Fundao Oswaldo Cruz Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas Ps Graduao em Pesquisa Clnica em Doenas Infecciosas Laboratrio de Imunoparasitologia

Projeto de Doutorado

Avaliao comparativa da resposta imune anti-Leishmania de pacientes com leishmaniose tegumentar americana tratados com diferentes esquemas utilizando antimoniato de meglumina.

Por: Thalita Gagini Braga

Orientador: Dr. Armando de Oliveira Schubach Co-orientador: Dr. Sergio Coutinho Furtado de Mendona

2010
NDICE
1. 2. 3. 4. 4.1 4.2 5. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.1 5.5.2 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6. 7. 7.1 7.2 7.3 8. 9. 10. 11. 11.1 11.2 RESUMO INTRODUO JUSTIFICAIVA OBJETIVO Geral Especfico METODOLOGIA Grupo de Estudo Critrios de elegibilidade Critrio para interrupo definitiva do tratamento do estudo Critrios para retirada do estudo (mas no da anlise de dados) Testes sorolgicos Deteco de anticorpos anti-leishmania por Imunofluorescncia Indireta Deteco de anticorpos por ELISA Dosagem de TNF- no soro Obteno de CMSP Resposta proliferativa de linfcitos Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMSP Caracterizao do fentipo de clulas reativas a Leishmania Quantificao das clulas produtoras de IFN- e IL-4 por Elispot Anlise estatstica RESULTADOS ESPERADOS RESULTADOS Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMPS Caracterizao do fentipo de clulas reativas a leishmania Avaliao clnico-epidemiolgica CRONOGRAMA EQUIPE REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ANEXOS TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIMENTO CRONOGRAMA DE EXECUO DO PROJETO GERAL- EM DIAS PAG. 3 4 14 15 15 15 16 16 17 17 18 18 18 18 19 19 20 20 21 22 23 23 23 23 25 31 33 34 35 41 41 45

1. RESUMO
Este projeto de doutorado est vinculado ao projeto intitulado Ensaio clnico fase III para leishmaniose tegumentar americana. Equivalncia entre o esquema padro e alternativos com antimoniato de meglumina, coordenado pelo Dr. Armando Schubach, que visa comparar o tratamento antimonial recomendado pelo Ministrio da Sade do Brasil para o tratamento da LTA com esquemas alternativos utilizando o mesmo frmaco. Devido grande diversidade das leishmanioses humanas, no existe um nico esquema teraputico ideal para todas elas. Com freqncia, resultados obtidos em ensaios teraputicos individuais servem de base para recomendaes de tratamento para outras formas de leishmaniose causadas por outras espcies de Leishmania, em outros continentes, em populaes significativamente diferentes do ponto de vista gentico, social, econmico e cultural e submetidas a condies de vida distintas no que se refere a fatores que podem interferir diretamente na eficcia e adeso ao tratamento, como disponibilidade de atendimento mdico especializado, distncia deste atendimento e condies de transporte. Idealmente, os regimes teraputicos mais adequados deveriam ser estabelecidos para cada rea endmica, com base na experincia regional. O projeto geral um ensaio clnico de fase III, controlado com o tratamento padro, randomizado e duplo-cego. Nele participaro pacientes com leishmaniose cutnea alocados em quatro grupos de 66 indivduos que recebero diferentes esquemas teraputicos base de injees intramusculares de Glucantime: I) 20mg Sb5+/kg/dia por 20 dias contnuos, II) 20mg Sb5+/kg/dia intermitente em 2 sries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo, III) 5mg Sb 5+/kg/dia por 30 dias contnuos, IV) 5mg Sb5+/kg/dia intermitente em 3 sries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo. A evoluo da resposta anti-Leishmania durante e aps o tratamento tem sido estudada e alguns parmetros imunolgicos tm sido propostos como marcadores de evoluo favorvel, como a razo entre as produes das citocinas interferon- e interleucina (IL)-10, a freqncia de clulas T CD8+ reativas a Leishmania e a diminuio dos nveis sricos de TNF- e de anticorpos especficos. Este projeto tem como objetivo avaliar possveis diferenas na evoluo da resposta imune contra o parasito associadas aos diferentes esquemas teraputicos. A resposta imune anti-Leishmania ser estudada antes e aps o tratamento em pacientes dos quatro grupos atravs das seguintes tcnicas: dosagem de anticorpos sricos anti-Leishmania por imunofluorescncia indireta e ELISA, resposta proliferativa de clulas mononucleares de sangue perifrico (PBMC), caracterizao das clulas reativas por tcnica de citometria de fluxo multiparamtrica, dosagem de citocinas (IFN-, IL-10, IL-5, IL-13, TNF-, entre outras) nos sobrenadantes das culturas de PBMC e avaliao das freqncias de clulas produtoras de citocinas relevantes

(IL-4 e IFN-) por ELISPOT. A evoluo da resposta imune dos pacientes dos quatro grupos ser avaliada durante o tratamento por meio de citometria de fluxo multiparamtrica e ELISA.

2. INTRODUO
As leishmanioses so um grupo de doenas causadas por diversas espcies do gnero Leishmania, que se apresentam com um espectro de formas clnicas tegumentares e viscerais, de carter crnico, muitas vezes deformante e at fatal. Os quatro padres clnicos da doena no hospedeiro humano so leishmaniose cutnea (LC), leishmaniose cutnea difusa (LCD), leishmaniose mucosa (LM), e leishmaniose visceral (LV) (Khatami, A.; 2007). A classificao atual do gnero Leishmania segue o modelo taxonmico proposto por Lainson & Shaw (1987), que dividem as leishmnias nos subgneros Viannia e Leishmania. No Brasil so reconhecidas pelo menos sete espcies de Leishmania responsveis por doena humana, sendo a LTA causada principalmente pela L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis e, mais raramente, pela L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi e L. (V.) shawi, enquanto a L. (L.) chagasi a responsvel pela doena visceral. Cada espcie apresenta particularidades concernentes s manifestaes clnicas, a vetores, reservatrios e padres epidemiolgicos, distribuio geogrfica e at mesmo resposta teraputica (Siviero do Vale e Furtado, 2005). Os parasitos do gnero Leishmania so flagelados da Famlia Trypanosomatidae, Ordem Kinetoplastida, Filo Protozoa. A ordem Kinetoplastida caracteriza-se por apresentar uma mitocndria nica (denominada cinetoplasto) rica em DNA mitocondrial, o kDNA (Simpson, 1987; Wirth, 1990). Esta organela localiza-se anteriormente ao cinetossoma do flagelo, perpendicularmente ao eixo maior do organismo, tendo sido muito estudada no gnero Leishmania (Chakrabarty et al., 1962). As caractersticas morfolgicas dos gneros que compem a famlia Trypanosomatidae so bem homogneas, sendo que todas as espcies desta famlia so parasitos. Os parasitos do gnero Leishmania so protozorios heteroxenos, que se reproduzem por diviso binria, e apresentam em seu ciclo de vida duas formas evolutivas: a forma promastigota, que flagelada e extracelular, sendo encontrada no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado; e a forma amastigota, intracelular e sem movimentos, que parasita as clulas do sistema fagoctico-mononuclear dos hospedeiros vertebrados. As

promastigotas apresentam corpo alongado, medindo entre 14 e 20 m e flagelo livre. As amastigotas tm corpo ovide, medindo entre 2,1 e 3,2 m e flagelo interno (Pessoa e Martins, 1982).

Figur

a 1- Ciclo de vida da Leishmania spp. Adaptado de: www.nature.com/.../v2/n11/fig_tab/nri933_F1.html

O parasito se reproduz no intestino do flebotomneo e introduzido no organismo do hospedeiro pela picada, enquanto este faz seu repasto sangneo. No organismo, as formas promastigotas so fagocitadas pelos macrfagos da pele sem sofrer destruio. Dentro do macrfago, o parasito perde seu flagelo e adquire a forma amastigota, se reproduzindo dentro das clulas de defesa e as destri. Mais amastigotas so liberados no organismo, continuando a infeco. Alguns tipos de leishmnia permanecem na pele, ou migram para as mucosas (revestimento mido) da boca ou do nariz, causando a leishmaniose

tegumentar. Outros migram para rgos como o fgado e o bao, provocando a leishmaniose visceral. A adeso de Leishmania membrana do macrfago pr-requisito para sua fagocitose. Diferentes molculas integram a membrana de superfcie das leishmnias, tais como glicoprotenas (gp) e glicolipdios, fundamentais para sua interao com os macrfagos, sendo a gp63 (gp63 ou PSP - promastigote surface protease) e o lipofosfoglicano (LPG) as principais molculas ligantes (Handman & Goding 1985, Russell & Wilhelm 1986) . A pequena frao do inculo infectante que consegue internalizar-se em macrfagos, a partir da ligao direta dessas molculas com receptores de membrana das clulas, determina uma srie de reaes bioqumicas que podem levar ativao ou inibio das funes parasiticidas da clula hospedeira. A ativao caracteriza-se pela deflagrao de processos oxidativos (sistema microbicida dependente de oxignio) e produo de xido ntrico (Georges et al. 1990) . medida que ocorre o processo de fagocitose, os lisossomas das clulas fundem-se aos vacolos parasitforos formados, resultando em uma modificao do seu microambiente, que induz transformao da forma promastigota para amastigota, que se multiplica, rompendo a clula infectada para invadir novos macrfagos e dar continuidade infeco. Na forma amastigota, o parasito torna-se mais resistente e desencadeia menor resposta oxidativa da clula hospedeira (Antoine et al. 1990) . Os vetores da leishmaniose so dpteros da famlia Psychodidae, hematfagos pertencentes aos gneros Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo), com vasta distribuio nos climas quentes e temperados. So chamados popularmente no Brasil de mosquito palha, biriguis e tatuquiras. Somente as fmeas so hematfagas. So geralmente de pequeno porte. Tm atividade crepuscular e ps-crepuscular, abrigando-se durante o dia em lugares midos, sombrios e bem protegidos dos ventos (Rath, S. et al, 2003). Os hospedeiros vertebrados das espcies envolvidas com as manifestaes tegumentares so animais silvestres como roedores, gamb, tamandu, tatu, candeos, primatas e preguia; e animais domsticos como ces, eqdeos e o homem. As leishmanioses ocorrem em quatro continentes, sendo consideradas endmicas em 88 pases, dos quais 72 so pases considerados em desenvolvimento. Segundo a Organizao Mundial da Sade, 90% dos casos de LC ocorrem no Afeganisto, Brasil, Ir, Peru, Arbia Saudita e Sria. Com mais de 12 milhes de infectados em todo o mundo, esta zoonose encontra-se em expanso no Brasil, ocorrendo de forma endmica no Norte,

Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (Rath, S; 2003). As manifestaes clnicas da doena e a resposta ao tratamento esto parcialmente relacionadas a espcie de Leishmania envolvida (Lainson & Shaw 1987, Alexander & Russell 1992, Grogl et al. 1992, Navin et al. 1992, Belli et al. 1998). Por LTA, entende-se um conjunto de enfermidades causadas por vrias espcies de protozorios do gnero Leishmania, que acometem a pele e/ou mucosas das vias areodigestivas superiores do homem, e de diferentes espcies de animais silvestres e domsticos das regies tropicais e subtropicais. No Rio de Janeiro, a espcie predominante a Leishmania (Viannia) braziliensis. (Marzochi & Marzochi 1994). Em trabalho desenvolvido em 2007, Azeredo-Coutinho e colaboradores relataram o primeiro caso autctone de leishmaniose cutnea difusa e tambm o primeiro caso de infeco em humano causado por L. amazonensis no estado do Rio de Janeiro, onde apenas casos de infeco por L. braziliensis haviam sido relatados. A lcera tpica de LC indolor e costuma localizar-se em reas da pele expostas picada de insetos; com formato arredondado ou ovalado; medindo at alguns centmetros de tamanho; base eritematosa, infiltrada e de consistncia firme; bordas bem delimitadas e elevadas; fundo avermelhado e com granulaes grosseiras. A infeco bacteriana associada pode causar dor local e produzir exsudato seropurulento que ao dessecar-se em crostas recobre total ou parcialmente o fundo da lcera (Pessa & Barretto 1948, Marsden 1986) . Caso no tratadas, as leses tendem cura espontnea (Marsden et al. 1984, Costa et al. 1990) em perodo de alguns meses a poucos anos, podendo tambm permanecer ativas por vrios anos e coexistir com leses mucosas de surgimento posterior leishmaniose cutneo-mucosa (LCM) (Pessa & Barretto 1948, Marsden 1986) .

