provenientes do sistema de deteco, do controle do acionamento das vlvulas solenides e da bomba peristltica.

Multicomutao

Outro exemplo de interface grfica para controle dos componentes do sistema de anlise por injeo em fluxo por multicomutao.

Mtodos em fluxo: Aplicaes

Determinao de sulfito empregando extrato bruto de batata-doce

O sistema em fluxo baseado no efeito inibitrio do sulfito sobre a catlise da polifenol oxidase na transformao do catecol a o-quinona. SO2-

O. Fatibello-Filho, I. da Cruz Vieira / Analytica Chimica Acta 354 (1997)

Determinao de sulfito empregando extrato bruto de batata-doce

No emprega reagente qumico TXICO

Determinao de fenis em guas residurias empregando extrato de abobrinha

Preparou-se o diferentes extratos bruto, buscando peroxidase.

Determinao de fenis em guas residurias empregando extrato de abobrinha

Determinao de fenis em guas residurias empregando extrato de abobrinha

Determinao de fenis em guas residurias empregando extrato de abobrinha

Determinao de Carbaril empregando multicomutao e deteco quimiluminescente Concentrao mxima aceitvel: 20 g L-1

J. Braz. Chem. Soc., Vol. 18, No. 3, 519-525, 2007

Determinao de Carbaril empregando multicomutao e deteco quimiluminescente

Determinao de 3-hidroxibutirato
O 3-hidroxibutirato uma das principais fontes de energia para os animais, ajudando na digesto da celulose, alm do fornecimento de energia para a movimentao do animal
Enzima imobilizada em prolas de vidro (3hidroxibutirato desidrogenase); Deteco espectrofotomtrica (320 nm)

Determinao de 3-hidroxibutirato empregando multicomutao e deteco espectrofotomtrica

Cherrine Kelce Pires e Boaventura Freire dos Reis, Quim. Nova, Vol. 28, No. 3, 414-420, 2005

Determinao de 3-hidroxibutirato empregando multicomutao e deteco espectrofotomtrica

Freqncia de amostragem de 55 determinaes por hora; Consumo de reagente: 0,9 mg (NAD+), 8 g (HBDH).

Determinao de colesterol livre e total empregando multicomutao

3 mg (25 U)

Mais de 400 determinaes

25 mg (120 U)