KAREN JOHANA HIGUITA CRISTIN DANIELA GONZALES ERIKA YANEZ MARTINEZ CARMEN TULIA BENITEZ

El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafo para los analistas dado que se asocia con problemas significativos. Todos los antiguos mtodos biolgicos utilizados para determinar o incluso demostrar la actividad biolgica de las vitaminas, han sido en la actualidad reemplazados por mtodos microbiolgicos (EMB). Los mtodos fisicoqumicos, principalmente la cromatografa gas lquido (GLC) y la cromatografa lquida de alta presin (HPLC) han sido aplicados para solucionar muchos problemas relacionados con el anlisis de las vitaminas.

son sustancias orgnicas que son necesarias para el correcto funcionamiento del organismo. El concepto proviene del latn, vita (vida) e ina (sustancia). Estas pueden ser consideradas, como sustancias heterogneas, las cuales son imprescindibles para la vida del ser humano. Sin ellas, nosotros no podramos vivir. Las vitaminas, en nuestro organismo son esenciales para diversos procesos fisiolgicos, los cuales ocurren, como verdaderas reacciones bioqumicas; estas reacciones requieren de vitaminas para llevarse a cabo. Como por ejemplo, la conversin de la comida en energa, el fortalecimiento del sistema inmunolgico, entre otras.

son sensibles a la luz algunas se oxidan muy rpidamente. Por lo tanto, debera evitarse la luz solar directa y la luz brillante. Iluminacin artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberan realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin. Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin o a una posterior alteracin de las vitaminas.

Las vitaminas A, D, E, K y los carotenoides activos de provitamina A estn siendo determinados principalmente utilizando HPLC. G.F.M. (Ball) ha escrito una amplia revisin de los ensayos de vitaminas liposolubles en alimentos. Los mtodos para vitamina A y E son relativamente fciles de seguir por analistas experimentados, si se observan cuidadosamente las etapas ms crticas. La determinacin de la vitamina D y vitamina K es ms difcil bsicamente debido al bajo contenido encontrado en los alimentos.

La vitamina A se utiliza como un nombre genrico para describir al retinol, sus steres y los correspondientes ismeros. La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla, queso, huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao. Por lo general, se encuentra como steres de cidos grasos de cadena larga pero tambin se encuentra como retinol.

Mtodo

La HPLC se ha convertido en la actualidad en el mtodo de eleccin dado que esta tcnica acorta considerablemente el procedimientodel anlisis y aumenta la reproducibilidad y exactitud.

Se saponifican 2-10 g de muestra preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de hidrxido de potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la saponificacin adicin de un antioxidante como cido ascrbico, pirogalol o BHT. y extraccin

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una Evaporacin y temperatura que no exceda 50C dilucin

HPLC

Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa) para la cuantificacin de la vitamina A.

La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca una serie de compuesto denominados tocoferoles y tocotrienoles.. Entre las fuentes ms ricas de vitamina E estn los cereales, germen de cereales y la mayora de las semillas oleaginosas, nueces y aceites a partir de ellos. La vitamina E tambin se encuentra en los vegetales con hojas (lechuga, espinaca, repollo, puerro), en la grasa animal y tambin en la leche, mantequilla y queso. El representante ms importante del grupo de la vitamina E es -tocoferol. En los alimentos procesados, la vitamina E puede ser suplementada como -tocoferol o acetato de -tocoferol.

Metodo

Se utiliz la cromatografa de gas por algn tiempo pero muy pronto se reconocieron las ventajas de HPLC, tambin considerando la posibilidad de separar simultneamente , , , y 5-tocoferol con esta tcnica que estaba emergiendo.

Saponificacin y extraccin

Se saponifica 2-10 g de la muestra preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de etanol o metano agua, un antioxidante tal como el cido ascrbico, hidroquinona, pirogalol o BHT e hdrxido de potasio acuoso. Los tocoferoles son muy sensibles al oxgeno en un ambiente alcalino. Por lo tanto, el alcohol y el antioxidante deberan agregarse a la muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesario para la saponificacin

Evaporacin y dilucin

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C

HPLC

Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa) para la cuantificacin de los tocoferoles. El sistema de fase normal tiene claras ventajas dado que todos los vitmeros son separados mientras que los sistemas de fase reversa no separan -tocoferol de tocoferol.