Quadro 1 - Diferenas entre as formas clnicas da leishmaniose tegumentar (Atlas de Leishmaniose Tegumentar Americana: diagnsticos clnico e diferencial). Ministrio da Sade Editora do Ministrio da Sade, 2006).

A leishmaniose mucosa (LM) manifesta-se por leses destrutivas, de evoluo arrastada, localizadas nas mucosas do nariz, boca, faringe e laringe. A forma mucosa pode ocorrer vrios anos aps a cicatrizao da leso cutnea primria (Lainson 1983, Jones et al. 1987) e acredita-se que seja conseqente a metstases por via hemtica (LlanosCuentas et al. 1985). O mecanismo exato da produo da leso mucosa, como as leishmnias sobrevivem em latncia no organismo humano durante anos e os fatores que desencadeiam a doena so ainda desconhecidos. Sabe-se que as leishmnias

permanecem vivas em cicatrizes (Schubach A, et al. 1998). Sua sobrevivncia depende da presena de IL-10, uma citocina que inibe a resposta celular antgeno-especfica, tornando os macrfagos no responsivos aos sinais de ativao, causando uma supresso da resposta imune (Nyln S. et al., 2007). Essa citocina possui um forte efeito inibitrio da produo e funo do IFN- e da capacidade citotxica e de apresentao de antgenos dos macrfagos. Diversos estudos tm demonstrado que a imunidade celular tem papel crucial na cura da leishmaniose cutnea (Mendona et al., 1986). A interao entre linfcitos T e macrfagos considerada indispensvel na imunorregulao da leishmaniose cutnea; entretanto ainda no se tem por completo esse conhecimento acerca de quais so os mecanismos e como eles podem ser manipulados para aumentar a efetividade das drogas usadas no tratamento. (Botelho ACC et al. 2009). Mendona e seus colaboradores sugeriram em 1995 que a ativao de respostas protetoras ou no-protetoras, principalmente nos primeiros estgios da doena, devida ao tipo de padro de citocinas que foi produzido por subpopulaes distintas de linfcitos. A IL-4 est associada com a forma ativa da doena, sendo detectada antes da terapia antimonial, mas no aps a cura (Da-Cruz et al, 2002). Altos nveis desta citocina tem sido detectados em pacientes com leses mucocutneas crnicas e tambm em leishmaniose visceral (Kharazmi A, et al. 1999). A IL-13 uma citocina derivada do brao de resposta celular Th2, com similaridades estruturais e biolgicas em relao a IL-4. Estas partilham ao menos um receptor. (Finkelman et al, 1999). A funo exata da IL-13 ainda desconhecida, mas acredita-se que ela possa promover a produo de citocinas por clulas Th2 (MacKenzie et al, 1998). Outros autores confirmam estes achados, concluindo que IL-4 e IL-13 atuam favorecendo a infeco, promovendo a resposta celular Th 2 na leishmaniose por L. major. J a IL-5 e IL-10 parecem ter uma importante funo, determinando o curso da doena nos momentos iniciais da infeco, onde tambm ativam a resposta celular Th2 (Nashed BE, et al. 2000). A IL-5 foi originalmente reconhecida pela sua atividade como fator de crescimento de clulas B, recentemente sua funo no desenvolvimento de clulas B1 e na produo de anticorpos foi descrita (Apostolopoulos et al. 2000). O IFN- uma citocina pr-inflamatria que atua ativando macrfagos, que capturam os parasitos durante a infeco (Kharazmi, 1999). Da-Cruz e cols (1994) demonstraram que linfcitos T reativos a L. braziliensis retirados do sangue de pacientes com LC e estimulados in vitro foram capazes de produzir nveis muito maiores de IFN- em cultura do que clulas de indivduos controle no-infectados. Os nveis de IFN- foram maiores no final da terapia

do que antes desta, sugerindo que a capacidade de induzir produo de IFN- aumenta durante o processo de cicatrizao. Em outro estudo, aumento nos nveis de clulas T CD8+ e declnio de T CD4+, causando um equilbrio nas propores, tambm foi verificado (DaCruz et al, 2002). Neste estudo foi sugerido que o aumento nos nveis de clulas T CD8 + reativas a Leishmania e a produo de IFN- podem ser importantes para a cicatrizao das leses e provavelmente tambm para a proteo imunolgica. A presena da citocina pr-inflamatria fator de necrose tumoral (TNF) no sitio de infeco essencial para realizar a efetiva migrao de um nmero suficiente de clulas dendrticas apresentadoras de antgeno (Martin-Foncheta et al. 2003). Esta citocina de fundamental importncia para a infiltrao celular nos tecidos e tem importante funo na maturao de clulas dendrticas e subseqente expresso do receptor de quimiocinas CCR7(Ohl et al. 2004). TNF- faz sinergia com IFN- na induo da expresso de xido ntrico-sintase induzida (NOS2) e produo de xido ntrico (NO) por macrfagos in vitro. Alm disso, a administrao de TNF- recombinante a linhagens resistentes ou susceptveis de camundongos infectados com L. major melhora o curso da doena. Outras citocinas (IL2, IL-4, e IL-7), como o TNF-, atuam sinergicamente mediando a ativao dos macrfagos para combater a infeco (Awasthi A, et al. 2004). Freqentemente, pacientes com LM referem leses cutneas compatveis com LC e apresentam "cicatrizes cutneas sugestivas". Parte dos pacientes com LM refere ausncia de tratamento ou tratamento inadequado da leso cutnea inicial, o que leva a se admitir que as curas espontneas e os tratamentos curtos e irregulares possam constituir risco para o desenvolvimento de LM (D'Utra e Silva 1915, Pessa & Barretto 1948, Walton et al. 1973, Marsden 1986, Jones et al. 1987). Apesar do uso medicinal de compostos de antimnio j ser conhecido desde a Antiguidade, sculos antes da era crist, para diversos fins teraputicos, somente em 1912, Gaspar de Oliveira Vianna observou que o trtaro emtico era eficaz na teraputica da LTA. Trs anos mais tarde, na Itlia, tambm foi comprovada a eficcia desta droga no tratamento da leishmaniose visceral. Devido aos efeitos txicos associados ao emprego do trtaro emtico, como intolerncia gastrintestinal e efeitos cardiotxicos, os antimoniais trivalentes foram sendo substitudos por compostos estibiados pentavalentes. Os antimoniais pentavalentes vm sendo empregados h mais de 60 anos e continuam sendo as drogas de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses (Goodwin 1995, Herwaldt 1999). As bases bioqumicas

10

para sua efetividade so ainda pouco definidas, mas acredita-se que a inibio da sntese de ATP pode estar envolvida (Blum JA et al. 2009). Alm dos antimoniais, outras drogas tem sido empregadas no tratamento das diversas formas de leishmaniose, entre as quais se destacam a pentamidina, anfotericina B, o miltefosine, a paromomicina e o alopurinol. Tem-se relatado tambm o uso de anfotericina B liposomal (Janvier F. et al. 2008). A teraputica com os antimoniais pentavalentes pode variar no que se refere ao esquema teraputico empregado, sua durao, dose total e dose diria necessrias para obteno da cura clnica, assim como a ocorrncia de recidivas ou resistncia. Mesmo sendo uma droga eficaz no tratamento da maioria dos casos, a m resposta teraputica tem sido descrita e parece estar aumentando em intensidade e prevalncia (Grogl et al. 1992) . A ausncia de resposta ao estibogluconato de sdio e ao antimoniato de meglumina demonstrada nas leishmanioses visceral e mucocutnea, tem sido reconhecida como um srio problema. . A Organizao Mundial de Sade preconiza que as doses de antimoniais no devem ultrapassar 20 mg/kg/dia, no se ultrapassando o limite de 850 mg de antimnio, devido sua elevada toxidez. O antimnio pode ainda ser detectado no cabelo de pacientes tratados com antimoniais pentavalentes at um ano aps o termino do tratamento (Dorea JG, et al; 1987). Mialgias, dores abdominais, alteraes hepticas e distrbios cardiolgicos so efeitos colaterais frequentemente associado ao uso destas drogas (Rath, S. 2003).

Figura 2 - Estrutura qumica do antimoniato de meglumina (Glucantime).

Os antimoniais pentavalentes parecem atuar no mecanismo bioenergtico das formas amastigotas da leishmania, atravs de gliclise e beta-oxidao que ocorrem nas organelas denominadas glicossomas. Outro mecanismo aventado o de ligao com stios sulfidrlicos, deflagrando a morte destes protozorios (Berman et al., 1985).

11

Alguns autores acreditam que a resposta favorvel ao tratamento com antimoniais pentavalentes dependeria do pico srico alcanado ou da manuteno de uma concentrao srica inibitria durante a maior parte do tempo (Chulay et al. 1988) . O achado que o antimnio pentavalente rapidamente excretado na urina, resultando em nveis sricos subteraputicos em poucas horas, levou interpretao que o risco de toxidez cumulativa era baixo e que os esquemas teraputicos intermitentes seriam farmacologicamente infundados (Rees et al. 1980, Oster et al. 1985, Berman 1988) . Outros autores (Chulay et al. 1988, Mortari 2001, Miekeley et al. 2002) achados. Diversos esquemas de tratamento antimonial tm sido utilizados para a LC. As principais diferenas entre estes regimes teraputicos disponveis relacionam-se ao uso do antimoniato de meglumina ou do estibogluconato de sdio; administrao contnua ou intermitente, a dose diria total, durao do tratamento, aos critrios usados para a interrupo ou prolongamento do tratamento, e s espcies e linhagens de Leishmania envolvidas (Schubach et al, 2005). Respostas clinicas insatisfatrias ou ausncia de resposta ao tratamento antimonial tm sido atribudas ao emprego de baixas doses ou ao curto tempo de administrao antimonial (Berman, 1988). Algumas formas de leishmaniose precisam de altas doses de antimonial ou tratamento de longa durao, porque apresentam resistncia terapia ou resposta insuficiente, como na leishmaniose mucosa causada por L. braziliensis (Grimaldi et al, 1989; Berman, 1988). Isso pode ser devido a diversos fatores, entre eles a resposta imune inadequada, tanto geneticamente, quanto por condies clnicas (doena associada ou terapia imunossupresiva), problemas farmacocinticos, esquemas errneos de terapia, fatores do parasito e heterogeneidade de grupos antimoniais (Grogl et al., 1989). No Brasil, o Ministrio da Sade (MS) recomenda tratar os pacientes com LC com antimoniato de meglumina na dose de 10-20 mg Sb5+/kg/dia durante 20 dias. Os pacientes com LM devem utilizar 20mg Sb5+/kg/dia durante 30 dias. Em ambos os casos, deve-se respeitar o limite mximo de trs ampolas dirias. (Brasil et al. 2000). No entanto, outros regimes de tratamento vm sendo empregados por diversos autores. O tratamento com uma ampola de antimoniato de meglumina, independentemente do peso corporal, por injees intramusculares, durante 10 dias, sendo repetidas trs vezes com intervalos de 10 dias, demonstrou alto percentual de cura sem desenvolvimento de leses na mucosa (OliveiraNeto e Matos, 2006). O uso de uma ampola do antimoniato de meglumina independente do peso corporal, por pelo menos 25 dias tambm foi testado. Como cada ampola contem 425 confirmaram aqueles

12

mg de Sb5+ em uma soluo de 5 mL, com este regime a dose individual de antimnio tem uma variao considervel (Oliveira-Neto et al, 1996).

