DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA

Objetivo: Una prueba de hemoglobina es un examen que mide la cantidad total de hemoglobina en la sangre y casi siempre hace parte de un conteo sanguneo completo (CSC) Introduccin: Es una protena conjugada de color rojo integrantes de los eritrocitos entre un 31-34%. Existen varios mtodos para determinacin como hematina cida, hematina alcalina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina y cianometahemoglobina; ste ltimo es el de eleccin por que es estable en soluciones diluidas, porque existen en el mercado estndares de cianometahemoglobina y porque las lecturas se pueden hacer en espectrofotmetro de uso comn y corriente. La sangre se hemoliza por agregado de un agente densoactivo, con el ferrocianuro de potasio se oxidan el tomo de fierro de ferroso a frrico para producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la metahemoglobina pasando de cianometahemoglobina. La cloracin producida es directamente proporcional a la concentracin de hemoglobina presente. Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100 ml Pipetas de 1ml Pipetas de Sal Boquillas Gradillas Gasa Celdas para espectrofotmetro Sangre capilar o venosa con anticoagulante.

Reactivos:

EDTA al 10 % (.07 ml por .5 ml de sangre) Reactivo DE Drabkin: Ferrocianuro de potasio Cianuro de potasio Bicarbonato de potasio Solucin estndar de cianometahemoglobina.

Procedimiento: 1.2.En un tubo de ensayo, Homogeneizar colocar 5 bien ml de reactivo la de Drabkin sangre

3.Llenar en sangre hasta la marca de la pipeta de Salhi 4.- Introducir la pipeta con sangre al tubo de ensayo y dejar caer la sangre, despus mezclar bien la muestra. 5.- Se deja Reposar 10 min. Para la formacin de cianometahemoglobina 6.- Calibrar primero el manmetro y despus leer a 540 nanmetros en el espectrofotmetro contra un blanco de reactivo. 7.- comparar con la curva calibrada de estndares. Valores de referencia: Mujeres: 12 -14 gr/dl Mujeres embarazadas: 11-14 gr/dl Hombres: 13-19gr/dl Recin nacidos: 13.19gr/dl
DETERMINACIN DEL HEMATOCRITO

Objetivo: Es el porcentaje del volumen total de sangre compuesto de glbulos rojos. Es una medicin compuesta por el tamao y nmero de GR y casi siempre es parte de un conteo sanguneo completo (CSC). Dicho conteo mide el nmero de glbulos rojos (GR), glbulos blancos (GB), la cantidad total de hemoglobina en la sangre y la fraccin de la sangre compuesta de glbulos rojos (hematocrito). Introduccin: El hematocrito mide el porcentaje del volumen de sangre total pero, ocupada solamente por los eritrocitos La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un antisptico y luego se coloca una banda elstica alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presin y restringir el flujo sanguneo a travs de la vena, lo cual hace que las venas bajo la banda se llenen de sangre.Inmediatamente despus, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermtico o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulacin y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de puncin para detener cualquier sangrado.En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia con un antisptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta (tubo pequeo de vidrio), en una lmina de vidrio, sobre una tira de examen o en un recipiente pequeo. Finalmente, se puede aplicar un algodn o un vendaje en el sitio de la puncin si el sangrado persiste.En el laboratorio, se toma un poco de la sangre y se introduce en una mquina centrfuga, proceso que impulsa las clulas hacia el fondo del recipiente. La porcin celular se compara con la cantidad total de la sangre y se expresa en porcentaje. De hecho, dicha porcin celular representa casi la totalidad de los glbulos rojos, mientras que el porcentaje de glbulos blancos es muy pequeo.

Material:

Tubo de Wintrobe que tiene 11.5 cm de largo x 3 mm de luz (hueco). Para el micro se usa el tubo capilar) Pipeta Pasteur larga o Cnula Centrfuga Sangre capilar (micro) o venosa (macro) con anticoagulante

Procedimiento:

Despus de extraer la muestra de sangre se coloca en el tubo de ensayo con el anticoagulante. Homogenizar perfectamente la sangre haciendo girar el tubo. Utilizando la pipeta Pasteur o canula para llenar de sangre el tubo de Wintrobe exactamente hasta 10, no deben quedar burbujas de aire en el tubo Centrfuga a 3600 rpm. Durante 30 min. Ver resultado.

