Trabajo Prctico N 4 y N 5

Aislamiento, cuantificacin de ADN y electroforesis en gel de agarosa

Curso de Introduccin a la biologa celular y molecular

Integrantes

Ivana Varchavsky Facundo Paradiso Matas Ciancaglini

Profesores
Titular: Dr. Hernan Farina Instructores: Dra. Giselle Ripoll Lic. Julieta Gasparri

Aislamiento, cuantificacin de ADN y electroforesis en gel de agarosa

I.B.C.M.

Resumen
El objetivo de este trabajo fue el aislamiento de ADN total y ADN plasmdico de un cultivo de bacterias E. Coli. El trabajo se realizo en dos etapas, en la etapa inicial se realizo la extraccin del ADN mediante tcnicas tales como la desnaturalizacin alcalina, precipitacin salina y precipitacin alcoholica. En la segunda etapa, se realizo una cuantificacin y un anlisis de la pureza de las muestras obtenidas; esto se logro analizando la realcion OD 260 nm / OD 280 nm. Los resultados obtenidos en dichos anlisis fueron: ADN total: Relacin 1,49 Concentracin 1008,3 g/ml ADN plasmdico: Relacin 1,53 Concentracin 6570,1 g/ml Se realizo una electroforesis en gel de agarosa en la cual fue posible la identificaciones de las bandas correspondientes al ADN cromosmico, ADN plasmdico y ARN.

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Introduccin
Los plsmidos son molculas de ADN extra cromosmico, circulares cerradas covalentemente y generalmente se encuentran en muchas especies bacterianas. Los plsmidos tienen la capacidad de replicarse de manera independiente al ADN cromosmico ya que no son necesarios para la viabilidad general de la clula pero estos pueden llegar a contener genes que contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales; ya que los genes existentes en ellos codifican para los distintos caracteres fenotpicos tales como: resistencia a antibiticos, produccin de antibiticos, resistencia a metales pesados, degradacin de compuestos aromticos, etc. Los plsmidos son una herramienta muy til en la biologa molecular porque son uno de los vectores ms sencillos de utilizar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de ADN el cual se pretende clonar; en la clula hospedadora, el vector se replica y expresa. El vector recombinante es la molcula que resulta de la unin del ADN con el inserto (vector con ADN de inters). Para ser utilizado como vector de clonacin un plsmido debe poseer las siguientes caractersticas: Debe tener su propio origen de replicacin y por lo tanto la capacidad de replicacin autnoma independiente del genoma del hospedador. Debe tener sitios de clonacin mltiple que permitan la apertura del ADN con enzimas de restriccin y por lo tanto va a ser posible la clonacin de insertos de ADN. Debe poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar las clulas hospedadoras que contengan el vector.