La vitamina D de efecto antirraqutico se encuentra en diversas formas; las dos ms importantes son la vitamina D2, ergocalciferol, previamente conocida como calciferol y la vitamina D3, olecalciferol. La vitamina D2 se encuentra en pequeas cantidades en los aceites de hgado de pescado y algunas esponjas. La vitamina D3 est ms ampliamente distribuida en la naturaleza y se encuentra en cantidades relativamente grandes en los aceites de hgado de pescado, y en cantidades ms pequeas en pescados tales como arenque, caballa, salmones y sardinas, en huevos, mantequilla y queso crema. El bajo nivel (del orden de 0,03 g/lOOg en la leche total) hace difcil para el analista determinar los niveles naturales de la vitamina D en los alimentos.

Metodo

La HPLC ofrece actualmente el mtodo de anlisis ms adecuado para la determinacin de vitamina D

Si ha de determinarse la vitamina D3, se agrega D2 como estndar interno. Si Saponificacin ha de determinarse la vitamina D2, se agrega D3 como estndar interno. y extraccin

Evaporacin y dilucin.

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C

HPLC

Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa) para la cuantificacin de la vitamina D

La vitamina K de efecto antihemorrgico, que tiene un rol importante en regular la coagulacin sangunea se encuentra en una serie de formas; qumicamente las molculas son derivados del 2-metil-l,4- naftoquinona que tiene una cadena lateral en la posicin 3. El miembro ms importante del grupo es el compuesto dentro de la serie K1 con 20 tomos de carbono en la cadena lateral, generalmente conocido como vitamina K1. Est presente en plantas verdes, vegetales verdes (repollo, espinaca), papas, frutas (tomates, frutillas), escaramujos y tambin en aceites de hgado. La suplementacin de las frmulas infantiles con vitamina K1 ha recibido alguna atencin dado que ayuda a proteger a los recin nacidos en contra de la muerte por hemorragia.

Metodo

Los mtodos desarrollados en aos recientes para la determinacin de la vitamina K1 se basan principalmente en procedimientos HPLC.

Digestin enzimtica y extraccin

Se hace una digestin con lipasa. Se agrega fenilacetato de colesterol como estndar interno y la vitamina es extrada con hexano.

Evaporacin y dilucin

Los extractos combinados son concentrados utilizando un evaporador rotatorio bajo vaco parcial y a una temperatura que no exceda 40C

Sistema semipreparativo
HPLC

Sistema HPLC analtico

Las vitaminas del grupo B presentan buena solubilidad al agua y por lo tanto, no es sorprendente que se haya desarrollado mtodos principalmente microbiolgicos para la determinacin de estos compuestos. Los mtodos microbiolgicos tienen claras ventajas como por ejemplo, son capaces de medir cantidades muy pequeas de una vitamina en particular en un amplio rango de matrices y con una precisin razonable. Por otra parte, stos mtodos necesitan una infraestructura de laboratorio especfica, personal capacitado y en general demandan mucho trabajo y tiempo. Algunas de las vitaminas del grupo B tambin pueden determinarse utilizando procedimientos HPLC o mediante mtodos colorimtricos. Se discuten los mtodos microbiolgicos slo para aquellas vitaminas en que no se dispone de otro mtodo atractivo y confiable.

La tiamina existe en la naturaleza como tiamina, monofosfato de tiamina, difosfato de tiamina, trifosfato de tiamina y unida a las protenas. Las principales fuentes de vitamina B1 son los granos de los cereales, cascara de arroz, germen de cereales, levaduras, clara de huevo, vegetales, frutas, papas, huevos, leche,hgado y carne.

Metodo de tiocromo

Metodo utilizado para determinar vitamina B1 Hidrlisis de la muestra

Extraccin y desfosforilacion

Purificacin y reaccin del tiocromo

Metodo HPLC

Derivatizacion postcolumna

Cuantificacion de la tiamina

La riboflavina se encuentra en los alimentos como riboflavina libre o como riboflavina-5'fosfato (FMN) y como flavin adenina dinucletido (FAD). Las principales fuentes de vitamina B2 son hgado, rin, carne, pescado, leche, queso, huevos y vegetales. La solubilidad de la riboflavina en el agua es ms bien deficiente (aprox. 7 , mg/100 ml) pero en lcali diluido esfcilmente soluble.

la riboflavina puede determinarse fluorormtricamente. Ensayos microbiolgicos

METODO

adems de los mtodos HPLC lo que permite una preparacin ms simple de la muestra que el mtodo del lumicromo.