Valores de referencia: H= 47 +- 2.5 M= 42+- 2.5

CUENTA ERITROCITARIA

Objetivo: Es un examen de sangre que mide el nmero de glbulos rojos (GR) en la sangre y casi siempre se realiza como parte de un conteo sanguneo completo (CSC) Consiste en diluir la sangre con el lquido de Hayem en una proporcin exacta y luego examinar al microscopio una pequea cantidad de la muestra colocada en la cmara de Neubauer, contando el nmero de elementos que se encuentran en el retculo de la cmara y mediante una operacin matemtica se obtiene la cifra total. Introduccin: Los glbulos rojos sanguneos transportan la hemoglobina que, a su vez, transporta el oxgeno. La cantidad de oxgeno recibida por el tejido depende de la cantidad y funcin de los glbulos rojos y la hemoglobina. Normalmente, los glbulos rojos sobreviven aproximadamente 120 das en la sangre, luego son removidos por clulas especializadas en el bazo y en el hgado. Cuando la eritropoysis tiene lugar normalmente, su resultado final es la produccin de una clula-eritrocito perfectamente diferenciada y apta para su funcin principal que es la de transportar oxgeno y CO2 . La falta de ncleo le confiere la virtud de acarrear el oxgeno sin consumir prcticamente nada de el; su forma bicncava es la que mejor se presta para afrontar la hemlisis; su membrana no admite la salida de hemoglobina. Material:

Tubos de ensayo de 13x100mm Pipetas de Thomas para glbulos rojos Cmara de Neubauer Boquillas Microscopio

Gasa Gradilla Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

EDTA (sal di sdica) al 10% Lquido de Hayem: Cloruro de mercurio 0.5 g Cloruro de sodio 1.0g Sulfato de sodio 5.0g Agua destilada 100ml

Procedimiento:

llenar con sangre bien mezclada la pipeta de Thoma, hasta la marca 0.5. (Las pipetas estn constituidas por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar inferior est dividido en 10 partes iguales con marcos de0.5 y 1.0.En el interior del bulbo existe una perlita de plstico (roja), para favorecer la mezcla de la sangre con el lquido y en el capilar superior hay una marca 101) Se limpia cuidadosamente con gasa la parte externa de la pipeta para no contaminar el liquido de harem al introducir la pipeta. Llenar la pipeta con lquido de Hayem hasta la marca 101. Agitar durante 3 minutos para mezclar perfectamente. Limpiar y Colocar el cubre hematmetro sobre la cmara. Desechar las primeras 3-5 gotas de la pipeta y llenar la cmara por uno de los bordes del cubrehematmetro. Se deja que el lquidos penetre lentamente entre la cuadrcula y el cubrehematmetro hasta que la plataforma de recuento este completamente cubierta de muestra. Dejar reposar de 3-5 minutos sobre la platina del microscopio. Con objetivo de 40x se encuentra los eritrocitos contenidos en 80 cuadros pequeos; uno central y cuatro de los extremos.

Clculos: Si se considera que el retculo central tiene 400 cuadritos se realizar el siguiente clculo. N x 200 x 10 x 400 = N x 10,000 80 N= nmero de eritrocitos contados 200= factor de dilucin 10= correccin x altura de la cmara Valores de referencia: Hombres 4.5 x 106 5.5 x 106 mm3 Mujeres 4.3 x 106 5.0 x 106 mm3
CUENTA LEUCOCITARIA

Objetivo: La sangre se diluye 1:2 con una solucin hipotnica de cido actico que destruye a los eritrocitos. Introduccin: La leucopoysis es un proceso que se lleva a cabo con gran actividad, ya que si el nmero de granulositos circulantes de ninguna manera es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobre vida de los neutrfilos no excede de 5 das, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la sangre circulante. El azul de metileno permite reconocer fcilmente el lquido y observar mejor los glbulos blancos, a los que tie ligeramente Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo a su tamao y contenido de hemoglobina Se utiliza el hematocrito y la cuenta de eritrocitos para calcular los ndices:

VCM (Volumen Corpuscular Medio) CMHC (Concentracin Media de la Hemoglobina Corpuscular) HCM (Hemoglobina Corpuscular Media)

Es posible medir de manera directa los ndices eritrocitarios en contadores celulares automticos. Por ejemplo: el coulter; al pasar los eritrocitos a travs de un orificio en el cual fluye una corriente elctrica. Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100mm Pipeta de Thoma para glbulos blancos Cmara de Neubauer Microscopio Boquillas Gasa Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

EDTA (sal disdica) al 10 % Liquido de Turk: cido actico glacial 3.0 ml Agua destilada c.b.p. 100 ml Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno

Procedimiento

1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5 2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera 3.- Aforar con solucin de Turk hasta la marca de II

4.- Agitar la pipeta durante 3 min. 5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cmara de Neubauer 6.-Dejar reposar la cmara durante 3 min. 7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos 8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente frmula Clulas contadas x 20 (dilucin) x 10 (correccin de altura) /4 (nm. De cuadro de 1mm contados)