La calidad de las purificaciones de cidos nucleicos se comprueba rutinariamente mediante electroforesis en geles de agarosa, tcnica que permite realizar posteriormente, un anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm. Este mtodo proporciona una estimacin simple y precisa de la concentracin de una muestra, pero slo si sta se encuentra pura, sin contaminacin significativa de protenas o solventes orgnicos que absorben a longitudes de onda similares. La pureza de la muestra se determina mediante la proporcin [ A260 nm/ A280 nm]: La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo la absorbancia a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. Si sta es aproximadamente 2 (de 1,6 a 2) la absorcin es mayoritariamente debida a cidos nucleicos. Si es menor a 1,6, hay protenas u otras molculas que absorben a la misma longitud de onda en la muestra y es recomendable
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una re-extraccin con fenol/cloroformo y precipitacin con etanol o isopropanol. La purificacin de DNA plasmdico es la base de cualquier experimento de clonacin molecular. El problema principal que hay que resolver es la separacin del DNA plasmdico y DNA cromosmico. En esta prctica hemos elegido el mtodo de lisis alcalina, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La tcnica de purificaciones de lisis alcalina se basa en la lisis celular y desnaturalizacin del ADN mediante NaOH (medio bsico) y SDS (detergente), las condiciones alcalinas (pH 12 12,5) desnaturalizan por completo las molculas lineales de ADN pero no las molculas de ADN circulares cerradas covalentemente las cuales, solo sufren una desnaturalizacin parcial. El ADN cromosmico se encontrara mayoritariamente en forma fragmentada y el plsmido que en relacin es mas pequeo se encontrara cerrado. Al neutralizar el medio y aadir una alta concentracin de sal (acetato de potasio) sucede la renaturalizacin en condiciones en las que slo el ADN plasmdico recupera su estructura nativa gracias a su pequeo tamao y su naturaleza circular superenrollada; se produce la precipitacin de gran parte de las protenas debido al tratamiento previo con SDS y a la alta concentracin de sales. El ADN cromosmico tambin precipita probablemente porque se producen re asociaciones al azar entre las diferentes regiones de este ADN y por lo tanto se forman agregados insolubles. Por el contrario el ADN plasmdico se renaturaliza correctamente y queda en el sobrenadante. La purificacin del plsmido se completa luego de la precipitacin con etanol ya que el cambio de polaridad del medio que genera el etanol y la disminucin de la temperatura vuelven insolubles al ADN pudindose recuperar un precipitado gracias a varias centrifugaciones. Un mtodo que permite visualizar ADN plasmdico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en funcin de su tamao. Esta tcnica consiste en someter la mezcla de molculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo elctrico. Las molculas de ADN son atradas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las molculas ms pequeas migran ms rpido que las grandes al verse menos frenadas por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solucin que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molcula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluoresce cuando est unido a l. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a molculas de ADN. Debido a que el mtodo separa los cidos nucleicos en funcin de su tamao, tambin proporciona informacin sobre el peso molecular y longitud, as como la pureza de las macromoleculas.

Electroforesis submarina en geles de agarosa. La cubeta se aloja en su parte central al soporte (gel). La flecha horizontal indica la direccin de migracin de la muestra. El molde empleado se muestra en la parte superior; habitualmente, en la cubeta se colocan ambos, molde y gel, como una unidad.

La agarosa es un polisacrido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar macromolculas
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tales como cidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolucin que la poliacrilamida pero una gran rango de separacin, tal que pueden ser separadas molculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las concentraciones de agarosa). El tamao del poro del gel puede ser predeterminado ajustando su concentracin en el gel; entonces a mayor concentracin menor tamao de poro. El rango de trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separacin (resolucin) de grandes fragmentos de ADN (510kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeos (0.21kb). Hay que tener en cuenta que los geles de bajo porcentaje son muy frgiles y se pueden romper al intentar levantarlas, y los de alto porcentaje suelen opacarse mucho, disminuyendo la visibilidad de las bandas. En lineas generales, 1% es una concentracin estandar.

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Metodologa empleada:
Extraccin de ADN total de bacterias 1. Se tomaron 500 l de la suspensin de bacterias y se adicionaron 500 l de fenol:cloroformo:isoamilico (25:24:1). Y se mezclo con el vortex durante aproximadamente 5 segundos. Luego se centrifugo a 14.000 rpm durante 5 minutos. 2. Utilizando una p200 se colecto la fase acuosa superior del eppendorf (aproximadamente 400 l) a la cual se le adiciono 1 volumen de cloroformo y se mezclo con el vortex durante aproximadamente 5 segundos. Luego se centrifugo a 14.000 rpm durante 5 minutos. 3. Se transfiri la fase acuosa superior hacia otro eppendorf al cual se le adiciono 1000 l de etanol 96% y fue incubado durante 30 minutos a una temperatura de -20C para la precipitacin del ADN. La muestra fue centrifugada a 14.00 rpm y 4C durante 10 minutos. 4. Se descarto el sobrenadante teniendo sumo cuidado y se lavo el eppendorf utilizando 1000 l de etanol 70% para la eliminacin de restos salinos. La muestra se centrifugo a 14.000 rpm durante 5 segundos y se descarto el sobrenadante. 5. Se seco el eppendorf de ADN a 50C y se lo resuspendio en 20 l de H2Od. Dicha muestra fue almacenada a 20C. Extraccin de ADN plasmdico de bacterias Solucin 1: glucosa 40 mM, EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM (pH 8,0). Solucin 2: NaOH 0,2 N, SDS 1% (w/v). Preparar en el momento de usar mezclando volmenes iguales de NaOH 0,4N y SDS 2%. Solucin 3: Kac 3M + Hac, pH 4,8. Mantener a 4 C

1.

