PRUEBAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR: PCR, TRANSCRIPTASA INVERSA Y PCR MULTIPLEX EN EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES VIRALES

Presentado por : lvarez Oviedo Gabriela Salazar Meza Enybet

PCR: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79oC a 85oC), de ah su nombre comercial mas conocido: taq polimerasa.

La tcnica del PCR fue inventada y desarrollada por el qumico Kary B. Mullis quien gan por sus trabajos el premio Nobel de qumica en 1993.

PCR y virologa

Nos permite identificar al agente infeccioso independientemente de su respuesta serolgica

Una gran ventaja en el diagnstico de enfermedades virales(Hepatitis C )

Tambin es gran aplicacin en el diagnstico de enfermedad viral neonatal donde el diagnstico serolgico de la infeccin es generalmente enmascarado por la presencia de anticuerpos maternos circulantes

ELEMENTOS DE LA PCR
DNA Molde Cebadores (oligonucletidos) DNA polimerasa termoestable Desoxinucletidos trifosfatos Tampn de reaccin pH Cationes divalentes Cationes monovalentes

PASOS DEL PCR

ADNdc

Hibridacin

PCR Y VIRUS VARICELA-ZOSTER

La PCR es mucho ms sensible que el aislamiento en cultivo del VVZ, sobretodo debido a la labilidad del mismo y a que, en ocasiones, la carga viral es muy escasa en determinadas muestras. Actualmente se reconoce su mayor sensibilidad y rapidez diagnstica en lquidos de vesculas, costras, muestras respiratorias, lquido articular y cefalorraqudeo, humos vtreo, etc. Desde el punto de vista de investigacin, la PCR ha permitido avances notables en el conocimiento de la patogenia de la infeccin primaria y en las recurrencias (fases de viremia, afectacin de sistema nervioso central, mecanismos de transmisin, etc.). Tambin permite distinguir entre las infecciones naturales y las producidas por el virus atenuado (cepa OKA) de la vacuna actual.

Tcnicamente, la PCR puede llevarse a cabo por varios mtodos, pero es recomendable seguir un protocolo de doble PCR o de amplificacin seguida de hidratacin con sonda, ya que las principales indicaciones se centran en muestras con bajo contenido de ADN viral. Existen diversos iniciadores descritos en la literatura, presentando buena sensibilidad y extrema especificidad, por lo general. Podemos considerar actualmente a la PCR til en el diagnstico de los siguientes procesos causados por el VVZ:

La PCR se utilizar slo cuando sean insuficientes otras tcnicas ms sencillas como la deteccin de antgenos o el cultivo como, por ejemplo, cuando las lesiones estn muy evolucionadas, cuando media el tratamiento o cuando la muestra deba remitirse a otro laboratorio para cultivo (labilidad del virus). Complicaciones neurolgicas (encefalitis, meningoencefalitis, meningitis, mielitis, etc). Es una recomendacin indiscutible en estas situaciones, puesto que el cultivo carece de rentabilidad diagnstica. La PCR, llevada a cabo sobre LCR permite el diagnstico de estas infecciones y la instauracin de la terapia adecuada.

PCR Y CITOMEGALOVIRUS
Las tcnicas de PCR actuales encuentran un obstaculo adicional en el diagnstico de las infecciones por el CMV: la facilidad con que el virus reactiva y se replica sin dar lugar a enfermedad dificulta su valoracin. Infecciones del sistema nervioso central (encefalitis, polirradiculitis, mielitis, etc.) Este tipo de afectacin suele aparecen en pacientes con SIDA. La deteccin de genoma en LCR es el mtodo de eleccin. Se correlaciona con los estudios histopatolgicos y con las manifestaciones clnicas. Es mucho ms sensible que el cultivo, a la vez que rpido y no invasivo.

