II.

TERAPIA GENICA

2.1 Concepto El concepto de terapia gnica resulta de la observacin de que ciertas enfermedades, entre ellas particularmente el cncer, resultan de daos genticos especficos (Felgner y Rhodes, 1991; Anderson, 1992; Roemer y Friedman, 1992; Pyeritz, 1992; Kart y Broker, 1994; Friedman, 1996). En principio, las patologas causadas por defectos monogenticos podran ser curadas mediante la insercin y expresin de una copia normal del gen daado. La terapia gnica se sustenta en la tradicin frmaco-quirrgica de la medicina y se define como la aplicacin de principios genticos para el tratamiento de enfermedades humanas (Wolf y Lederberg, 1994). Concretamente el trmino terapia gnica unifica los principios de la farmacologa con los de la gentica, pues implica tcitamente el empleo de cidos nucleicos como el agente farmacolgico para el tratamiento de estados patolgicos, con esto la terapia gnica persigue modificar el genoma de las clulas somticas transfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades adecuadas del producto gnico normal, cuya accin corregira la enfermedad gentica. La estrategia general que se utiliza para la terapia gnica no es ms que una extensin de la tcnica de seleccin clonal por complementacin funcional. Primero, la funcin ausente en el organismo recipiente como consecuencia de la presencia de un gen defectuosos se introduce en un vector; luego, este vector se inserta en uno de los cromosomas recipientes y genera un organismo transgnico que se ha "curado" genticamente. Esta tcnica tiene un enorme potencial en los seres humanos porque nos ofrece la esperanza de corregir los desordenes genticos. 2. Aunque dentro de unos aos ser posible mediante la terapia gnica reparar los errores que existen en un gen y causan la enfermedad, los objetivos actuales son ms modestos. En primer lugar, la terapia gnica trata de complementar o sustituir el defecto en la funcin de un gen defectuoso introduciendo otra copia normal de ste en las clulas. Por otra parte, en otras situaciones lo que se intenta es lo contrario, es decir, inhibir o bloquear el funcionamiento de aquellos genes cuya intervencin contribuye al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo los oncogenes que intervienen en el cncer o los genes de virus que son necesarios para que estos se multipliquen en las clulas). Por ltimo, existen otras posibilidades de accin de la terapia gnica en la que lo que se busca no es suplir o inactivar la funcin de un gen, sino introducir la informacin que permita a la clula sintetizar una protena que tenga un efecto teraputico nuevo. Este es el caso de la transferencia de genes para estimular el sistema inmune para que acte frente a tumores o enfermedades infecciosas, para que se acelere la reparacin de heridas, fracturas o se produzcan nuevos vasos sanguneos, etc.

3. Objetivos de la terapia gnica 4. Requisitos y criterios para realizar estudios de terapia gnica Evidentemente la meta de los estudios que involucran la terapia gnica como alternativa teraputica es la posibilidad de la utilizacin en la clnica. Para ello se requiere cumplir una serie de requisitos que justifiquen estos medios y que a continuacin se mencionan: A. La patologa no debe tener actualmente un tratamiento efectivo para su cura. Para llegar a una propuesta teraputica slida y cientficamente viable, se requiere de una fuerte inversin en recursos humanos y econmicos por un tiempo prolongado. Esto hace que el costo de una o varias lneas de investigacin que conduzcan a la propuesta de alternativas teraputicas para determinada patologa sea elevada. La inversin de estos recursos debe ser justificada cuidadosamente y, por ello, es conveniente que la patologa constituya un problema de salud pblica que no cuente con cura actualmente. B. Se debe conocer en lo posible los detalles del efecto involucrado a nivel molecular. Es evidente que si se pretende intervenir a nivel molecular, es indispensable contar con el conocimiento detallado del efecto, o los efectos. C. Se debe tener un sustento cientfico slido que justifique la intervencin a nivel molecular. Para llegar a la aplicacin clnica de la terapia gnica, se debe contar con amplia y slida evidencia cientfica que demuestre que la intervencin a nivel molecular podra resultar en la mejora de la salud el paciente, o en la resolucin del problema en cuestin. Esto se hace evidente mediante la publicacin de artculos cientficos que forman el marco terico que sustenta la intervencin molecular. Los protocolos establecidos internacionalmente requieren de una secuencia lgica que incluye desde la comprobacin de cambios celulares fenotpicos in vitro, generados por el cido nucleico teraputico en cuestin, as como la comprobacin de los efectos teraputicos en modelos animales, la caracterizacin toxicolgica del procedimiento, hasta llegar finalmente a la propuesta de su aplicacin en protocolos clnicos. 2. 3. Normas para recibir terapia gnica Las normas para recibir terapia gnica estn bien establecidas e incluyen varios requisitos: A. El gen debe estar aislado y debe estar disponible para la transferencia, normalmente por clonacin. B. Debe haber un medio efectivo para la transferencia del gen. Por el momento, muchos ensayos utilizan vectores retrovricos, aunque tambin se emplean otros mtodos, como los vectores adenovricos y las tcnicas fsicas y qumicas. C. El tejido diana debe ser accesible para la transferencia gentica. La primera generacin de procesos de terapia gnica utiliza glbulos blancos o sus precursores como tejido diana. D. No debe haber ninguna forma de terapia efectiva disponible, y la terapia gnica no debe daar al paciente.