Quadro 2 - Esquema teraputico preconizado para as diversas formas clnicas de LTA (OMS).

O tratamento antimonial utilizando baixas doses demonstrou grande eficincia no municpio do Rio de Janeiro, sendo menos txico aos pacientes e, na maioria das vezes, to efetivo contra a infeco quanto o tratamento com altas doses (Lopes et al., 1984). AzeredoCoutinho e colaboradores, em 2007, comprovaram que a espcie L. braziliensis, a principal causadora de infeco no municpio, altamente sensvel ao Glucantime. Foi provado que em diferentes regies o esquema adequado e as doses necessrias para se obter cura podem variar, devido sensibilidade da espcie de Leishmania ao antimonial. (Berman et al, 1988). Recentemente o perfil fenotpico de clulas do sangue perifrico de pacientes com LTA de uma rea endmica em Minas Gerais, foi avaliado antes e depois de trs diferentes regimes teraputicos. Grupos de pacientes foram tratados com Glucantime ou com Leishvacin. O grupo A recebeu 17mg/kg/dia de Glucantime, em um esquema de tratamento em sries de 10 dias; o grupo B recebeu de 100 a 500 l por dia de Leishvacin em sries de 10 dias e o grupo C recebeu ambos os tratamentos simultaneamente. Anlises comparativas destas clulas revelaram que os regimes teraputicos no induziram diferenas significantes na porcentagem de linfcitos CD3/CD4, linfcitos B CD19 ou clulas NK. As razes entre CD4/CD8 e CD3/CD19 tambm permaneceram inalteradas. O perfil fenotpico celular ex vivo observado neste estudo revelou que os diferentes tratamentos empregados no alteraram significantemente a resposta imune exibida pelos pacientes, tanto antes da terapia quanto aps a cura (Botelho ACC et al. 2009).

13

Um estudo feito no municpio do Rio de Janeiro comparou a eficincia do tratamento antimonial intermitente, frente ao esquema continuo (Azeredo-Coutinho, 2002). O esquema de tratamento intermitente foi significativamente mais eficaz para cura do que o contnuo, apresentando tambm menor ndice de abandono do tratamento. Da mesma forma, quando diferentes esquemas de tratamento intralesional para leishmaniose cutnea do Velho Mundo foram comparados, o esquema intermitente foi significativamente mais efetivo do que o tratamento contnuo (Tallab, T.M. et al., 1996). As leishmanioses atingem milhes de pessoas no mundo, causando vitimas fatais, e ainda no tm uma medida de controle eficaz. necessrio se estabelecer esquemas teraputicos menos dolorosos e menos txicos, que propiciem uma melhor adeso ao tratamento.

3. JUSTIFICATIVA
A evoluo clnica das leishmanioses dependente da resposta imune mediada por clulas (Bryceson AD et al, 1970; Castes M et al, 1983). Os estudos imunolgicos sobre a LTA tm focalizado dois objetivos principais: a caracterizao da resposta imunolgica associada s diferentes formas do espectro clnico-patolgico (Castes M et al, 1983; Bacellar O et al, 2002) e a elucidao dos mecanismos imunolgicos envolvidos na cura e na patognese desta doena (Coutinho SG et al, 2002; Castes et al, 1988). A evoluo da resposta imune anti-Leishmania durante e aps o tratamento tem sido descrita tanto na quimioterapia convencional com antimoniais pentavalentes (Coutinho SG et al, 2002; Mendona SC et al, 1986; Castes et al, 1989) quanto em terapias alternativas, como imunoterapia (Castes M et al, 1989; Sharples CE et al, 1994; Cabrera et al, 2000; Botelho ACC et al, 2009). Alguns parmetros imunolgicos tm sido identificados como marcadores de uma evoluo favorvel, tais como aumento da produo de IFN- (Cabrera et al, 2000; Coutinho SG et al, 1998) e da proporo do fentipo CD8+ entre as clulas reativas a antgenos de Leishmania ( Da Cruz, et al. 1994) e diminuio da produo dos nveis sricos de TNF- (Da-Cruz AM et al, 1996; D'Oliveira A Jr, et al, 2002) e de anticorpos especficos (Souza, WJS et al. 1982). Neste sentido, importante que este ensaio clnico, que pretende comparar a eficcia e a segurana de diferentes esquemas de tratamento, se faa acompanhar por um estudo que vise demonstrar a presena ou ausncia de diferenas na

14

evoluo da resposta imune especfica para o parasito nos grupos submetidos aos diferentes esquemas teraputicos. Para observao da existncia de variaes na resposta imune dos pacientes vamos utilizar a tcnica de citometria multiparamtrica, visando elucidar os mecanismos relativos resposta ao tratamento antimonial. A citometria multiparamtrica pode ser usada para mensurar a funo ou morte celular (pelo perfil de produo de citocinas e citotoxidez) clula a clula. Esse tipo de analise prove mais dados com menor quantidade de amostras, o que muito eficiente quando o material dos pacientes limitado (Chattopadhyay PK et al. 2008). A anlise multiparamtrica tambm permite uma identificao mais acurada das populaes. O aprofundamento destes estudos seria de grande importncia para avaliao de eventuais variaes na resposta imunolgica ao antimoniato de meglumina, assim como no monitoramento da variabilidade gentica e da possvel existncia de clones resistentes na populao de L. (V.) braziliensis circulantes nas reas endmicas do Estado do Rio de Janeiro.

4. OBJETIVOS 4.1 Geral Caracterizar as respostas imunes associadas a diferentes esquemas utilizando antimoniato
de meglumina para o tratamento de pacientes com leishmaniose cutnea.

4.2 Especficos
Comparar os nveis sricos de anticorpos anti-Leishmania por imunofluorescncia indireta e ELISA e de TNF- antes e depois da administrao de cada esquema teraputico. Comparar as respostas proliferativas de clulas mononucleares de sangue perifrico dos pacientes (CMSP) em culturas estimuladas com antgenos de Leishmania antes e depois da administrao de cada esquema teraputico. Comparar os nveis de citocinas relevantes (IFN-, IL-10, IL-5, IL-13, TNF-) em sobrenadantes das culturas de CMSP estimuladas com antgenos de Leishmania antes e depois da administrao de cada esquema teraputico.

15

 Comparar as freqncias de clulas produtoras de citocinas relevantes (IFN- e IL-4) por ELISPOT. Comparar as propores entre os fentipos de clulas T reativas a antgenos de Leishmania por citometria de fluxo multiparamtrica antes, durante e depois da administrao de cada esquema teraputico. Procurar identificar particularidades nas caractersticas das respostas imunes associadas a cada um dos esquemas teraputicos. Verificar a existncia de associaes ou correlaes entre as caractersticas das respostas imunes observadas em cada um dos grupos e o grau de eficcia de cada um dos tipos de tratamento.

5. METODOLOGIA
5.1 Grupos de estudo Cada paciente com LC ser includo em um dos seguintes grupos de tratamento com antimoniato de meglumina (Glucantime, Aventis, So Paulo) por via IM: 1- 20mg Sb5+/kg/dia por 20 dias contnuos. 2- 20mg Sb5+/kg/dia intermitente em 2 sries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo. 3- 5mg Sb5+/kg/dia por 30 dias contnuos. 4- 5mg Sb5+/kg/dia intermitente em 3 sries de 10 dias intercaladas com 10 dias de intervalo. Neste subprojeto sero estudados 10 pacientes de cada grupo, selecionados aleatoriamente. Coletas de 30 mL de sangue perifrico para a obteno de amostras de 25 mL de sangue heparinizado e 5mL de soro para os ensaios imunolgicos sero realizadas antes do tratamento e nas consultas dos dias 140 (3 meses aps o trmino do tratamento mais longo) e 410 (um ano aps o trmino do tratamento mais longo) do cronograma do estudo (anexo). Adicionalmente, amostras de 20 mL de sangue perifrico sero coletadas no dia 20 durante o esquema de tratamento.

16

5.2 Critrios de elegibilidade do projeto geral

Os critrios de elegibilidade, interrupo do tratamento e retirada do estudo so comuns a todos os sub-projetos e esto sob responsabilidade dos clnicos do Laboratrio de Vigilncia em Leishmaniose.
Critrios de incluso

1. Leishmaniose cutnea com diagnstico parasitolgico por um ou mais dos seguintes

mtodos: exame direto (raspado ou imprint), histopatolgico, cultura, imunohistoqumica ou PCR. 2. Histria de exposio em rea endmica do estado do Rio de Janeiro. 3. Ausncia de tratamento anterior com antimoniato de meglumina. Critrios de excluso 1. Mulheres que no fazem uso de mtodos contraceptivos ou o fazem de forma inadequada. 2. Gestantes. 3. Menores de 13 anos. 4. Uso de terapia imunossupressora (corticoterapia, quimioterapia para cncer) ou uso de medicaes para tuberculose ou hansenase.

5. Presena de alteraes basais clnicas equivalentes a efeito adverso nvel >Grau 3. 6. Presena de alteraes basais laboratoriais equivalentes a efeito adverso nvel
>Grau 2.

7. Presena de alteraes basais eletrocardiogrficas equivalentes a efeito adverso

nvel >Grau 4 e/ou QTc basal >0,46ms (equivalente a E A nvel Grau 1).

5.3 Critrio para interrupo definitiva do tratamento do estudo 1. Interrupo motivada por EA clnico, laboratorial ou eletrocardiogrfico Grau 4.

2. Interrupo superior a 10 dias motivada por efeito adverso clnico, laboratorial ou

eletrocardiogrfico Grau >3. 3. Interrupo espontnea do uso da medicao prescrita em quantidade superior a cinco doses consecutivas, por falha de administrao (no adeso).

17

5.4 Critrios para retirada do estudo (mas no da anlise de dados) 1. Interrupo definitiva do esquema de tratamento para o qual foi aleatorizado, por qualquer causa. 2. Necessidade de introduo de droga imunossupressora ou potencialmente txica (quimioterapia para cncer, esquema para tuberculose ou hansenase). 3. Doena intercorrente, sem relao com a droga estudada, mas com manifestaes equivalentes ou superiores a EA clnico Grau 3. 4. Necessidade de re-tratamento por m resposta teraputica inicial ou tardia. 5. Desistncia do paciente em prosseguir o estudo. 5.5 Testes sorolgicos Os testes sorolgicos para deteco de anticorpos anti-Leishmania por imunofluorescncia indireta e ELISA e de TNF- sero realizados pelo VigiLeish seguindo protocolo prprio da rotina. 5.5.1 Deteco de anticorpos anti-Leishmania por imunofluorescncia indireta Os soros sero diludos em PBS progressivamente nas propores entre 1:40 at 1:640 e formas promastigotas sero utilizadas como antgeno. Aps a aplicao do antgeno, as lminas secaro por 12 horas temperatura ambiente. Adicionar-se- 10l das diluies nos orifcios das lminas, incubando-as em cmara mida por 30 minutos a 37oC. Aps esse perodo, as lminas sero lavadas por 3 minutos em PBS e depois, por 3 minutos em gua destilada e secas em seguida. A diluio do conjugado anti-IgG humano (Sigma) utilizada ser de 1:100, em PBS contendo o reagente azul de Evans na proporo de 1:25. A seguir sero adicionados 15l da soluo do conjugado em cada orifcio das lminas, sendo as etapas de incubao, lavagem e secagem repetidas como anteriormente. As lminas sero montadas com glicerina tamponada entre a lamnula. No microscpio de fluorescncia sero avaliados os soros, considerando-os como positivos quando apresentarem uma fluorescncia a partir da diluio 1:40 e como negativos quando no apresentarem fluorescncia. 5.5.2 Deteco de anticorpos por ELISA As placas (marca NUNC, maxSorp) sero sensibilizadas com 100 L de extrato antignico total parcialmente solvel de formas promastigotas de L. braziliensis em concentraes previamente definidas por titulao em concentraes variveis de protena (g/mL) diludos em tampo carbonato-bicarbonato pH 9,6 e posteriormente incubadas