Infecciones congnitas y neonatales. Puede detectarse ADN de CMV en suero y LCR de neonatos con infeccin congnita. Sin embargo, no se recomienda realizarla, ya que la infeccin congnita grave se diagnstica fcilmente por cultivo. Infecciones en trasplantados Aunque se ha estudiado profundamente en estos pacientes la PCR no tiene por ahora un lugar en el diagnstico en este tipo de pacientes. La PCR es muy sensible y puede predecir precozmente el riesgo de reactivacin, lo que no quiere decir enfermedad. No se recomienda llevarla a cabo sobre leucocitos de sangre perifrica o muestras

PCR V VIRUS DE EPSTEIN-BARR

Es posible detectar genoma viral en los linfocitos de pacientes seropositivos sin enfermedad por el VEB. Aunque hay asociacin entre sntomas y cantidad de genoma presente en la muestra, la utilidad de las tcnicas cuantitativas de PCR no ha quedado establecida por el momento. La PCR para detectar el VEB es actualmente la que menos aplicacin diagnstica tiene en la prctica diaria.

PCR Y HERPESVIRUS HUMANO TIPO 6

Las principales aplicaciones de la PCR en el HVH 6 se han centrado en la investigacin de la patogenia de este virus. En el exantema sbito se detecta genoma en linfocitos, suero y plasma durante la fase aguda, tambin puede detectarse en saliva. En el resto de cuadros asociados al HVH-6 (sndromes linfoproliferativos, hepatitis, etc.) el conocimiento de su importancia patgena no est suficientemente aclarado.

PCR MULTIPLEX

PCR MULTIPLEX
Multiplex PCR es una variante de la PCR que amplifica el ADN simultneamente varios objetivos con ms de un par de cebadores en un tubo de reaccin. Combinado con los sistemas convencionales de RT-PCR o PCR en tiempo real, PCR mltiple se ha utilizado con xito en la deteccin, tipificacin y subtipificacin de virus de influenza A y puede proporcionar la deteccin exacta del virus de la gripe.

Deteccin simultnea de virus de la influenza tipo B y el virus tipo A subtipos H1N1, H3N2 y H5N1 usando Multiplex PCR en tiempo real RT-PCR. El aislamuento del virus ha sido el mtodo estandar por mucho tiempo pero es ineficaz cuando se producen epidemias o pandemias, es menos sensible y requiere mas tiempo. Se han desarrollado mtodos ms rpidos y sensibles como la inmunofluorescencia, la enzima inmunoensayo, y los mtodos de biologa molecular, que incluyen la tcnica RT-PCR, la cual se ha convertido en la principal tcnica de deteccin viral en el caso de generarse un brote de pandemia gracias a su conveniencia, la velocidad y precisin.

La diferencia de sensibilidad entre los distintos subtipos puede atribuirse a una serie de factores. Por ejemplo, el diseo pares de primers / sondas, como tambin las condiciones de reaccin son ms favorables para ampliaciones de H5, B, y los genes N1. El ensayo mltiplex RT-PCR en tiempo real ha demostrado tener una alta especificidad y sensibilidad casi se acerca 100%, ya que reconoci con xito todos los resultados positivos, as como subtipos, de un gran nmero de muestras clnicas. la tcnica multiplex PCR en tiempo real RT-PCR ofrecen una respuesta rpida, sensible, especfica, estable y ampliamente aplicable para la identificacin y subtipificacin del virus de la influenza humana, incluido el H1N1, H3N2,5N1, y

TRANSCRIPTASA REVERSA

TRANSCRIPTASA REVERSA
El PCR de la transcripcin reversa (de sus siglas en Ingls,RT-PCR), que se emplea para amplificar, aislar o identificar una secuencia de ARN. Desde la dcada de los 90, se han desarrollado varias pruebas de reaccin en cadena de la transcriptasa-polimerasa inversa. Estas ofrecen mayor sensibilidad en comparacin con el aislamiento viral, en un tiempo mucho ms rpido.

La RT-PCR in situ ofrece la capacidad de detectar el ARN del dengue en tejidos embebidos en parafina. Todas las pruebas para la deteccin de cido nucleico comprenden tres pasos bsicos:

Extraccin

y purificacin del cido nucleico Amplificacin del cido nucleico Deteccin y caracterizacin del producto amplificado.