Actualmente se estn tratando varias enfermedades hereditarias con terapia gnica, como la inmunodeficiencia combinada grave (SCDI, del ingles severe combined inmunodeficiency), la hipercolesterolemia familiar, la fibrosis qustica y la distrofia muscular, y se estn desarrollando procesos para tratar otras enfermedades. III. ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA En terapia gnica se utilizan dos grandes estrategias actualmente: las estrategias ex vivo (consiste en extraer clulas de un paciente, modificarlas in vitro mediante un vector retrovrico y reimplantarlas en el organismo) y las estrategias in vivo (se trata de administrar el gen corrector al paciente en lugar de hacerlo a clulas en cultivo). 3.1Estrategias ex vivo El tratamiento est basado en la obtencin previa de clulas del paciente procedentes de un tejido u rgano de inters. A continuacin se procede a la disgregacin de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro, en donde las clulas son posteriormente transfectadas por el "gen teraputico" utilizando para ello un vector adecuado. Las clulas transfectadas son seleccionadas en funcin de su capacidad para expresar el gen exgeno de forma estable y persistente. Las clulas as seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente. Tambin se puede utilizar lneas celulares alognicas en aquellos casos en los que el rgano o tejido de inters no puede ser extrado con facilidad o que ofrece dificultada in vitro. El riesgo de rechazo es mnimo y, por ello, es la tcnica ms utilizada. Se usa fundamentalmente en el tratamiento de cnceres. 1. 1. Mtodos no virales 2. Mtodos de transferencia gentica in vitro A. B. C. D. Qumicos: Fosfato clcico. Fsicos: Electroporacin, Microinyeccin, Bombardeo de partculas. Fusin: Complejos ADN-liposomas. Endocitosis mediada por receptor: Complejos ADN-protena, Complejos ADNcpsida/ envoltura viral , Inmunoliposomas/liposomas destinados.

1. 2. Mtodos virales A. B. C. D. Adenovirus Retrovirus Virus adeno-asociados Herpes virus

1. El tratamiento est basado en la administracin sistemtica de la construccin gnica de inters. Aunque el ADN puede ser administrado de forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algn vector que facilite el proceso de

transferencia del gen y permita la entrada y localizacin intracelular del mismo, de tal forma que ste resulte en un gen funcionante. As mismo, es importante recurrir a vectores con destinos especficos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado rgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumticos o quirrgicos. Se emplea en clulas difcil de extraer e implantar nuevamente, como sucede en la mucoviscidosis. 1. 2. Mtodos no virales 2. Estrategias in vivo

Inespecficos DNA desnudo Complejo DNA-liposomas Especficos Mediados por receptor Complejos DNA-protena Inmunoliposomas/liposomas destinados