EXTRACCION Y DESFOSFORILAC ION

La muestra se hidroliza utilizando cido sulfrico

PRESIPITACION Y DILUCION

La mezcla acidificada es llevada a volumen con cido sulfrico, se filtra, se mezcla con etanol y se centrifuga

La vitamina B6 se encuentra en la naturaleza en 6 diferentes formas: piridoxamina (PM), piridoxina (PN), piridoxal (PL) y los correspondientes steres fosfatados: piridoxamina fosfato (PMP), piridoxina fosfato (PNP) y piridoxal fosfato (PLP). La cantidad relativa de estos vitmeros encontrados en los alimentos puede variar significativamente por ejemplo, PN se encuentra predominantemente en los cereales, vegetales, y frutas mientras que en la carne y los productos lcteos, PM, PMP, PL y PLP son bsicamente los responsables de la actividad de la vitamina B6.

 La vitamina B6 es extrada de la muestra por hidrlisis cida.

Extraccin y desfosforilacin

Despus de la hidrlisis, las soluciones son neutralizadas a un pH 5,0 con una solucin de hidrxido de sodio..

Microorganismo de ensayo y mtodo

El microorganismo de ensayo, Saccharomyces carisbergensis (ATCC 9080) es mantenido en un agar-APT.

Medicin de la turbidez

La turbidez de la suspensin celular se mide a 580 mn despus de mezclar bien. Para el clculo, se utiliza un estndar y se debe corregir el blanco.

Respuesta del microorganismo de ensayo

Saccharomyces carisbergensis (ATCC 9080) no responde a PM de la misma manera que a PN y PL.

Saccharomyces faecalis responde a PL y PM y Lactobacillus casei slo a PL.

Los compuestos activos de la vitamina B12 presentan una estructura qumica complicada; el ms conocido e importante es cianocobalamina. La vitamina B12 se encuentra slo en material de origen animal y en los metabolitos de microorganismos. Las fuentes importantes de B12 son el hgado, rin y yema de huevo.

Metodo

El nivel presente en los alimentos es muy bajo y el mtodo microbiolgico es la nica manera de estimar la vitamina B12 en forma satisfactoria.

Extraccin

La vitamina B12 es extrada de la muestra con agua o buffer a una temperatura de aproximadamente 100C durante 10-30 minutos

Microorgani El microorganismo de ensayo, Lactobacillus leichman (ATCC 7830) es mantenido en un agar de cultivo. smo de ensayo y metodo

Medicion de la turbidez

La turbidez de la suspensin celular se mide a 580 nm despus de mezclar bien.

Las estructuras de los compuestos con actividad de cido flico siempre contienen ligadas una o ms molculas de cido glutmico que son esenciales para la actividad biolgica. El cido flico se encuentra en la naturaleza principalmente como conjugados y se encuentra en el hgado, rin, msculos, leche, queso, vegetales de hoja oscura, coliflor,legumbres y germen de trigo.

Metodo

el ensayo microbiolgico es la nica manera de estimar la actividad del folato en forma satisfactoria.

Extraccin y deconjugaci n

El material (acido folico)se mescla con buffer fosfato, se autoclava, se enfria, se agrega solucion pancreas de pollo y se incuba por 18 horas, luego se desactiva la enzima se enfria, se diluye con acido ascorbico y se filtra.

El cultivo liofilizado del microorganismo de ensayo, Lactobacillus casei (NCIB

Microorgan ismo

10463)

Medicion de la turbidez

La turbidez de la suspensin celular se mide a 660 nm despus de mezclar bien.