18

overnight (18 horas) a 8C. Aps 4 lavagens com PBS pH 7,2 com 0,05% de Tween 20 (PBS-T), em lavadora automtica (Tecan Columbus Washer), ser adicionado em cada poo 100L das amostras de soro diludas a 1:40 em PBS-Tween, 1% de leite desnatado (Molico; PBS-TL), incubando-se por 1 hora a 37C. Seguindo-se a 4 novas lavagens, sero adicionados 100l de anti-IgG (Sigma) conjugada a peroxidase, diludos em PBS-TL e previamente titulados. Aps 1 hora de incubao a 37C e quatro novas lavagens sero adicionados 50l de soluo de 3,3, 5,5 de tetrametilbenzidina (substrato lquido para ELISA; Sigma). As placas sero incubadas por 30 minutos na ausncia de luz, interrompendo-se a reao por adio a cada poo de 50l de 2M H2SO4. Os valores de Absorbncia sero lidos a 450 nm em leitor automtico de placas (Tecan - Spectran Classic). A linha de corte ("cut off") ser estabelecida como a mdia das leituras de absorbncia dos controles negativos mais duas vezes o desvio padro das mesmas. 5.6 Dosagem de TNF- no soro Os nveis de TNF- sero determinados nos soros por ELISA, como descrito em publicao anterior (Da-Cruz et al. 1996) e segundo as especificaes do kit FactorTestTMh TNF- ELISA Test Kit (Genzyme). Resumidamente, neste ensaio ser utilizado como padro um recombinante de TNF- humano preparado em diluies seriadas fator 2 variando de 800 a 12 pg/mL. Uma microplaca de 96 poos ser revestida com o anticorpo monoclonal purificado especfico para o TNF- humano e incubada durante a noite. As amostras de soro e do padro recombinante sero adicionadas em duplicata. A seguir, um segundo anticorpo policlonal anti-TNF- humano produzido em coelho ser adicionado aos poos e sequencialmente aps este ser colocado um terceiro anticorpo, anti-IgG de coelho marcado com biotina, produzido em cabra. O conjugado estreptoavidina-peroxidase ser distribudo em cada poo e em seguida adicionado uma soluo substrato para revelar a reao. A absorbncia ser medida utilizando filtro de 492nm. Os resultados sero expressos em pg/mL. 5.7 Obteno de CMSP CMSP dos pacientes sero obtidas por centrifugao em gradiente de ficoll-hypaque segundo metodologia previamente publicada (Mendona et al. 1986) a partir de 25-30mL de sangue perifrico retirados de cada indivduo por venopuno, utilizando-se tubos de 12mL com vcuo, heparinizados (Liquemine 500 UI, Roche). O sangue heparinizado ser diludo com 20mL de meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10mM Hepes, 1,5mM/1 L-glutamina, antibiticos (penicilina 200UI/mL e

19

estreptomicina 200g/mL) e 0,04mM 2-mercaptoetanol (meio RMPI completo) e as clulas mononucleares isoladas por centrifugao em gradiente de Ficoll-Hypaque (Histopaque1077, Sigma), 850g/20 minutos a 20 C. O anel ser retirado com o auxlio de pipeta Pasteur e as clulas obtidas lavadas 3 vezes, por centrifugao em RPMI completo 350g/10 minutos, a 20 C. Aps a contagem na cmara de Neubauer, a viabilidade das clulas ser verificada usando-se o corante Azul de Trypan (Sigma), e a concentrao das clulas viveis posteriormente ajustada para 3x106/mL, em meio RPMI completo contendo 20% de soro AB Rh+ inativado, de doador sadio humano. 5.8 Resposta proliferativa de linfcitos Ser realizada de acordo com tcnica previamente descrita (Mendona et al. 1986) . Cem microlitros da suspenso de CMSP sero distribudos nos poos de placas de microtitulao de fundo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca). As culturas de CMSP sero feitas em triplicatas de poos estimulados com 50g/mL de antgenos totais de Leishmania e 20g/mL de mitgeno (concanavalina A), separadamente. Como controle em cada experimento com cada doador, trs poos no recebero estmulo (background). Em todos os poos, um volume final de 200l ser atingido, atravs da adio de meio RPMI completo. As clulas sero mantidas em cultura, por 5 dias, em incubadora a 37 C, em ar umidificado contendo 5% de CO2. Dezesseis horas antes da coleta, ser adicionado, em cada poo, 1Ci de 3H timidina (Armersham International, Buckinghamshire, Gr-Betanha, atividade especfica de 5 Ci/mmol). As clulas sero finalmente coletadas em papel de filtro (Titertek, Flow Laboratories, Huntsville, EUA), utilizando-se um multi-coletor "cell harvester" (Titertek, Flow Laboratories). A intensidade da incorporao da timidina triciada ser medida em um contador de radiao beta (Packard, 1600CA, Boston, EUA) e os resultados expressos em ndices de estimulao (IE), calculados pela mdia de contagem dos poos contendo cada estmulo dividida pela mdia das contagens dos poos controle. Sero consideradas positivas as culturas de clulas que estimularam um ndice de proliferao >2,5 em relao ao background (Mendona et al. 1986) . 5.9 Dosagem de citocinas em sobrenadantes das culturas de CMSP A dosagem de TNF- em sobrenadantes de culturas de CMSP estimuladas com antgenos de Leishmania seguir protocolos j publicados (Matos et al. 2005) . E a

20

dosagem das citocinas IFN-, IL-10, IL-5 e IL-13 ser feita por meio de kits ELISA ReadySET-Go da eBioscience, seguindo protocolo prprio. Os sobrenadantes de cultura de CMSP obtidas dos indivduos estudados e independentemente estimuladas com o extrato total de Leishmania braziliensis (Lb) e de concanavalina A (ConA) sero coletados s 24h (TNF-), 72h (IL-10 e IL-5) e 120h (IFN-) aps o incio das culturas, e sero estocados em condies estreis a -70C at o momento da anlise. A quantificao das respectivas citocinas ser realizada em placas de 96 poos de fundo plano (Maxisorp, Nunc), atravs de ensaio imunoenzimtico (ELISA), utilizando-se anticorpos monoclonais purificados e biotinilados especficos para cada citocina (Pharmingen). A enzima utilizada ser a peroxidase, acoplada a estreptoavidina, e a revelao da reao ser feita pela adio, em cada poo, de 100l de uma soluo contendo 0,1M de cido ctrico anidro pH 4,35 (Sigma), 1mg/mL do cromgeno 2,2-azinobis-(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma) e 10l do substrato perxido de hidrognio a 30% (Sigma). Aps 30-80 minutos temperatura ambiente a leitura das absorbncias ser efetuada em intervalos regulares de 15 minutos, em um leitor de ELISA (Emax, Molecular Devices, EUA) utilizando-se um filtro de 405nm. As concentraes das citocinas presentes nas amostras testadas sero determinadas pela comparao com curva padro, obtidas com as citocinas recombinantes (Pharmingen) em diluies seriadas fator 2, variando de 0 a 2000pg/mL. Os resultados obtidos com a estimulao pelos antgenos testados sero ento descontados dos resultados das culturas no estimuladas. Quando a dosagem de citocinas nas culturas no estimuladas for superior das culturas estimuladas, o resultado ser considerado como zero. 5.10 Caracterizao do fentipo de clulas reativas a Leishmania - Marcao multifuncional para citometria Um total de 3x105 clulas obtidas de cada paciente sero estimuladas por 16 horas na presena das fraes antignicas de Lb (10g/ml), ConA (60g/ml) e 2g/ml de anticorpo anti CD28. Durante as 14 horas finais de incubao sero adicionados a cada poo 10g/ml de Brefeldina A. Culturas estimuladas exclusivamente com o anticorpo anti CD28 sero utilizadas como controle negativo e, como controle positivo, as clulas sero estimuladas com PMA (20g/ml) e Ionomicina (1M). Aps este perodo de incubao as clulas sero lavadas em PBS e colocadas em uma soluo de bloqueio (PBS/BSA, contendo 5% de leite desnatado) durante 5 minutos a 20oC. Posteriormente adicionam-se as combinaes de anticorpos para marcao de

21

superfcie (CD3, CD4, CD8, CD16, NKT, CD25 e FoxP3). minutos sequem-se 2 lavagens com PBS/BSA.

Aps uma incubao de 20

As clulas sero ento fixadas em

paraformaldedo 4% por 10 min 20oC, lavadas com PBS/BSA e incubadas durante 1h, a 4oC, em 100l de tampo de permeabilizao. Subsequentemente a permeabilizao adiciona-se a cada tubo a mistura de anticorpos para marcao intracelular de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-, TNF- e TGF-). Aps um perodo de incubao de 30 min a 4oC as clulas sero lavadas 1 vez em PBS/BSA contendo 0,1%Saponina, uma segunda vez com PBS/BSA, para que a Saponina seja removida, ressuspensas em 500l de PBS/BSA e posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Um nmero de aproximadamente 50.000 eventos ser adquirido dentro do gate de linfcitos vivos em um citmetro de fluxo Cyan (Dako).

5.11 Quantificao das clulas produtoras de IFN- e IL-4 por Elispot Numa placa de ELISPOT (ELIIP10SSP Millipore, EUA) sero colocados 50L da soluo de anticorpo de captura purificado a 10 g/mL em PBS estril por poo. Estas preparaes sero incubadas por 18 h a 4 C, em seguida as placas sero lavadas trs vezes com PBS estril utilizando 100 L/poo. As placas sero bloqueadas com meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10mM Hepes, 1,5mM/L L-glutamina, antibiticos (penicilina 200UI/mL e estreptomicina 200g/mL) e 0,04mM 2-mercaptoetanol (meio RMPI completo) adicionado de 10% SFB 100L/poo e incubadas a 37 C e 5% CO2 at o momento da realizao do ensaio. Sero ento adicionadas 100 L/poo de suspenso celular contendo 2 x 106 clulas/mL em meio RPMI completo com 20% de soro AB e depois 100 mL/poo de meio completo sem soro com o antgeno (Lb 10 g/mL) ou mitgeno (ConA 20 g/mL) ou sem estes estmulos (background). As placas sero incubadas por 40 h a 37 C e 5% CO2 e aps este tempo, o contedo das placas ser descartado e os poos sero lavados quatro vezes com PBS/Tween 20 0,05% (Sigma). Ser adicionado em cada poo 100L do anticorpo de deteco na concentrao 1g/mL em PBS/BSA 0,1% (Sigma). As placas sero incubadas por 4 h a 37 C e 5% CO2 e lavadas por trs vezes com 200L/ poo de PBS/Tween. Cem microlitros de conjugado fosfatase alcalina/estreptavidina diluda 1:4000 em PBS/BSA sero adicionados e as placas incubadas por 4 h a 37 C. Aps o descarte do contedo dos poos sero adicionados 100L da soluo substrato preparada em tampo Tris com NBT e BCIP (Sigma). Aps revelada a reao, o que geralmente ocorre entre 5 e 10 minutos, todos os poos da placa sero lavados e secos. A leitura dos pontos

22

corados (spots) ser feita utilizando o aparelho ImmunoSpot Analyser (Cellular Technology Ltda - C.T.L). 5.12 Anlise estatstica Ser realizada atravs de testes no paramtricos, utilizando-se o programa Graphpad Prism 5. Os resultados sero considerados significantes quando p<0,05.

6. RESULTADOS ESPERADOS
Um possvel resultado deste estudo seria a demonstrao de que a evoluo clnica favorvel obtida com um protocolo alternativo de tratamento antimonial estaria associada a um perfil imunolgico semelhante ao observado com o esquema convencional. Concluso semelhante foi obtida em estudos que compararam imunoterapia com quimioterapia antimonial (Convit, et al. 1987; Botelho, et al. 2009). Por outro lado, caso diferenas de eficcia sejam detectadas entre os esquemas utilizados, ser interessante tentar identificar as caractersticas da resposta imune associada ao esquema mais eficaz.