La extraccin y purificacin del ARN viral de la muestra se pueden realizar mediante mtodos tradicionales de separacin de fases lquidas (por ejemplo, fenol, cloroformo), pero se han ido reemplazado gradualmente con los kits comerciales basados en slice, que son ms reproducibles y rpidos, especialmente porque se pueden automatizar usando sistemas robticos.

Muchos laboratorios utilizan una prueba de RTPCR anidada, usando cebadores universales para el dengue dirigidos a la regin C/prM del genoma como un paso inicial de la transcripcin inversa y amplificacin, seguido de una amplificacin de PCR anidada que es especfico para el serotipo. La RT-PCR anidada se ha descrito como una tcnica extremadamente sensible para la deteccin de bajas concentraciones. La combinacin de los cuatro cebadores especficos para los oligonucletidos del serotipo en un solo tubo de reaccin (RT-PCR multiplex de un solo paso) es una interesante alternativa para RT-PCR anidada.

Los productos de estas reacciones se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa, y los productos de la amplificacin se visualizan como bandas de diferentes pesos moleculares en el gel de agarosa usando colorante de bromuro de etidio, y haciendo comparaciones con los marcadores de peso molecular estndar. En comparacin con el aislamiento del virus, la sensibilidad de los mtodos RT-PCR vara de 80% a 100% y depende de:

La regin del genoma seleccionado por los cebadores El mtodo usado para amplificar o detectar los productos PCR (por ejemplo RT-PCR de un paso comparado con RT-PCR de dos pasos) El mtodo empleado para los subtipos (por ejemplo, PCR anidado, hibridacin de mancha con sondas de ADN especficas al sitio de restriccin, anlisis de secuencia,

Para evitar resultados falsos positivos debido a una amplificacin inespecfica, es importante identificar las regiones del genoma que son especficas para dengue y no las que se conservan en los flavivirus y otros virus relacionados. Los resultados falsos positivos tambin pueden ocurrir como consecuencia de la contaminacin de amplificaciones previas. Esto se puede evitar mediante la separacin fsica de los diferentes pasos del rocedimiento y el seguimiento de los estrictos protocolos para la descontaminacin.

RT-PCR EN TIEMPO REAL

La prueba de RT-PCR en tiempo real es un sistema de ensayo de un solo paso que se utiliza para cuantificar el ARN viral y que emplea pares de cebadores y sondas que son especficos para cada uno de los serotipos del dengue. El uso de una sonda fluorescente permite la deteccin de los productos de la reaccin en tiempo real, en una mquina de PCR especializada, sin necesidad de

Muchos ensayos RT-PCR en tiempo real se han desarrollado empleando tecnologas TaqMan o SYBR Green. La PCR en tiempo real de TaqMan es muy especfica debido a la hibridacin de secuencia especfica de la sonda. Es posible que los cebadores y sondas reportados en las publicaciones no sean capaces de detectar todas las cepas del virus del dengue: la sensibilidad de los cebadores y de las sondas depende de su homologa con la secuencia del gen seleccionado del virus especfico analizado. La RT-PCR en tiempo real de SYBR Green tiene la ventaja de la simplicidad en el diseo del cebador y utiliza protocolos RT-PCR universales, pero es tericamente menos especfica.

La RT-PCR en tiempo real puede ser singleplex", es decir, solo detectan un serotipo a la vez, o multiplex, es decir, son capaces de identificar los cuatro serotipos en una sola muestra. Los ensayos multiplex tienen la ventaja de que una sola reaccin puede determinar los cuatro serotipos sin la posibilidad de introducir contaminacin durante la manipulacin de la muestra. Los ensayos multiplex de RT-PCR en tiempo real son ms rpidos, actualmente son menos sensibles que los ensayos de RT-PCR anidado.

VENTAJAS

Informacin sobre varios locus en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de bases de datos.

TRANSCRIPTASA REVERSA