1. 2. Mtodos virales

Retrovirus Adenovirus Virus adeno-asociados Herpes virus

3.3 Introduccin del transgn Antes de explicar ms detalladamente el modo de introduccin del transgn y ver las enfermedades en las que se aplica la terapia gnica, es conveniente definir de forma clara qu es un transgn, tambin denominado construccin gentica. Podramos definirlo como un conjunto de uno o ms genes y secuencias reguladoras que controlan la expresin de ste. Este transgn es el que tiene la funcin teraputica, y es el que da la terapia gnica. Hasta el momento no se ha realizado ninguna experiencia, a pesar de ser lo ms idneo en un tratamiento, debido a su dificultad. Actualmente la mayora de las experiencias se estn realizando en modelos animales, pero tambin existen ya ensayos clnicos en humanos. 3.3.1 Mtodos directos 3.3.1.1 Sistemas qumicos A) Transferencia con fosfato de calcio

Se empez a usar esta tcnica en los aos 60, pero fue en los 70 cuando se empez a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfeccin. Se basa en la precipitacin del DNA exgeno y los iones de calcio, provocando que la clula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfeccin puede llegar al 10% de las clulas, aunque suele ser transitoria. No es una tcnica que provoque toxicidad en las clulas pero la expresin del transgn es muy pequea. nicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicacin es "ex vivo". 3.3.1.2 Sistemas fsicos A. Consiste en colocar el DNA mediante una inyeccin en el ncleo de las clulas. Al introducirlo directamente all, evitamos la degradacin citoplasmtica y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualizacin. Las clulas que sobreviven y han insertado el material gentico presentan una alta eficacia de expresin del mismo. La tcnica es muy laboriosa y necesita clulas aisladas para su realizacin. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyeccin en embriones se denomina terapia gnica germinal siendo un mtodo "in vivo". B. Microinyeccin C. Electroporacin Se introduce la construccin gnica mediante un choque elctrico a las clulas que provoca la formacin de poros en sus membranas , por donde entra el transgn. Est especialmente indicado para clulas con una alta tasa de proliferacin. Sin embargo, muchas clulas mueren al no soportar el choque elctrico por lo que muchas veces no es la forma ms indicada en algunos tipos celulares. C) DNA desnudo Consiste en la introduccin del DNA en una solucin salina o srica, normalmente mediante inyeccin intramuscular, para conseguir la expresin del transgn. Se ha observado actualmente expresin en timo, piel, msculo cardaco y msculo esqueltico. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la clula aunque se postula que es a travs del complejo del poro nuclear. Tiene un bajo porcentaje de clulas transfectadas, no hay integracin en el genoma y una vez inyectado no hay replicacin en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realizacin de la terapia gnica "in vivo". 3.3.2 Mtodos directos (mediados por vectores) 3.3.2.1 Vectores no virales A) Liposomas

En 1965 se descubri que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipdica a semejanza de una clula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la clula, pero hasta 1980 no se consigui una eficacia de transfeccin adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catinicos y liposomas aninicos. B) Liposomas catinicos Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lpidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se estn probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro". Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradacin al transgn hasta su llegada al ncleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene lmite. Podemos hacerlos llegar a tejidos especficos incluyendo receptores en la capa lipdica. Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfeccin, una expresin transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes sricos. C) Biolstica o Gene-gun Consiste en el bombardeo de los tejidos con partculas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de all el nombre de la tcnica). La capacidad de penetracin es limitada usndose en lneas celulares, epidermis, msculo e hgado. Su expresin es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta tcnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de clulas animales) e "in vivo" (en el caso de clulas vegetales). D) Vectores virales Esta metodologa comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar clulas de mamfero. El desarrollo en 1989 de las clulas empaquetadoras (aportan la composicin proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que sta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodologa al aumentar la titulacin en virus no patgenos. En todos los casos vamos a eliminar el mayor nmero de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exgeno. Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta el momento los virus ms utilizados en terapia gnica son los siguientes: - Retrovirus Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes teraputicos relativamente grandes (un mximo de 8 Kb). Necesitan de clulas empaquetadoras para su obtencin. Se transfiere el DNA del virus mediante la tcnica del fosfato de calcio a las clulas empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transduccin en la cual introducimos la construccin gnica de inters. Los virus inyectados en el husped integran su DNA en el genoma del husped expresando as el gen que le hemos aadido. Como las protenas del virus no son