Este factor vara si se cambia la dilucin y o el nmero de cuadros contados -En caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) deber hacer la cuenta diferencial leucocitaria Valores de referencia: Leucocitos:

Adultos: 5000 10 000 / mm3 Recin nacidos: 10 000 25 000 / mm3 Nios: 8000 15 000

CUENTA DIFERENCIAL LEUCOCITARIA

Introduccin: Se realizar este proceso en caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) en la cuenta leucocitaria Por este proceso se podr decir cuantos normoblastos hay por cada 100 leucocitos. Ejemplo: Si hay 28 normoblastos por cada 100 leucocitos se aplica la siguiente relacin: 128 12000 x = 9375 leucocitos 100 x

La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del nmero de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infeccin

Tcnica: La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos:

neutrfilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene mltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lbulos nucleares. eosinfilos: es redondo u ovalado, el ncleo posee no ms de tres lbulos y en el citoplasma se observa no mas de 20 granos color naranja. basfilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos grnulos son hidrosolubles. linfocitos: Su citoplasma es azul plido y la cromatina nuclear color prpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma. monocitos: su ncleo suele ser arrionado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tie de un color azul grisceo y contiene finas granulaciones color rosa.

Valores de referencia: Neutrfilos: *En banda 0-11% *Segmentados 25-62% Eosinfilos: 0-2% Basfilos: 0-1% Linfocitos: 25-40% Monocitos: 3-12%
TINCIN DE WRIGHT

Fundamento: La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematologa este tipo de tincin, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de informacin a partir del examen de un frotis de sangre perifrica bien teido Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico. La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas. Material:

Frotis sanguneo Agua destilada Eosina B

Eosina Y Azul de metileno Alcohol metlico

Procedimiento: 1.- Hacer un frotis sanguneo, ni demasiado delgado, ni que llegue al extremo del portaobjetos 2.- Fijar el frotis con alcohol metlico y dejar secar 3.- Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1, durante 5 o 6 segundos 4.- Lavar con Buffer 7.2 y sacudir para eliminar exceso 5.- Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2 6.- Lavar con buffer 7.2 y dejar secar 7.- Observar al microscopio
CUENTA PLAQUETARIA

Introduccin: Las plaquetas son fragmentos de una clula llamada megacariocito, se encuentran unas 250 mil x mm3 , su vida media es de 9.5 das, sus funciones principales son: coagulacin y mantener la integridad de las paredes de los vasos. Miden de 3-4 micras de dimetro, son redondeadas, se pueden observar con una tincin azul de crisil brillante, no tienen ncleo; el nmero de plaquetas es el resultado el equilibrio entre el numero de plaquetas producidas en la mdula sea y las utilizadas, tambin de la prdida o destruccin de la sangre perifrica. Material:

sangre venosa con EDTA al 10% tubo de ensayo de 13 x 100ml pipeta de Thoma para glbulos rojos cmara de Neubauer caja de petri gradilla

Reactivos:

Colorante de azul de cresil brillante EDTA al 10 %

Procedimiento: 1.Asepsia y obtencin de la muestra Adultos o nios: La sangre se extrae de una vena (puncin venosa), usualmente de la parte interior del codo o

del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un antisptico y luego se coloca un torniquete. Bebs o nios pequeos: En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia con un antisptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta. 2.-Descargar la pipeta en el lquido diluyente 3.-Enjuagar y llenar hasta la marca 1 y con la , muestra de sangre hasta 1.1 4.-Mezclar de 3-5 minutos 5.-Tirar las primeras 3-5 gotas 6.-cargar la cmara cuenta glbulos 7.- dejar reposar 5 minutos, en una caja petri con un papel filtro hmedo 8.- Dejar reposar la cmara 9.- observar por le objetivo 10x 10.- las plaquetas aparecen como cuerpos coloreados en todo el cuadro central. Clculo: Numero de plaquetas contadas x 1000 Valores de referencia: 150 mil- 450 mil /mm3 Cuidados durante el examen: Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras slo sienten un pinchazo o sensacin de picadura. Despus, puede haber una sensacin pulstil. El conteo plaquetario se puede ver afectado por muchos estados patolgicos. Igualmente, se puede medir para evaluar la causa de un sangrado excesivo. Entre los medicamentos que pueden disminuir el conteo de plaquetas estn: agentes quimioteraputicos, cloranfenicol, colchicina, agentes bloqueadores H2, heparina, hidralacina, indometacina, isoniacida, quinidina, estreptomicina, sulfonamida, diurticos tiazdicos y tolbutamina.