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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.

http://www.expasy.ch/tools/

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El genoma haploide de un humano contiene 20,000-25,000 genes que codifican a protenas.


Transportadores Enzimas Receptores Estructurales Hormonas Almacenamiento Movimiento

Estructura cuaternaria

Protenas que estn formadas por una o ms cadenas polipeptdicas, subunidades o monmeros. Muchas veces slo presentan su actividad cuando forman el agregado

Estructura terciaria

Arreglo espacial en el que las cadenas se pliegan para dar una forma compacta (por ejemplo globular o cilndrica). El empacamiento espacial se encuentra determinado por una combinacin de estructura: -hlices, plegadas y desordenadas

Estructura secundaria
Las protenas adoptan una conformacin en el espacio debido a: 1) las interacciones de las cadenas laterales de sus residuos de aminocidos y 2) el solvente en el que se encuentren, dando una estructura de mxima estabilidad.

Estructura primaria

La secuencia lineal de los aminocidos en una protena. Estructura que identifica a una protena y que le determina sus caractersticas qumicas y biolgicas. Las propiedades fisicoqumicas intrnsecas como plegamiento o conformacin estn sealadas en su estructura primaria

Unidad estructural de las protenas: Los aminocidos

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Alifticos (5): Ala, Val, Leu, Ile, Gly. Hidroxlicos (2): Ser y Thr. cidos o dicarboxlicos y sus amidas (4): Asp, Asn, Glu y Gln. Bsicos (3): Lys, Arg e His. Cclicos (4): Phe, Tyr, Trp y Pro. Contienen sulfuros (2): Met y Cys.

2. Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.


PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.

Para qu purificar una protena?


Suero fetal bovino Colorante de carne Protena liofilizada

Fitasa Lipasa Hexosa oxidasa Vacuna Hepatitis B Insulina Gelatina Protenas recombinantes varias

Caracterizacin de la actividad biolgica de la protena. Para estudios sobre la estructura-funcin

Gua bsica para la purificacin de una protena


A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la protena tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares. C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Para la determinacin rpida de la pureza, actividad o contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separacin de la protena mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la protena o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificacin. Seleccionar y usar slo lo necesario. G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las caractersticas propias de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso se pierde protena

Fases para la purificacin de una protena


Fase I. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su clarificacin o concentracin. Fase II. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para eliminar protenas contaminantes es el de la precipitacin. Fase III. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad.

SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA.

La eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como:

a) la facilidad de obtener cantidades suficientes b)


del tejido del que se asla la protena, la cantidad de la protena de inters en el tejido y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida, que ayudar en su estabilizacin y su aislamiento.

c)

Mtodos para la ruptura mecnica de las clulas


Mtodo
Prensa French Sonicacin

FASE I

Comentarios
Volmenes 50 mL Disponibilidad de equipo

Homogenizador

Disponibilidad de equipo
No se necesita equipo

Choque osmtico

Ciclos de congelacin/descong elacin


Detergentes

Para clulas de mamferos, no para bacterias


Pueden desnaturalizar a protenas sensibles

Tamao de las protenas, propiedad utilizada para su separacin.

El tamao de las protenas es medido usualmente en masa molecular, aunque algunas veces se menciona su longitud y dimetro (en ). El peso molecular es la masa de 1 mol de protena, usualmente se expresa en daltones. Un daltn es la masa atmica de un protn o neutrn. La masa se puede determinar con mtodos como: la electroforesis, la filtracin en gel y la espectrometra de masas. Los mtodos de separacin de protenas en los que se incluyen tanto forma como tamao son: la cromatografa en filtracin en gel (size exclusin chromatography y la electroforesis en gel de poliacrilamida.

FASE I

Centrifugacin

La centrifugacin aprovecha la propiedades de tamao, forma y densidad de las protenas para separarlas de otras molculas que presentan caractersticas distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada protena es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solucin homognea de partculas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria.

Diagrama de flujo para la obtencin de diferentes fracciones subcelulares

FASE I

Centrifugacin diferencial

Remover contaminantes y/o concentrar la muestra

FASE II

Precipitacin: cambio de pH, incremento en la temperatura, adicin de solventes, molculas cargadas, etc. Pero, el mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4.

FASE II

Solubilidad

Es la cantidad de soluto que puede disolverse en un solvente. La estructura 3-D de la protena afecta sus propiedades de solubilidad. Las protenas citoslicas son abundantes en aminocidos hidrofilicos en su superficie. De manera opuesta a las protenas membranales. Cada protena tiene una solubilidad caracterstica en un ambiente definido y si se cambian esas condiciones (amortiguador, tipo de solvente, pH, fuerza inica, temperatura, etc.) puede causar que las protenas pierdan sus propiedades de solubilidad y precipiten en solucin.

FASE II

Salting in y salting out

Salting in. Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentraciones de iones. Pero cuando se eleva la concentracin de iones la protena disminuye su solubilidad y se agrega (salting out).

Fase I

Cmo vamos a purificar a la lactato deshidrogenasa de msculo de bovino?

FASE II

Cmo calcular la concentracin de sulfato de amonio a utilizar?

Formulas o tablas

Y tambin en internet

1. 2. 3.

http://www.proteinchemist.com/cgibin/s2.pl Conocer: Sulfato de amonio slido Conocer el volumen de la solucin Y la concentracin final de la sal

Eliminar la sal

Una vez que se obtiene el pp de una mezcla protena hay que eliminar la sal o medio utilizado para la precipitacin. La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificacin La sal puede alterar las propiedades biolgicas de la protena

Bajar o eliminar la concentracin de sal


Dilisis Utilizar la cromatografa filtracin en gel, para perder las molculas de bajo peso molecular (Sefadex-G25). Utilizar filtracin a travs de membranas de dimetro especifico.

Cromatografa de filtracin en gel

Tambin llamada comatografa de exclusin molecular. Consiste de una fase lquida mvil y una fase slida estacionaria. Fase slida estacionaria consiste de un gel de tamao molecular determinado. Fase mvil. Acarreara a la mezcla de protena

Cromatografa exclusin molecular

Protenas de alto peso molecular salen primero de la columna Despus las protenas de bajo peso molecular.

Determinar a cada fraccin: 1. Actividad y 2. concentracin de protena

Usos de la cromatografa de exclusin molecular

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