7. RESULTADOS

7.1- Dosagem de citocinas em sobrenadantes de culturas de CMSP pelo mtodo de ELISA

Para realizao dos ensaios imunoenzimticos foram estudados pacientes includos no ensaio clnico. Onze destes pacientes foram estudados antes do tratamento (AT), oito pacientes no 20 dia de tratamento (DT), e 15 pacientes no dia 140 de acompanhamento aps o tratamento (PT). Foram estudados ainda quatro indivduos sadios, sem exposio Leishmania e considerados como parte de um grupo controle. Os dados clnicos dos participantes so apresentados na tabela 1. Para anlise do perfil de produo de citocinas pela tcnica de ELISA foram coletados sobrenadantes das culturas de CMSP, estimuladas com o mitgeno concanavalina A (ConA) ou com extrato total de promastigotas mortas de Leishmania braziliensis (Lb), em 72 horas de incubao a 37C em atmosfera de CO2 (TNF-, IL-10 e IL-5) e em 120 horas (IFN- e IL-13). A dosagem foi realizada utilizando-se kits Ready Set-Go Human (e-Bioscience) e as leituras feitas pelo equipamento Emax (Molecular Devices), que gera os resultados no

23

programa SoftMax Pro. Os grficos comparam a mdia produo destas citocinas (em pg/ml) em cada grupo de pacientes antes, durante e aps o tratamento antimonial. Grupos AT DT PT Controle N. indivduos 21 11 19 3 Sexo M= 12 /F= 5 M= 10 /F= 1 M= 13 /F= 6 M= 0 /F= 3 Idade 3616,9 38,314,3 39,415,2 261 N. de leses 1,20,6 1,91,8 1,30,6 --Montenegro 15,67,6 18,96,3 16,96,5 ---

Tabela 1- Dados clnicos dos pacientes estudados utilizando-se a tcnica de ELISA. Dados apresentados como mdias desvios padro

IFN-gama Quando as clulas foram estimuladas por ConA a produo foi maior no grupo controle sadio em relao ao grupo AT e tambm DT (p< 0,05). O grupo ps-tratamento (PT) tambm mostrou diferena significativa na produo de IFN-gama em relao ao grupo AT (p< 0,05) (Figura 1). Quando as clulas foram estimuladas com Lb, houve uma maior produo de IFN- nos grupos AT e PT em relao ao grupo controle (p< 0,05) (Figura 2).

p< 0,05 p< 0,05

25000 20000

p< 0,05

IFN- (pg/mL)

15000 10000 5000 0 ConA AT ConA DT ConA PT ConA Cont.

AT DT PT Cont.

Figura 1- Produo de INF- nos grupos AT, DT, PT e Controle (Cont), em CMSP estimuladas por ConA. Os resultados foram descontados do controle no estimulado (background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

24

p< 0,05
5000

p< 0,05
4000

IFN- (pg/mL)

3000 2000 1000 0 Lb AT Lb DT Lb PT Lb Cont.

AT DT PT Cont.

Figura 2- Produo de INF- nos grupos AT, DT, PT e Controle (Cont), em CMSP estimuladas por antgeno de Lb Os resultados foram descontados do controle no estimulado (background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

IL-10 Nos grupos estimulados por ConA no houve diferena significativa entre os nveis de citocina encontrados (Figura 4). Entretanto, quando estimulamos as clulas com antgeno de Lb o grupo de pacientes PT apresentou diferena significativa (p< 0,05) na produo da citocina em comparao ao grupo DT (Figura 5). No so apresentados os resultados do grupo controle nos grficos de IL-10 porque no foi possvel realizar a tcnica at o momento da redao do relatrio.

25

200

150

AT DT PT

IL-10 (pg/mL)

100

50

0 ConA AT ConA DT ConA PT

Figura 4- Produo de IL-10 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por ConA (Os resultados foram descontados do background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

300

p< 0,05

AT DT PT

IL-10 (pg/mL)

200

100

0 Lb AT Lb DT Lb PT

Figura 5- Produo de IL-10 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por antgeno de Lb (Os resultados foram descontados do background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

26

 IL-5 No encontramos diferenas estatsticas entre os grupos de pacientes estimulados tanto por ConA quanto por Lb, apenas observamos que a dosagem de IL-5 no grupo AT foi maior do que nos outros grupos (Figuras 6 e 7).

200

150

AT DT PT

IL-5 (pg/mL)

100

50

0 ConA AT ConA DT ConA PT

Figura 6- Produo de IL-5 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por ConA (Os resultados foram descontados do background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

80

60

AT DT PT

IL-5 (pg/mL)

40

20

0 Lb AT Lb DT Lb PT

Figura 7- Produo de IL-5 nos grupos AT, DT e PT, em CMSP estimuladas por antgeno de Lb (Os resultados foram descontados do background). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

27

7.2- Caracterizao do fentipo de clulas reativas a Leishmania pela tcnica de citometria de fluxo

Ensaios foram realizados com CMSP de 4 pacientes antes do tratamento (AT), 7 pacientes no dia 140 de acompanhamento aps o tratamento e ainda 5 doadores sadios usados para controle dos experimentos. Os dados clnicos destes pacientes so apresentados na tabela 2. A avaliao do fentipo das clulas mononucleares reativas ao antgeno de leishmania e o perfil de produo de citocinas (IFN-, TNF-, IL-2 e IL-10) por cada fentipo foi estudado por meio de citometria. As CMSP foram estimuladas com 10g/mL de antgeno de Lb, 60g/mL de ConA (controle positivo), ou apenas as clulas (Background) na presena de 2g/mL de anti CD28, ento foram incubadas por 16 horas na presena de 10g/mL de brefeldina A (Sigma). As clulas receberam marcao intracelular e de superfcie com anticorpos monoclonais anti CD4 APC-Cy7, anti CD8 PE-TexasRed; anti CD25 PE-Cy5, anti IFN- PECy7, anti TNF- FITC, anti IL-2 APC e anti IL-10 PE (eBioscience). Para avaliao destas marcaes, 30.000 eventos foram adquiridos dentro do gate de linfcitos vivos para cada amostra, no citmetro Cyan (Dako) e analisadas no programa FlowJo. Os resultados de produo de citocinas pelos fentipos so expressos pelo ndice de intensidade mdia de fluorescncia integrada (iMFI), que consiste na multiplicao da mdia de intensidade de fluorescncia de uma determinada citocina pela freqncia das clulas produtoras dessa citocina.

Grupos AT PT Controle

N. indivduos 4 7 5

Sexo M= 3 /F= 1 M= 6 /F= 1 M= 2 /F= 3

Idade 28,711 42,116,9 25,21,9

N. de leses 10 1,40,7 ---

Montenegro 170 12,44,3 ---

Tabela 2- Dados clnicos dos pacientes estudados utilizando-se citometria de fluxo. Dados apresentados como mdias desvios padro.

Porcentagem dos fentipos CD4 e CD8

28

As clulas CD8+, quando foram estimuladas por ConA, no apresentaram diferena entre os grupos estudados (dados no apresentados). J quando o estmulo foi com Lb encontramos diferena significativa no percentual de clulas aps o tratamento (PT), quando comparado com o grupo antes do tratamento (AT) (p < 0,05). O grupo de doadores sadios (controle) no apresentou diferena significativa quando comparado aos outros grupos, tendo percentual semelhante ao grupo PT (Figura 8). O fentipo CD4 apresentou porcentagens semelhantes em todos os grupos estudados (AT, PT e Ctrl), tanto no estmulo por ConA quanto por antgeno de Lb (Figura 9).

40

p< 0,05
30

CD8+ (%)

20

10

0 Lb AT Lb PT Lb Cont.

Figura 8- Porcentagem de linfcitos TCD8+ estimulados por antgeno de Lb, nos grupos AT (azul), PT (vermelho) e Controle (verde). Anlise estatstica feita pelo teste de KruskalWallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

29

60

CD4 + (%)

40

20

0 Lb AT Lb PT Lb Cont.

Figura 9- Porcentagem de linfcitos TCD4+ estimulados por antgeno de Lb, nos grupos AT (azul), PT (vermelho) e Controle (verde). Anlise estatstica feita pelo teste de KruskalWallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn

iMFI de clulas com fentipo CD4 e CD8 produzindo citocinas O estmulo por antgeno de Lb foi eficiente na populao CD4+, estimulando a produo de IFN-. O grupo de pacientes PT apresentou diferena significativa (p < 0,05) na produo desta citocina em comparao com o grupo de doadores sadios (controle). Os pacientes AT apresentam nveis reduzidos de produo de IFN- estimulados por Lb, semelhantes ao grupo controle (Figura 10). As clulas CD8+ no apresentaram o mesmo perfil, no havendo diferena estatstica entre os grupos (dados no apresentados). A produo de TNF-, por clulas CD4+, estimulada por Lb seguiu o mesmo padro visto em INF-, o grupo PT apresentou aumento significativo (p< 0,05) na produo da citocina quando comparado com a grupo controle (Figura 11). J em clulas CD8+ no foram observados resultados significativos (dados no apresentados).

30

CD4-IFN Lb
400

p< 0,05

CD4 IFN- (iMFI)

300 200 100 0

Figura 10- Intensidade Mdia de Fluorescncia Integrada (iMFI) de clulas CD4+ que produziram IFN-, estimuladas por antgeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn. .

CD4-TNF Lb
30

p< 0,05

CD4 TNF (iMFI)

20

10

Figura 11- Intensidade Mdia de Fluorescncia Integrada (iMFI) de clulas CD4+ que produziram TNF-, estimuladas por antgeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

Lb Cont.

Lb AT

Lb PT

Lb Cont.

Lb AT

Lb PT

31

A populao de clulas CD4+, estimuladas por antgeno de Lb, apresentou maior produo de IL-2 no grupo PT quando comparado com ambos os grupos AT e controle (p< 0,05) (Figura 12). O fentipo CD8+ no apresentou diferenas significativas.

CD4-IL-2 Lb
50

p< 0,05

p< 0,05

CD4 IL-2 (iMFI)

40 30 20 10 Lb Cont. Lb AT Lb PT 0

Figura 12- Intensidade Mdia de Fluorescncia Integrada (iMFI) de clulas CD4+ que produziram IL-2, estimuladas por antgeno de Lb no grupos AT (azul), PT (verde) e Controle (amarelo). Anlise estatstica feita pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparao mltipla de Dunn.

Anlise dos fentipos celulares de produo de citocinas por citometria multifuncional A anlise de produo de citocinas por clulas multifuncionais foi feita nos grupos AT, PT e controle sadio. Apresentamos apenas os dados referentes populao de clulas CD4+, as clulas CD8+ no apresentaram diferenas entre os grupos e os tempos de tratamento que fossem relevantes. Observando os grupos antes e ps-tratamento percebemos o aparecimento da populao de clulas multifuncionais (que produzem simultaneamente IFN-, TNF- e IL-2) no estmulo por antgeno de Lb, quando comparamos com o background (clulas no estimuladas). As clulas estimuladas tambm apresentaram maior proporo de clulas que produzem duas citocinas simultaneamente do que o background (Figura 13). O grupo PT apresentou uma proporo maior de multifuncionais em comparao com o grupo AT, assim como de clulas que produzem exclusivamente INF- (Figura 14).

32

33

Figura 13- Porcentagem de produo de citocinas por clulas CD4 + multifuncionais produzindo INF-, TNF- e IL-2 simultaneamente (em amarelo), produo simultnea de duas citocinas (em laranja- TNF- e IL-2; azul- INF- e IL-2 e roxo- INF- e TNF-) ou de uma citocina (em verde- IL-2; vermelho- TNF- e cinza- INF-) nos pacientes antes (AT) e aps (PT) o tratamento e no grupo controle (Cont.). Clulas sem estmulo (Background) ou estimuladas por Lb.