Se tomaron 1,5 ml de la suspensin de bacterias E. Coli. Se colectaron las clulas de dicho cultivo mediante la centrifugacion a 5000 rpm durante 3 minutos a la que luego se le descarto el sobrenadante. A dicha muestra se le aadi 1,5 ml del cultivo de bacterias. 2. Se resuspendi la muestra del paso 1 mediante la utilizacin del vortex. Se centrifugo a 5000 rpm durante 3 minutos. 3. Se prepar la solucin 2 mezclando 200 l de NaOH 0,4 N y 200 l de SDS 2%. 4. Para lavar las clulas, se resuspendio el pellet celular utilizando 200 l de la solucin 1 (glucosa 40 mM, EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM pH8,0). Luego se realizo una centrifugacin a 5000 rpm durante 5 minutos y se descarto el sobrenadante. 5. Se adicionaron 100 l de la solucin 1 y se resuspendieron las clulas utilizando el vortex. Se adicionaron 200 l de la solucin 2 y se mezclo suavemente por inversin hasta que se lodro observar que la suspensin se aclaro debido a la lisis celular. Se

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adicionaron 150 l de la solucin 3, se homogenizo suavemente por inversin durante 5 segundos. 6. Se adicionaron 200 l de cloroformo, se agito y se dejo reposar durante 90 segundos a temperatura ambiente. Se realizo una centrifugacin a 14000 rpm durante 5 mintuos. Se trasvaso el sobrenadante hacia otro eppendorf teniendo cuidado de no interrumpir la fase formada. 7. Se precipit el ADN mediante el agregado de 1 volumen isopropanol frio y 24 hrs de incubacin a -20C. Luego, se colecto el ADN mediante una centrifugacin a 14000 rpm y se descarto el sobrenadante. Se lavo el eppendorf de ADN mediante el agregado de 1000 l de etanol 70%. Se seco el pellet a temperatura ambiente y fue resuspendido en 20 l de H2Od y por ultimo almacenado a 20C. Cuantificacin de cidos nucleicos en solucin

1.

Se tom 2 ul de la muestra de cidos nucleicos y se agreg 98 ul de agua desionizada. Luego se mezcl y se transfiri a una cubeta. 2. Se midi en el espectrofotmetro la densidad ptica (OD) a 260 nm. 3. Para analizar la pureza de la muestra, se tom una segunda lectura a 280 nm y se determin de la relacin de OD a 260nm / OD a 280 nm. Preparacin del gel de agarosa 1. Se colocaron 100 ml de la solucin de agarosa en un bao a 100 C o durante 90 segundos en un microondas hasta que se fundi la agarosa y se observ un aspecto homogneo. La solucin contena: Agarosa 1% en buffer TBE 0,5X. 2. Cuando la solucin se encontraba fundida y homognea se la dej enfriar hasta que se poda tocar con la mano (de esta manera se evita que se rompa el soporte donde se monta el gel). 2. Se agit y se volc la solucin en la cuba de electroforesis, que ya tena el peine y los separadores ubicados. Se evit la formacin de burbujas. Se esper aproximadamente 15 minutos hasta que el gel enfr y solidific. 4. Se retir cuidadosamente el peine. 4. Se mont el gel en la cuba y se agreg el volumen de TBE adecuado para cubrir el gel. 4. Se prepararon las muestras con loading buffer y Sybr Green (para sembrar 5 g de ADN por muestra) y se sembraron en las distintas calles. Luego se col el marcador de peso molecular en la primer calle. 7. Se conect a la fuente y se corri a 70 voltios. 7. Finalizada la corrida, se observaron los resultados mediante un transiluminador con luz UV y se fotografi el gel.