expresadas por el husped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transduccin y tambin de expresin, siendo un sistema bien estudiado. Sin embargo, nicamente sirven para infectar clulas del husped que se encuentran en divisin. Adems los ttulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integracin en el genoma es al azar. Existen tambin vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es ms complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus. - Adenovirus Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exgeno. Normalmente en terapia gnica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos. En este caso no se necesita la integracin del material hereditario del virus en el del husped para su replicacin, por lo tanto tampoco el transgn ser introducido en el genoma de la clula. Y por tanto tampoco necesitan que las clulas infectadas estn dividindose para su replicacin. La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transduccin, al igual que la expresin de la construccin gnica introducida, sin embargo sta es transitoria (pocas semanas). Esto ltimo obligara a tratamientos peridicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria. - Virus adenoasociados (VAA) Son parvovirus, contienen DNA como material gentico, y requieren la coinfeccin con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exgeno es pequea, slo de 5 Kb. Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la clula durante la replicacin, por lo que la transduccin (la cual es altamente eficaz) es estable en la clula diana. Adems pueden infectar tanto a clulas en divisin como a las que no lo estn (de gran importancia para la terapia gnica "in vivo"). Los vectores AAV no estn implicados en ningn tipo de enfermedad humana. Adems el riesgo de una respuesta inmune est minimizado ya que no produce protenas vricas. Sin embargo existen tambin una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todava no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus. - Herpesvirus Son virus DNA cuyas clulas diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todava conocemos de esta familia de virus dificulta su utilizacin.

La gran ventaja es el gran tamao de su DNA , que les permite aceptar varios genes teraputicos, incluso podran ir con sus propias regiones reguladoras. Uno de los inconvenientes es que habra que eliminar las secuencias que codifican para las protenas lticas del virus que causan la muerte de las clulas a las que infectan. Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilacin de las caractersticas que deberan presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia gnica: - Permitir la incorporacin y expresin regulada durante el tiempo conveniente, de uno o ms genes necesarios para la aplicacin clnica requerida - Ser especfico en su transferencia gnica - Ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria - Ser estable y fcil de obtener 3.4.Otras estrategias utilizando cidos nucleicos Como ya hemos visto la terapia gnica supone la manipulacin de las clulas utilizando procedimientos destinados tanto a reparar e incorporar nuevos genes en la clula como tambin a bloquear e inhibir la sobreexpresin de los mismos con fines teraputicos. 3.4.1 Oligonucletidos antisentido Los oligonucletidos son secuencias cortas de cidos nucleicos diseados para unirse a secuencias especficas de ADN (formacin de ADN triplex) o ARN (formacin de heteroduplex ARN-ADN). Los oligonucletidos antisentido son complementarios de secuencias especficas de un determinado ARN mensajero (secuencia sentido) . La formacin de un heteroduplex bicatenario sentido-antisentido bloquea la traduccin del mensaje gentico a protena. Las estrategias antisentido tienen un gran potencial teraputico para inhibir la expresin de genes en patologas tales como el cncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas como el SIDA. Sin embargo, su utilizacin en clnica se ha visto limitada por su corta vida media en la circulacin sistemtica y su dificultad para acceder con actividad funcional al citoplasma y/o ncleo celular. Ms adelante en el apartado sobre aplicaciones sobre el cncer se explicar este tipo de estrategia con mayor profundidad. 3.4.2 Reparacin gentica mediante oligonucletidos Es una estrategia destinada a reparar genes cuya alteracin es originada por una mutacin puntual conocida y el objetivo es activar selectivamente los mecanismos celulares de reparacin del ADN, el lugar de la mutacin. Para ello se disean oligonucletidos especficos para secuencias genmicas adyacentes al lugar de la mutacin, en cuyo extremo el oligonucletido lleva un agente capaz de lesionar el ADN , mediante la formacin de un enlace covalente con el nucletido responsable de la mutacin . La lesin selectiva del nucletido mutado, desencadena el proceso celular de reparacin del ADN que conduce a una normalizacin estructural y funcional del gen.