34

Figura 14- Porcentagem de produo de citocinas por clulas CD4 + multifuncionais produzindo INF-, TNF- e IL-2 simultaneamente (em amarelo), produo simultnea de duas citocinas (em laranja- TNF- e IL-2; azul- INF- e IL-2 e roxo- INF- e TNF-) ou de uma citocina (em verde- IL-2; vermelho- TNF- e cinza- INF-) nos pacientes antes (AT) e aps (PT) o tratamento e no grupo controle (Cont.). Clulas estimuladas por Lb descontadas das sem estmulo (Background).

35

7.3 Avaliao clinico-epidemiolgica Foi preparado um arquivo de banco de dados para coletar informaes clnicas e epidemiolgicas dos pacientes, visando posteriormente analisar estatisticamente estes dados, cruzando cada varivel entre si e com os resultados laboratoriais. Modelo de banco de dados dos pacientes do ensaio clnico:

PROJETO avaliao da resposta imune em pacientes tratados com diferentes esquemas de Glucantime

NOME: ________________________________________ PRONT: ###### ENDERECO: ______________________________ CIDADE:______________________________ PROF: _________________________ NUMERO: <idnum> IDADE: __ SEXO:__ M/F/I ESTADO:__

FORMA CLINICA: __________ LC/ LMC/ LCD CARACT SP:______________________________ TEVOL:###.#meses TM:###.#mm CULTURA:_ P/N

NLESOES:###

LOCAL: __________________________________ C/T/MSD/MSE/MID/MIE TTO: <A > sim-nao-ign CURA: <A > sim-nao-ign ESQUEMA: _______________ 1 TTO BDC/ BDI/ ADC/ ADI TCURA: ###.# meses

DESFECHO:_______________ CURA/FALHA/RECIDIVA OBS: ___________________________________ RESULTADOS: ELISA ATIFN_____pgml ATTNF____ DTIFN_____ DTTNF____

ATIL10____ DTIL10____

ATIL5____

ATIL13____

DTIL5____ DTIL13____ PTIL5____ PTIL13____

PTIFN_____ PTTNF____

PTIL10____

36

CITOMETRIA ATCD8___ ATCD4___ DTCD8___ DTCD4___ PTCD8___ PTCD4___ ELISPOT EATIFN____ EDTIFN____ EPTIFN____

ATCD25CD4___ CATIFN___ CATTNF___ ATIL12___ CATIL10___ DTCD25CD4___ PTCD25CD4___ CDTIFN___ CDTTNF___ CPTIFN___ CPTTNF___ DTIL12___ PTIL12___ CDTIL10___ CPTIL10___

ATIL4____ DTIL4____ PTIL4___

37

8. CRONOGRAMA

ATIVIDADES

ANO 1 (2008) 1 semestre 2 semestre

ANO 2 (2009) 3 semestre 4 semestre

ANO 3 (2010) 5 semestre 6 semestre

ANO 4 (2011) 7 semestre 8 semestre

Reviso e acompanhamento da literatura especfica Realizao das disciplinas Recrutamento dos voluntrios Alocao dos participantes nos grupos Seleo aleatria dos participantes do subprojeto imunolgico Coleta de material Ensaios imunolgicos Anlise de resultados Apresentao de resultados em eventos cientficos Preparao de artigos para publicao Redao da Tese Defesa da tese

38

9. EQUIPE
- Armando de Oliveira Schubach - Mdico infectologista e dermatologista, Doutor, Coordenador interino do Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses do IPEC-Fiocruz. Coordenador do Projeto Geral Ensaio clnico fase III para Leishmaniose Tegumentar Americana. Equivalncia entre o esquema padro e alternativos com antimoniato de meglumina. Orientador deste projeto de doutorado. - Sergio Coutinho Furtado de Mendona - Mdico Infectologista, Doutor, Pesquisador Titular e Chefe do Laboratrio de Imunoparasitologia do IOC, Fiocruz. Co-orientador deste projeto de doutorado. - Thalita Gagini Braga Biloga, Mestre em Microbiologia Veterinria, Doutoranda, Laboratrio de Imunoparasitologia, IOC, Fiocruz. Responsvel pela execuo deste projeto de doutorado. - Rilza Beatriz Azeredo Coutinho - Mdica Dermatologista, Doutora em medicina Tropical. Participao na orientao da aluna nas tcnicas imunolgicas previstas no projeto. - Paula Mello De Luca, Biloga, Doutora, Assistente de Pesquisa do Laboratrio de Imunoparasitologia, IOC, Fiocruz. Participao na orientao da aluna nas tcnicas imunolgicas previstas no projeto. - Eliame Mouta Confort - Farmacutica, Mestre, Doutoranda - Diagnstico Sorolgico (Estudo da resposta imunolgica humoral) - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - Cludia Maria Valete-Rosalino Mdica otorrinolaringologista, Doutora - Atendimento otorrinolaringolgico - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - rica Camargo Ferreira e Vasconcelos - Mdico Dermatologista, Mestre, DoutorandaAtendimento clnico - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - Marcelo Rosandisk Lyra - Mdico Dermatologista, Mestre, Doutorando- Atendimento clnico - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - Maurcio Naoto Saheki - Mdico Infectologista, Especialista - Atendimento clnico Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz.

39

- Maria Ins Fernandes Pimentel - Mdica Dermatologista, Doutora - Atendimento clnico e dermatolgico - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - Mariza de Matos Salgueiro - Mdica Clnica Geral, Especialista - Atendimento clnico Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz. - Sandro Javier Bedoya Pacheco - Mdico Epidemiologista, Doutor, Bolsista de Treinamento e Capacitao Tcnica (TCT) FAPERJ - Avaliao estatstica e epidemiolgica - Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses, IPEC, Fiocruz - Sonia Regina Lambert Passos - Mdica Epidemiologista, Doutora - Coordenao estatstica e epidemiolgica - Laboratrio de Epidemiologia Clnica, IPEC, Fiocruz

10. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Alexander J, Russell DG. The interaction of Leishmania species with macrophages. Adv Parasitol 31: 175-254, 1992. Antoine JC, Prina E, Jouanne C, Bongrand P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infect Immun 58: 779-787, 1990. Armant M, Rubio M, Delespesse G, Sarfati M. Soluble CD23 directly activates monocytes to contribute to the antigen-independent stimulation of resting T cells. J. Immunol. 155: 4868 4875, 1995. Apostolopoulos V, McKenzie IFC, Lees C, Matthaei KI, Young IG, A role for IL-5 in the induction of cytotoxic T lymphocytes in vivo, Eur. J. Immunol. 30: 17331739, 2000. Azeredo-Coutinho RB, Mendona SC An intermittent schedule is better than continuous regimen of antimonial therapy for cutaneous leishmaniasis in the municipality of Rio de Janeiro, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. Sep-Oct;35(5):477-81, 2002. Azeredo-Coutinho RB, Mendona SC, Callahan H, Portal AC, Max G. Sensitivity of Leishmania braziliensis promastigotes to meglumine antimoniate (glucantime) is higher than that of other Leishmania species and correlates with response to therapy in American tegumentary leishmaniasis. J Parasitol. Jun;93(3):688-93, 2007. Awasthi A, Mathur AR & Saha T. Immune response to Leishmania infection. National Center for Cell Science, Indian J Med Res. 119: 238-258, 2004. Bacellar O, Lessa H, Schriefer A, Machado P, Ribeiro de Jesus A, Dutra WO, Gollob KJ, Carvalho EM. Up-regulation of Th1-type responses in mucosal leishmaniasis patients. Infect Immun. 70(12): 6734-40, 2002.

40

Belli A, Rodriguez B, Aviles H, Harris E. Simplified polymerase chain reaction detection of new world Leishmania in clinical specimens of cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 58: 102-109, 1998. Berman JD. Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical mechanisms, clinical efficacy, and future strategies. Reviews Infectious Diseases 10: 560-586, 1988. Berman JD, Waddell D, Hanson BD. Biochemical mechanisms of the antileishmanial activity of sodium stibogluconate. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 27:916-920, 1985. Blum JA, Hatz HCF. Treatment of Cutaneous Leishmaniasis in Travelers 2009. Journal of Travel Medicine; v.16 2: 123-131, 2009. Botelho ACC, Mayrink W, Oliveira RC. Alterations in phenotypic profiles of peripheral blood cells from patients with human American cutaneous leishmaniasis following treatment with an antimonial drug and a caccine. Acta Tropica (2009). Brasil, Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade. Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, Braslia, 62 pp, 2000. Bryceson AD, Bray RS, Wolstencroft RA, Dumonde DC. Cell mediated immunity in cutaneous leishmaniasis of the guinea-pig. Trans R Soc Trop Med Hyg. 64(4):472, 1970. Cabrera M, Blackwell JM, Castes M, Trujillo D, Convit J, Shaw MA. Immunotherapy with live BCG plus heat killed Leishmania induces a T helper 1-like response in American cutaneous leishmaniasis patients. Parasite Immunol. 22(2): 73-9, 2000. Cabrera M, Rodriguez O, Monsalve I, Tovar R, Hagel I. Variations in the serum levels of soluble CD23, nitric oxide and IgE across the spectrum of American cutaneous leishmaniasis. Acta Tropica 88:145151, 2003. Castes M, Agnelli A, Verde O, Rondon AJ. Characterization of the cellular immune response in American cutaneous leishmaniasis. Clin Immunol Immunopathol. 27(2): 176-86, 1983. Castes M, Cabrera M, Trujillo D, Convit J. T-cell subpopulations, expression of interleukin-2 receptor, and production of interleukin-2 and gamma interferon in human American cutaneous leishmaniasis. J Clin Microbiol. 26(6): 1207-13, 1988. Castes M, Moros Z, Martinez A, Trujillo D, Castellanos PL, Rondon AJ, Convit J. Cellmediated immunity in localized cutaneous leishmaniasis patients before and after treatment with immunotherapy or chemotherapy. Parasite Immunol. 11(3):211-22, 1989. Chakrabarty B. An unusual case of rupture of the uterus. J Indian Med Assoc. 16;38:184-5, 1962. Chattopadhyay PK, Hogerkorp CM, Roederer M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology, 125, 441449, 2008. Chulay JD, Fleckenstein L, Smith DH. Pharmacokinetics of antimony during treatment of visceral leishmaniasis with sodium stibogluconate or meglumine antimoniate. Trans R Soc Trop Med Hyg. 82(1): 69-72, 1988. Convit J, Rondon A, Ulrich M, Bloom B, Castellanos PL , Pinardi ME , Castes M, Garcia L. Immunoterapy versus chemotherapy in localized cutaneous leishmaniasis. The Lancet. 329: (8530) 401-405, 1987.