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Resultados
ADN plasmdico Resultados obtenidos mediante el uso del espectrofotmetro. Concentracin: 6570,1 g/ml Relacin OD: 1,53 Cantidades de siembra 6570,1 ug ____ 1x103 l 10 ug ____ x = 1,52 l Se tomaron 2 l de DNA plasmdico (debido a la disponibilidad de pipetas) Cantidades de masa de ADN sembrado 1000 ul ___ 6570,1 g 2 ul ___ x = 13,14 g DNA plasmdico Se mezclaron 2 ul de Sybr Green y 4 ul de Loading Buffer. Se complet con H2O hasta un volumen final de 20 ul. ADN total Resultados obtenidos mediante el uso del espectrofotmetro. Concentracin: 1008,3 g/ml Relacin OD: 1,49 Cantidades de siembra 1008,3 ug ___ 1x103 ul 10 ug ___ x = 9,91 ul Se tomaron 10 l de DNA total Se mezclaron 2 l de Sybr Green y 4 l de Loading Buffer. Se complet con H2O hasta un volumen final de 20 l. Cantidad de masa de DNA sembrado 1000 ul ___ 1008,3 g 10 ul ___ x = 10,08 g DNA total

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Electroforesis en gel de Agarosa

Gel de agarosa Calle L ladder Calle 3 ADN total Calle 4 ADN plasmdico

ADN cromosmico ADN plasmdico ADN plasmdico

ADN cromosmico

ADN plasmdico

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Conclusin
Para determinar la pureza de las muestras de DNA se realiz la absorcin a 260 nm y luego otra a 280 nm para calcular la relacin OD 260nm/OD 280 nm. Las dos muestras arrojaron nmeros menores a 1,6 lo que indica que ambas no estaban purificadas lo suficiente en DNA (haba otras macromoleculas contaminando la muestra que absorban a diferentes longitudes de onda) como para poder realizar una cuantificacin confiable. Este error se pudo haber debido a un incorrecto manejo del instrumental (micropipetas), mala preparacin de las soluciones, o bien a la falta de centrifugaciones. La electroforesis en gel de agarosa, es una de las tcnicas mas utilizadas para caracterizar cidos nucleicos, ya que permite separar las molculas cargadas en funcin de su forma y su tamao, es posible conocer el peso molecular de los fragmentos de ADN si se aade un marcador de peso molecular (fragmentos de ADN de tamao conocido), se puede llegar a calcular el tamao aproximado del ADN en el estudio. En la electroforesis en gel de agarosa, teniendo en cuenta que el ADN presenta una carga negativa a pH neutro, el desplazamiento en el gel depende del tamao y conformacin del mismo. Los resultados esperados eran que el ADN cromosmico presentara el menor Rf debido a su tamao. En cuanto al plsmido, se esperaba que las superenrrolladas fueran las que realizaran la mayor migracin hacia el polo positivo ya que estas pueden atravesar el gel de agarosa mas fcilmente por su conformacin compacta. Luego se esperaba que la banda intermedia correspondiera a las molculas lineales y por ultimo en cuanto a las molculas de circulo abierto, se esperaba que estas migraran una menor distancia ya que debido a su conformacin laxa, presentaran una mayor dificultad para atravesar el gel. Y hacia el final de la calle, se esperaba encontrar el ARN. Al realizar un anlisis ms detenido de la calle 4, se puede observar que existe un error operativo ya que se puede observar una mancha inicial la cual al comprarla con el marcador podramos llegar a la conclusin de que se trata de ADN cromosmico, esto puede deberse a una mala purificacin. A medida que se va descendiendo por dicha calle, se puede apreciar una mancha de gran tamao la cual podramos caracterizar como ADN plasmdico. En la calle 3, es posible observar 4 bandas diferentes; la primera de ellas correspondera al ADN cromosmico. A continuacin las dos siguientes bandas se encuentran cercanas entre ellas y a partir de esto podemos decir que estas corresponden al ADN plasmdico. Y por ltimo, la banda final podemos decir que podra tratarse de ARN.

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