3.4.3 Ribozimas El trmino ribozima ha sido introducido para describir molculas de ARN con actividad enzimtica. Se ha identificado una enorme variedad de motivos catalticos de ribozimas, todos los cuales catalizan reacciones en sustratos de ARN. Estas reacciones llevan a cabo la rotura y ligacin de las cadenas en sitios especficos. Una caracterstica comn para todos los ribozimas es el requerimiento del in de un metal con carga divalente, como el magnesio Mg+2 , que participa en la reaccin qumica. Diferentes centros catalticos de ribozima han sido incorporados en ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad de aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos centros cortndolos en sitios especficos. La actividad del centro cataltico de ribozima da el corte y destruccin del ARN diana. Aparejando el ribozima con el sustrato necesitara poco tiempo para cortar el ADN diana, inactivndolo funcionalmente. Una vez que la diana ha sido cortada, el ribozima puede disociarse de los productos cortados y repetir el ciclo de unin , rotura y disociacin. La habilidad de los ribozimas para cortar dianas y despus reciclarlas proporciona una ventaja sobre los ARN antisentido estndar; as acta estequiomtricamente, y no destruye la funcin del ARN diana. Los ribozimas pueden ser producidos qumica, bioqumica o biolgicamente, y algunas caractersticas de los oligodesoxinucletidos antisentido tales como modificaciones qumicas en la cadena o en las uniones entre nucletidos, pueden ser incorporadas dentro de la molcula del ribozima sinttico, as aade estabilidad a la molcula. La especificidad de apareamiento de bases, puede ser usada para dirigir los ribozimas a sus dianas, de ese modo se sugiri desde etapas muy tempranas en el conocimiento de los ribozimas que estas molculas nicas podran ser creadas por ingeniera para reconocer o aparearse con bases del ARN diana de cualquier clula o virus. Aunque se han hecho significativos progresos en la ingeniera de ribozimas, todava hay un montn de cosas que deben ser aprendidas en orden para optimizar la funcin del complejo de los ribozimas en el comportamiento intracelular. Hasta estos das, la mayora de experimentos intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con los ribozimas denominados "cabeza-martillo" (hammerhead). De cualquier manera, otros motivos de ribozimas, tales como los llamados "horquilla" (hairpin), comparte mucho de los mismos requerimientos bsicos para maximizar la eficacia intracelular. As, la aplicacin con xito del ribozima "cabeza-martillo" debera proporcionar valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de ribozimas. La simplicidad del dominio cataltico de "cabeza-martillo" lo ha hecho popular en el diseo de ribozimas que actan en trans. Los requerimientos en el sitio de corte son relativamente simples, y virtualmente cualquier UX (donde X es U, C o A) pueden ser dianas, aunque la eficiencia de la reaccin de rotura vara entre diferentes combinaciones. Por otro lado una versin de ingeniera del ribozima "horquilla", tambin llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar mltiple variedad de dianas en trans. Aunque

hay una serie de cambios en el sustrato para este tipo de ribozima. Entre stos, incluye una G obligatoria junto al sitio de rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en las combinaciones de secuencia gua-sustrato, lo que hace que tenga un potencial xito contra una amplia variedad de ARN diana. Estos ARNs catalticos son relativamente simples y pueden ser construidos para esconder secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un ARN deseado. Hay cinco reas de investigacin que podran llevar a un aumento en la eficacia intracelular de los ribozimas. Estos son:

El reparto de ribozimas a clulas apropiadas. La eficiente expresin de los ribozimas en estas clulas. La co-localizacin de los ribozimas y el sustrato de ARN diana en el mismo compartimiento. La especificidad de los ribozimas para reconocer y cortar slo la diana del sustrato de ARN. El aumento del reciclaje del sustrato mediado por los ribozimas.