41

Costa JM, Vale KC, Franca F, Saldanha AC, Silva JO, Lago EL, Marsden PD, Magalhes AV, Silva CM, Serra Neto A. Spontaneous healing of leishmaniasis caused by Leishmania Viannia braziliensis in cutaneous lesions. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 23: 205-208, 1990. Coutinho SG, Da-Cruz AM, Bertho AL, Santiago MA, De-Luca P. Immunologic patterns associated with cure in human American cutaneous leishmaniasis. Braz J Med Biol Res. 31(1):139-42, 1998. Coutinho SG, Pirmez C, Da-Cruz AM. Parasitological and immunological follow-up of American tegumentary leishmaniasis patients. Trans R Soc Trop Med Hyg.; 96 Suppl 1: S173-8, 2002. Da-Cruz AM, Bittar R, Mattos M, Oliveira-Neto MP, Nogueira R, Pinho-Ribeiro V, AzeredoCoutinho RB and Coutinho SG.T-cell-mediated immune responses in patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis: long-term evaluation after therapy. Clin. Diag. Lab. Immun. 9(2):251-56, 2002. Da-Cruz AM, Conceio-Silva F, Bertho AL and coutinho SG. Leishmania-Reactive CD4+ and CD8+ T cells associated with cure of human cutaneous leishmaniasis. Infection and Immunity v. 62 n 6 2614-2618, 1994. Da-Cruz AM, de Oliveira MP, De Luca PM, Mendonca SC, Coutinho SG. Tumor necrosis factor-alpha in human american tegumentary leishmaniasis. Mem Inst Oswaldo Cruz. 91(2):225-9, 1996. De Lima Barros MB, Schubach A, Francesconi-do-Valle AC, Gutierrez-Galhardo MC, Schubach TM, Conceicao-Silva F, de Matos Salgueiro M, Mouta-Confort E, Reis RS, de Fatima Madeira M, Cuzzi T, Quintella LP, da Silva Passos JP, Conceio MJ, de Almeida Marzochi MC. Positive Montenegro skin test among patients with sporotrichosis in Rio De Janeiro. Acta Trop. 93(1):41-7, 2005. De Oliveira-Neto MP, Mattos Mda S. Successful therapeutic response of resistant cases of mucocutaneous leishmaniasis to a very low dose of antimony. Rev Soc Bras Med Trop.;39(4):376-8, 2006. D'Oliveira A Jr, Machado P, Bacellar O, Cheng LH, Almeida RP, Carvalho EM. Evaluation of IFN-gamma and TNF-alpha as immunological markers of clinical outcome in cutaneous leishmaniasis. Rev Soc Bras Med Trop. 35(1):7-10, 2002. Dorea J G, Costa JML, Holzbecher J, Ryan DE and Marsden PD. Antimony Accumulationin Hair duringTreatment of Leishmaniasis. CLIN. CHEM. 33: 11,2081-2062, 1987. D'Utra e Silva O. Sobre a leishmaniose tegumentar e seu tratamento. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 7: 213-248, 1915. Feng Y, Mitchison TJ, Bender A, Young DW, Tallarico JA. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews, Drug Discovery. Volume 8, 2009. Finkefman FD, Wynn TA, Donaldson DD & Urban JF. The role of IL 13 in hehninth-induced inflammation and protective immunity against nematode infections. Current Opinion in Immunology. 11: 420-426, 1999.

42

Georges E, Bradley G, Gariepy J, Ling V. Detection of P-glycoprotein isoforms by genespecific monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 152-156, 1990. Goodwin LG. Pentostan (sodium stibogluconate); a 50-year personal reminiscence. Transactions Royal Society Tropical Medicine Hygiene 89: 339-341, 1995. Grimaldi Jr. G, Tesh RB, McMahon-Pratt D. A review of the geographical distribution and epidemiology of leishmaniasis in the New World. Am j Trop Med Hyg 41: 687-725, 1989. Grogl M, Oduola AM, Cordero LD, Kyle DE. Leishmania spp.: development of pentostamresistant clones in vitro by discontinuous drug exposure. Exp Parasitol 69: 78-90, 1989. Grogl M, Thomason TN, Franke ED. Drug resistance in leishmaniasis: its implication in systemic chemotherapy of cutaneous and mucocutaneous disease. Am J Trop Med Hyg 47: 117-126, 1992. Handman E, Goding JW. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. Embo J 4: 329-336, 1985. Herwaldt BL. Leishmaniasis. Lancet 354: 1191-1199, 1999. Janvier F, Morillon M, Olliaro P. Visceral leishmaniasis: clinical sensitivity and resistance to various therapeutic agents. Med Trop (Mars). 68(1):89-101, 2008. Jones TC, Johnson WD, Jr., Barretto AC, Lago E, Badaro R, Cerf B, Reed SG, Netto EM, Tada MS, Franca TF, Wiese K, Golightly L, Fikrig E, Costa JML, Cuba CC, Marsden PD. Epidemiology of American cutaneous leishmaniasis due to Leishmania braziliensis. Journal of Infectious Diseases 156: 73-83, 1987. Kharazmi A, Kemp K, Ismail A, Gasim S, Gaafar A, Kurtzhals JA, El Hassan AM, Theander TG, Kemp M. T-cell response in human leishmaniasis. Immunol Lett. 65: 1-2 105-8, 1999. Khatami A, Firooz A, Gorouhi F, Dowlati Y. Treatment of acute Old World cutaneous leishmaniasis: a systematic review of the randomized controlled trials. J Am Acad Dermatol. 57(2):335.e1-29. Epub 2007 Mar 6, 2007. Lainson R. The American leishmaniases: some observations on their ecology and epidemiology. Transactions Royal Society Tropical Medicine Hygiene 77: 569-596, 1983. Lainson R, Shaw JJ. Evolution, classification and geographical distribution. In K KillickKendrick, The leishmaniasis in biology and medicine, Academic Press, London, p. 1-120, 1987. Lainson R, Shaw JJ, Souza AA, Silveira FT, Falqueto A. Further observations on Lutzomyia ubiquitalis (Psychodidae: Phlebotominae), the sandfly vector of Leishmania (Viannia) lainsoni. Mem Inst Oswaldo Cruz.;87(3):437-9, 1992. Llanos-Cuentas EA, Arana M, Cuba CAC, Rosa AC, Marsden PD. Leishmaniasis cutanea diseminada asociada a metastasis en mucosas, causada por Leishmania braziliensis: fracaso en el hallazgo de parasitos circulantes. Rev Soc Bras Med Trop 18: 271-272, 1985. Loiseau PM, Bories C. Mechanisms of drug action and drug resistance in Leishmania as basis for therapeutic target identification and design of antileishmanial modulators. Curr Top Med Chem. 6(5):539-50, 2006.

43

Lopes UG, Momen H, Grimaldi Jr. G, Marzochi MCA, Pacheco RS, Morel CM. Schizodeme and zymodeme characterization of Leishmania in the investigation of focci of visceral and cutaneous leishmaniasis. Journal of Parasitology 70: 89-98, 1984. Marsden PD. Mucosal leishmaniasis ("espundia" Escomel, 1911). Trans R Soc Trop Med Hyg 80: 859-876, 1986. Marsden PD, Tada MS, Barreto AC, Cuba CC. Spontaneous healing of Leishmania braziliensis braziliensis skin ulcers. Trans R Soc Trop Med Hyg 78: 561-562, 1984. Martin-Fontecha A, Sebastiani S, Hopken UE, Uguccioni M, Lipp M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traYc and priming. J Exp Med 198:615621, 2003. Marzochi KB. Dengue in Brazil--situation, transmission and control--a proposal for ecological control. Mem Inst Oswaldo Cruz.;89(2):235-45, 1994. McKenzie GJ, Emson CL, Bell SE, Anderson S, Fallon I, Zurawski G, Murray R, Grencis R & McKenzie AN. Impaired development of Th2 cells in IL 13-deficient mice. Immunity. 9: 423432, 1998. Mendona SC, Coutinho SG, Amendoeira RR, Marzochi MC, Pirmez C. Human american cutaneous leishmaniasis (Leishmania b. braziliensis) in Brazil: lymphoproliferative responses and influence of therapy. Clin Exp Immunol.; 64(2): 269, 1986. Mendona SCF, Deluca PM, Mayrink W, Reston GT, Silva FC, Cruz AM, lvaro LB, Costa CA, Genaro O, Toledo VPCP. Characterization of human T lynphocyte-mediated immune respponses induced by a vaccine against American tegumentary leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53,195-201. 1995. Mendona SC, Russell DG, Coutinho SG. Analysis of the human T cell responsiveness to purified antigens of Leishmania: lipophosphoglycan (LPG) and glycoprotein 63 (gp 63). Clin Exp Immunol.; 83(3): 472-8, 1991. Mendonca SC, Souza WJ, Nunes MP, Marzochi MC, Coutinho SG. Indirect immunofluorescence test in New World leishmaniasis: serological and clinical relationship. Mem Inst Oswaldo Cruz.; 83(3): 347-55, 1988. Miekeley N, Mortari SR, Schubach AO. Monitoring of total antimony and its species by ICPMS and on-line ion chromatography in biological samples from patients treated for leishmaniasis. Anal Bioanal Chem. 2002 372 3: 495-502, 2001. Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica Atlas de leishmaniose tegumentar americana: diagnsticos clnico e diferencial / Braslia: Editora do Ministrio da Sade, 2006. 136 p.: il. color. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos) Mittal MK, Rai S, Ashutosh , Ravinder , Gupta S, Sundar S, Goyal N. Characterization of natural antimony resistance in Leishmania donovani isolates. Am J Trop Med Hyg. 76(4):681-8, 2007. Mortari SR. Determinao da concentrao total de antimnio e de suas espcies qumicas em amostras clnicas de pacientes com leishmanioses. Departamento de Qumica. Pontifcia Universidade Catlica (PUC), Rio de Janeiro, p. 142, 2001.

44

Nashed BF, Maekawa Y, Takashima M, Zhang T, Ishii K, Dainichi T, Ishikawa H, Sakai S, Hisaeda H, Himeno K. Different cytokines are required for induction and maintenance of the Th2 type response in DBA/2 mice resistant to infection with Leishmania major. Microbes and Infection. 2: 14351443, 2000. Navin TR, Arana BA, Arana FE, Berman JD, Chajon JF. Placebo-controlled clinical trial of sodium stibogluconate (Pentostam) versus ketoconazole for treating cutaneous leishmaniasis in Guatemala. Journal of Infectious Diseases 165: 528-534, 1992. Ohl L, Mohaupt M, Czeloth N, Hintzen G, Kiafard Z, Zwirner J, Blankenstein T, Henning G, Forster R. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inXammatory and steady-state conditions. Immunity 21:279288, 2004. Oliveira Neto MP, Schubach A, Araujo ML, Pirmez C. High and low doses of antimony (Sbv) in American cutaneous leishmaniasis. A five years follow-up study of 15 patients. Mem Inst Oswaldo Cruz. 91(2):207-9, 1996. Oster CN, Chulay JD, Hendricks LD, Pamplin CL, 3rd, Ballou WR, Berman JD, Takafuji ET, Tramont EC, Canfield CJ. American cutaneous leishmaniasis: a comparison of three sodium stibogluconate treatment schedules. American Journal Tropical Medicine Hygiene 34: 856860, 1985. Pessa SB, Barretto MP. Leishmaniose Tegumentar Americana. Ministrio da Educao e Sade, Servio de Documentao, Rio de Janeiro, 527 pp, 1948. Rees PH, Keating MI, Kager PA, Hockmeyer WT. Renal clearance of pentavalent antimony (sodium stibogluconate). Lancet 2: 226-229, 1980. Rodgers MR, Popper SJ, Wirth DF. Amplification of kinetoplast DNA as a tool in the detection and diagnosis of Leishmania. Exp Parasitol 71: 267-275, 1990. Russell DG, Wilhelm H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. J Immunol 136: 2613-2620, 1986. Schubach A, Marzochi MC, Cuzzi-Maya T, Oliveira AV, Arajo ML, Oliveira AL, Pacheco RS, Momen H, Conceicao-Silva F, Coutinho SG, Marzochi KB. Cutaneous scars in American tegumentary leishmaniasis patients: a site of Leishmania (Viannia) braziliensis persistence and viability eleven years after antimonial therapy and clinical cure. Am J Trop Med Hyg. 58(6):824-7, 1998. Sharples CE, Shaw MA, Castes M, Convit J, Blackwell JM. Immune response in healthy volunteers vaccinated with BCG plus killed leishmanial promastigotes: antibody responses to mycobacterial and leishmanial antigens. Vaccine.; 12(15):1402-12,1994. Simpson L. The mitochondrial genoma of Kinetoplastid protozoa: genomic organization, transcription, replication and evolution. Annual Review of Microbiology 41: 363-382, 1987. Siviero do Vale, E. C. e Furtado, T. Leishmaniose tegumentar no Brasil: reviso histrica da origem, expanso e etiologia. Anais Brasileiros de Dermatologia VOLUME 80 - N. 4: Anais 80 anos 2005. Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Souza, Wilson J. S. de; Coutinho, Sergio Gomes; Marzochi, Mauro Clio de Almeida; Toledo, Luciano Medeiros de; Gottlieb, M. V. - Utilizao da reao de imunofluorescencia