El cido pantotnico libre es un aceite inestable extremadamente higroscpico; por lo tanto, no es aconsejable para aplicaciones prcticas y se utiliza principalmente en forma de sales de calcio y de sodio. En la naturaleza el cido pantotnico se encuentra raramente al estado libre; sin embargo, est ampliamente distribuido como un componente de la coenzima A y se encuentra sobretodo en el hgado, rin, msculo, cerebro y yema de huevo as como tambin en la levadura, cereales, y plantas verdes, especialmente leguminosas. El cido pantotnico es pticamente activo; slo las formas dextrorotatorias (D-pantotenatos) tienen actividad de vitamina.

Mtodo

El cido pantotnico en mezclas complejas slo puede determinarse microbiolgicamente

El material es agitado con agua durante 30 minutos a 37C en un agitador. Si el material contiene grandes cantidades Extraccin de grasa, es recomendable remover los lpidos.

El microorganismo de ensayo Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) se hace crecer en un caldo inculo Bacto-Micro Microorganis mo y esterilizado
mtodo

La turbidez de la suspensin celular se mide a 660 mn despus de mezclar bien. Medicin de

la turbidez

La biotina se encuentra parcialmente en estado libre en vegetales, frutas, leche, salvado de arroz y parcialmente en forma unida a protena en tejidos animales, semillas de plantas, levaduras. Fuentes importantes de biotina son el hgado, rin, carne, levadura, yema del huevo, leche, hongos y vegetales.

El mtodo microbiolgico es el mtodo de eleccin para la biotina. Metodo

Extraccin y digestin enzimtica

El material de ensayo se calienta en acido sulfrico, se neutraliza, se diluye con agua, las alcuotas que contengan biotina son diluidas con una solucin de papana, se incuban, luego se desactiva la enzima, se centrifuga y se filtra.

Microorganismo y mtodo

El microorganismo de ensayo Lactobacillus plantarum (ATCC 8014) se hace crecer en un caldo inculo Bacto-Micro esterilizado

Medicin de la turbidez

La turbidez de la suspensin celular se mide a 660 mn despus de mezclar bien.

El cido nicotnico y la nicotnamida poseen la misma actividad vitamnica; el cido libre se convierte a amida en el cuerpo. Los sinnimos menos usados como vitamina PP y factor PP se refieren a su actividad preventiva de pelagra. La nicotinamida se encuentra en todas las clulas, por lo general en forma unida como el grupo prosttico de coenzimas. El hgado y carne de animales con pezua son fuentes nutricionalmente importantes de esta vitamina. Tambin est presente en el maz y otros cereales en una forma no utilizada por el hombre.

La extraccin de niacina se realiza mediante hidrlisis acida (la hidrlisis alcalina liberara tambin nicotinilster ligado, el cual no es biodisponible). El ensayo microbiolgico es fcil de realizar. El microorganismo de ensayo ms comnmente utilizado es Lactobacillus plantarum. Se describe una prueba colorimtrica basada en la reaccin de Knigs que utiliza bromuro de ciangeno para la oxidacin y procana (p-aminobenzoil- dietilaminoetanol) para formar componentes coloreados.

El cido L-ascrbico se encuentra en todos los tejidos vivos como un importante compuesto redox del metabolismo celular. Fuentes importantes de la vitamina C son las frutas frescas (ctricos, uvas negras, escaramujo, pimiento rojo) y vegetales (repollo, papas, lechuga, tomates etc.).

El cido ascrbico (AA) es fcilmente oxidado a cido dehidroascrbico (ADA) y por lo tanto, es necesario seleccionar las condiciones de extraccin en forma cuidadosa con el fin de minimizar las posibles prdidas debido a las etapas de preparacin de las muestras. La determinacin del cido ascrbico presente en la muestra o en el extracto de muestra ignorando alguna presencia posible de ADA. - La determinacin del cido ascrbico "total" que incluye la suma de AA y ADA utilizando un mtodo que transforma ya sea AA a ADA o ADA a AA con la consiguiente cuantifcacin de ADA o AA.

El material (1-5 g) es extrado con 25- 50 ml de cido metafosfrico 0,5% que contiene ditiotreitol 0,2% (DTT) utilizando un homogenizador o mediante agitacin. Despus de la centrifugacin, el extracto es diluido con buffer acetato pH 4,8 que contiene DTT 0,2%, se filtra usando un filtro de 0,45 m y se inyecta en el HPLC.

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