IV. V.

APLICACIN DE LA TERAPIA GENICA

1. En Animales El primer ejemplo de terapia gnica en mamferos fue la correccin de la deficiencia en la produccin de la hormona de crecimiento en ratones. La mutacin recesiva little (lit) produce ratones enanos. A pesar de que estos presentan un gen de la hormona del crecimiento aparentemente normal, no producen mRNA a partir de este gen. El primer paso en la correccin del defecto consisti en la inyeccin en huevos lit/lit de unas 5 mil copias de un fragmento de DNA lineal de 5 Kb portador de la regin estructural del gen de la hormona del crecimiento de la rata fusionado al promotor del gen de la metalotionena de ratn (MP). La funcin normal de la metalotionena es la destoxificacin de los metales pesados, por lo que la regin reguladora responde a la presencia de metales pesados en el animal. Los huevos inyectados se implantaron en hembras pseudopreadas y se analizo la descendencia. Aprox. el 1% de los ratones recin nacidos resultaron ser transgnicos, y aquellos a los que se les administraron metales pesados durante el desarrollo alcanzaron mayor tamao. En los mamferos, el sitio de insercin del DNA introducido es muy variable y no suele encontrarse integrado en el locus homologo. Por ello, la terapia gnica en la mayora de los casos no implica una correccin genuina del problema original sino ms bien un enmascaramiento del mismo. Se ha generado una tecnologa similar para generar variedades transgnicas de salmn del Pacifico con una tasa rpida de crecimiento y los resultados han sido espectaculares. Se microinyect en huevos de salmn un plasmado portador del gen de la hormona del crecimiento regulado por el promotor de la metalotionena (ambos derivados del salmn).

Una pequea porcin de los peces resultantes fue transgnica, a juzgar por los resultados positivos obtenidos por el escrutinio del DNA utilizando el plasmado como sonda. Estos peces por termino medio pesaron 11 veces ms que los controles no transgnicos. 4.2 En humanos Quizs, la aplicacin ms excitante y polmica de la tecnologa de los transgenes es la que respecta a la terapia gnica humana, es decir, el tratamiento y alivio de las enfermedades genticas humanas mediante la adicin de genes silvestres exgenos para corregir la funcin defectuosa de las mutaciones. En los seres humanos puede utilizarse dos tipos bsicos de terapia gnica, la somatica y la germinal. 4.2.1 Terapia en clulas somticas La terapia gnica en clulas somatica, que ha sido el ncleo central de la investigacin de terapia gnica en seres humanos, consiste en la introduccin de genes normales en clulas somticas humanas para tratar un trastorno especifico. Las clulas del paciente pueden extraerse y manipularse fuera del cuerpo (terapia ex vivo) o, en algunos casos, las clulas pueden tratarse mientras permanecen en el cuerpo (terapia in vivo). Algunos tipos de clulas somticas son ms apropiadas para la terapia gnica que otros. Los buenos candidatos deben ser fcilmente accesibles y tener una vida media prolongada en el organismo. En algunos sistemas de cesin gentica son preferibles las clulas en proliferacin ya que, en este caso, el vector portador del gen puede integrarse en el interior del DNA de la clula. No todos los tipos de enfermedades son apropiadas para la terapia gnica. Es probable que muchas enfermedades dominantes, en especial las causadas por mutaciones dominantes negativas, sean difciles de tratar porque requeriran de un bloqueo del efecto del gen. La terapia gnica alcanza sus objetivos con ms facilidad en las enfermedades recesivas que implican la presencia de un producto gentico defectuoso o perdido. En este caso, la insercin de un gen normal sustituira al producto perdido. Muchos trastornos recesivos de deficiencia enzimtica pueden corregirse, en potencia, cuando se produce alrededor de 10% del nivel enzimtico normal. Existen muchos posibles mtodos de introduccin de genes en las clulas, incluyendo la fusin celular, la coprecipitacin de fosfato clcico (el compuesto qumico altera la membrana celular, facilitando la introduccin del DNA extrao), las microinyecciones y la fusin de liposomas. Los dos sistemas de cesin ms utilizados son: los retrovirus y los adenovirus. 4.2.1.1 Vectores retrovirales Los retrovirus son capaces de insertar copias de sus genomas en las clulas husped despus de retrotranscribir su RNA viral en el DNA. Los retrovirus se integran en el DNA del husped con un lato grado de eficacia, lo que los convierte en una opcin