45

indireta no acompanhamento da terapeutica da leishmaniose tegumentar americana.. Mem. Inst. Oswaldo Cruz; 77(3):247-53, 1982. Susanne Nyln, Radheshyam Maurya, Liv Eidsmo, Krishna Das Manandhar, Shyam Sundar, and David Sacks. Splenic accumulation of IL-10 mRNA in T cells distinct from CD4+CD25+ (Foxp3) regulatory T cells in human visceral leishmaniasis. The Journal of Experimental Medicine Vol. 204, No. 4, 16, 805817, 2007. Susanne Rath, Luciano Augusto Trivelin, Talitha Rebecca Imbrunito, Daniela Maria Tomazela, Marcelo Nunes de Jess e Percy Calvo Marzal. Antimoniais Empregados no Tratamento da Leishmaniose: Estado da Arte. Quim. Nova, Vol. 26, No. 4, 550-555, 2003. Tallab TM, Bahamdam KA, Mirdad S, Johargi H, Mourad MM, Ibrahim K, el Sherbini AH, Karkashan E, Khare AK, Jamal A.Cutaneous leishmaniasis: schedules for intralesional treatment with sodium stibogluconate. Int J Dermatol. 35(8):594-7, 1996. Walton BC, Chinel LV, Eguia y Eguia O. Onset of espundia after many years of occult infection with Leishmania braziliensis. American Journal Tropical Medicine Hygiene. 22: 696-698, 1973. Yardley V, Ortuno N, Llanos-Cuentas A, Chappuis F, Doncker SD, Ramirez L, Croft S, Arevalo J, Adaui V, Bermudez H, Decuypere S, Dujardin JC. American tegumentary leishmaniasis: Is antimonial treatment outcome related to parasite drug susceptibility? J Infect Dis. 15;194(8):1168-75, 2006. Epub 2006 Sep 8.

11. ANEXO

11.1 Termo de consentimento livre e esclarecido INSTITUIO: Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas - Fiocruz COORDENADOR DA PESQUISA: Armando de Oliveira Schubach ENDEREO: Av. Brasil 4365 - Manguinhos - Rio de Janeiro - RJ - CEP 21040-900 TELEFONES: (0xx21) 3865-9525 / 3865-9541 / FAX (0xx21) 3865-9541 NOME DO PROJETO DE PESQUISA: Ensaio clnico fase III para Leishmaniose Tegumentar Americana. Equivalncia entre o esquema padro e alternativos com antimoniato de meglumina NOME DO VOLUNTRIO: ___________________________________________________

46

Este documento procura esclarec-lo sobre o problema de sade em estudo e sobre a pesquisa que ser realizada, prestando informaes, detalhando os procedimentos e exames, benefcios, inconvenientes e riscos potenciais. A leishmaniose tegumentar americana (LTA) uma doena causada por parasitos chamados Leishmanias e que se apresenta como feridas na pele de difcil cicatrizao. Algumas vezes, a LTA pode se tornar mais grave, envolvendo as mucosas de revestimento interno do nariz e da garganta, mesmo vrios anos aps a cicatrizao da ferida na pele. Atualmente, no temos como saber qual paciente adoecer de novo e qual permanecer curado definitivamente. No Brasil, o Ministrio da Sade (MS) recomenda tratar os pacientes com LTA com antimoniato de meglumina em altas doses (20mg/kg de peso/ dia) durante 20 a 30 dias, respeitando o limite mximo de 3 ampolas dirias. Entretanto, alteraes nos rins, corao, fgado, pncreas e no sangue so freqentes. Alm de dores nas juntas e desconforto no local de aplicao das injees por via intramuscular. No Laboratrio de Vigilncia em Leishmanioses (VigiLeish) do IPEC, Fiocruz, uma dose baixa de antimoniato de meglumina (5 mg por kilograma de peso por dia) tem se revelado eficaz e bem tolerada no tratamento de pacientes com LTA. Os pacientes com a forma cutnea so tratados por 30 dias. Os pacientes com forma mucosa so tratados continuamente, por um mnimo de 30 dias, preferencialmente sem interrupo, at a cicatrizao das mucosas, o que costuma ocorrer entre 30 e 90 dias de tratamento. Pacientes idosos ou com outras doenas associadas so tratados com doses baixas em sries de 10 dias com intervalos de 10 dias sem medicao. Pacientes que apresentem contra-indicao para receber o tratamento por via intramuscular ou que apresentem sinais de intoxicao durante o tratamento, podero ser tratados com uma ou duas aplicaes de antimoniato de meglumina diretamente na leso de pele. Nossa experincia acumulada sugere que os esquemas de tratamento alternativos apresentam os mesmos bons resultados que o esquema padro recomendado pelo MS, porm, com menos efeitos adversos. Entretanto, somente aps a concluso deste estudo, poderemos sugerir ao MS que altere as recomendaes para o tratamento da LTA. Agora que o seu diagnstico de LTA foi confirmado, voc est sendo convidado a participar de uma investigao clnica a ser realizada no IPEC-Fiocruz, com os seguintes objetivos: Avaliar a resposta ao tratamento da LTA com o uso de diferentes doses ou formas de aplicao de antimoniais Descrever o comportamento dos antimoniais no corpo humano de acordo com os diferentes esquemas de tratamento Comparar a resposta imunolgica de pacientes tratados com os diferentes esquemas

47

 Caracterizar os isolados de Leishmania e verificar a sensibilidade ao antimonial A sua participao neste estudo voluntria. Voc poder recusar-se a participar de uma ou todas as etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a qualquer momento, sem que este fato lhe venha causar qualquer constrangimento ou penalidade por parte da Instituio. O seu atendimento mdico no ser prejudicado caso voc decida no participar ou caso decida sair do estudo j iniciado. Os seus mdicos podero tambm interromper a sua participao a qualquer momento, se julgarem conveniente para a sua sade. A sua participao com relao ao Projeto consiste em autorizar que a indicao do seu tratamento para forma cutnea de LTA, com antimoniato de meglumina por via intramuscular, seja feita por sorteio para um dos seguintes grupos: 1) dose alta por 20 dias contnuos; 2) dose alta em 2 sries de 10 dias; 3) dose baixa por 30 dias contnuos; 4) dose baixa em 3 sries de 10 dias. Caso haja alguma contraindicao para voc receber qualquer desses esquemas, o tratamento ser realizado com uma ou duas aplicaes da medicao, com um intervalo de duas semanas, diretamente na leso de pele. Em caso de forma mucosa voc poder ser sorteado para um dos seguintes grupos: 1) dose alta por 30 dias; 2) dose baixa diariamente at a cura. Os mdicos que iro avaliar o seu tratamento no sabero qual o esquema utilizado e voc no saber se estar tratando com dose alta ou baixa, para no serem influenciados no julgamento. Tambm ser necessria a sua autorizao: 1) para a utilizao de documentao fotogrfica ou filmagem de suas leses para estudo; 2) para que parte do material coletado periodicamente para a realizao de exames para acompanhamento da evoluo da sua doena, assim como os resultados destes exames de rotina e do seu tratamento sejam utilizados neste estudo; 3) para que parte das amostras coletadas seja estocada a fim de servir para outros estudos que tenham como finalidade a melhor compreenso da doena, o desenvolvimento e avaliao de novos mtodos diagnsticos; avaliao da resposta ao tratamento etc., desde que tal estudo seja previamente analisado e autorizado por um Comit de tica em Pesquisa. Participando deste estudo voc ter algumas responsabilidades: seguir as instrues do seu mdico; comparecer unidade de sade nas datas marcadas; e relatar a seu mdico todas as reaes que voc apresentar durante o tratamento, tanto positivas quanto negativas. Os exames e procedimentos aplicados lhe sero gratuitos. Voc receber todos os cuidados mdicos adequados para a sua doena. Caso voc necessite de atendimento mdico, durante o perodo em que estiver participando do estudo, mesmo fora do seu agendamento, procure o Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas - Fiocruz. Em caso de necessidade ligue para o Dr. Armando de Oliveira Schubach, Dra. Cludia Maria Valete Rosalino, Dra. Rilza Beatriz, Dra. rica Vasconcellos, Dra. Mariza Salgueiro, Dra. Ana Cristina nos telefones acima. Caso voc apresente qualquer problema que necessite de internao, a equipe mdica providenciar seu leito no Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas Fiocruz.

48

Sua identidade ser mantida como informao confidencial. Os resultados do estudo podero ser publicados sem revelar a sua identidade e suas imagens podero ser divulgadas desde que voc no possa ser reconhecido. Entretanto, se necessrio, os seus registros mdicos estaro disponveis para consulta para a equipe envolvida no estudo, para o Comit de tica em Pesquisa, para as Autoridades Sanitrias e para voc. Voc pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessrias antes de concordar em participar do estudo, assim como a qualquer momento durante o tratamento. O seu mdico dever oferecer todas as informaes necessrias relacionadas sua sade, aos seus direitos, e a eventuais riscos e benefcios relacionados sua participao neste estudo. Inconvenientes e riscos principais conhecidos at os dias atuais: O medicamento glucantime costuma causar efeitos indesejveis, no deve ser utilizado na gravidez e seu uso em mulheres em idade reprodutiva deve ser acompanhado de uso de mtodo anticoncepcional eficaz como preservativo de ltex masculino ou feminino ("camisinha"), diafragma feminino ou anticoncepcional oral ("plula"). Formas de ressarcimento: Sempre que necessrio, nos dias de seu atendimento, poder ser fornecida alimentao conforme rotina do Servio de Nutrio e Servio social do IPEC para pacientes externos. Benefcios esperados: Espera-se que, ao final do tratamento, voc esteja curado da LTA, embora as consultas de retorno por vrios anos aps o tratamento sejam necessrias para a confirmao da cura. Os resultados deste estudo podero no benefici-lo diretamente, mas no futuro, podero beneficiar outras pessoas, pois se espera que este estudo contribua para que o acompanhamento do tratamento de pacientes com LTA possa ser feito de forma mais eficaz e segura. Declaro que li e entendi todas as informaes referentes a este estudo e que todas as minhas perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe mdica, a qual estar disposio para responder minhas perguntas sempre que eu tiver dvidas. Recebi uma cpia deste termo de consentimento e pelo presente consinto, voluntariamente, em participar deste estudo de pesquisa.

_________________________________________________ Nome paciente:

___________ Data

_________________________________________________ Nome mdico:

___________ Data

49

11.2 Cronograma de execuo do projeto geral-em dias

Procedimento Pr- tto 1 10 Bipsia de pele6 x Clnico x x x Audio/Vestibular x x8 x Dermatolgico x x x ORL x x8 Odontolgico x x8 Fotografia x Adeso x x Incio tto x Final tto Ficha incluso x Coagulograma x Teste Gravidez x Hemograma x x Bioqumica x x Sorologia LTA x x ECG x x EA Clnicos x Ficha finalizao7 Grupo 1; 2) Grupo 2; 3) Grupo 3;

20 x x x x x x1

30 x x x

40 50 80 110 140 230 320 410 590 770 x x x x x x x x x x4 x4 x x x x x x

x x2,3,4 x4 x2,3

x x x x

x x x x

x x x x

x x x x

x x x x

x x x x

x x x x

x x x x x

x x x x x

x x x x x

x5 x5 x x5 x5

x 4) Grupo 4; 5) no caso de efeitos adversos (EA) clnicos,

laboratoriais ou eletrocardiogrficos (ECG) presentes no dia 80, monitorar at a sua normalizao; 6) raspado, imprint, histopatolgico, cultura, PCR, imunohistoqumica e imunopatologia (repetir antes do re-tratamento nos casos de reativao); 7) Na consulta de concluso ou no caso de retirada precoce do estudo; 8) caso no tenha sido feita no pr-tto

50