razonable como vector de cesin de genes. Los retrovirus deben ser modificados para que no se repliquen ni afecten al husped. Esto se realiza utilizando tcnicas de DNA recombinante que provocan la deleccin de la mayor parte del genoma retroviral, sustituyndola por una copia normal de un gen humano, sus elementos reguladores y una seal de poliadenilacion (el material gentico humano se denomina "inserto"). Los retrovirus pueden aceptar insertos de incluso 8 Kb. Estos virus de replicacin defectuosa se propagan en clulas empaquetadoras (a veces, denominadas clulas auxiliares) que compensan la maquinaria perdida de reproduccin de los retrovirus. Este mtodo permite la reproduccin de mltiples copias de retrovirus que contienen el gen humano, pero que no pueden replicar a si mismas. A continuacin, los retrovirus que contienen las partculas se incuban con las clulas somticas del paciente (P. Ej. linfocitos o clulas primordiales de la medula sea humana). Los retrovirus modificados insertan el gen humano normal en el DNA de la clula husped. De forma ideal, el gen normal codificara despus un producto gnico normal en las clulas somticas del paciente. Este tipo protocolo ha tenido unos resultados iniciales favorables en el tratamiento de la deficiencia de adenosina desaminasa. Aunque la terapia gnica retroviral es muy prometedora, plantea varias dificultades:

Expresin transitoria o de bajo nivel. El producto gnico puede expresarse en niveles subteraputicos, a menudo inferiores al 1% de la cantidad normal. En parte, ello se debe a que tan solo algunas clulas diana incorporan con xito al gen normal. Adems, la insercin aleatoria del retrovirus en el genoma del husped puede afectar la regulacin del gen. La trascripcin cesa a menudo al cabo de algunas semanas o meses. Dificultades para alcanzar el tejido diana. Mientras que algunos transtornos sistmicos pueden ser relativamente fciles de tratar modificando linfocitos o, quiz clulas primordiales de clula sea, otros plantean grandes dificultades. P. Ej. a menudo es difcil alcanzar las neuronas afectadas responsables de enfermedades del sistema nervioso central. Potencial de oncognesis. Puesto que los retrovirus se integran al azar en el DNA del husped, podra localizarse junto a un protooncogen, activarlo y ocasionar as una formacin tumural. Para minimizar esta posibilidad se alteran los promotores retrovirales; hasta ahora no se han descrito otros casos directamente atribuibles a la insercin de retrovirus. Necesidad de una regulacin precisa de la actividad del gen. La regulacion precisa de la actividad del gen no es necesaria en algunas enfermedades (P. Ej. una expresin 50 veces superior de la adenosina desaminasa no tiene efectos clnicos importantes). Sin embargo, es fundamental para enfermedades como la talasemia, en la que el nmero de cadenas de alfaglobina y betaglobina debe ser muy equilibrado. Es difcil alcanzar una precisin utilizando la terapia gnica retroviral. Los retrovirus solo infectaran las clulas en divisin activa. Esta propiedad de los virus impide su utilizacin en clulas que no se dividen o de divisin lenta (P. Ej. las neuronas).

Se esta efectuando un gran esfuerzo de investigacin para superar estos problemas. En especial, se estn estudiando mtodos de insercin dirigida de genes y estn desarrollando tcnicas que aumenten los niveles y la permanencia de la expresin del gen. 4.2.1.2 Vectores adenovirales Debido a la incapacidad de los retrovirus para invadir las clulas que no se dividen, se han estudiado otros sistemas de cesin que no tengan esta limitacin. Un ejemplo importante es el adenovirus, un virus con DNA con doble filamento utilizado a menudo en las preparaciones de vacunas. Igual que el retrovirus, el adenovirus puede aceptar un inserto que no supere los 7 u 8 Kb de longitud. Antes de su empleo en terapia gnica se han de manipular los adenovirus para que tengan una replicacin diferente. En la actualidad se estn utilizando adenovirus en estudios en los que el gen CFRT normal es administrado, por un mtodo en aerosol, a las clulas epiteliales que revisten los pulmones (terapia gnica in vivo). Se espera que este tratamiento logre alterar la actividad de los canales del cloro en los pacientes con fibrosis qustica. Un inconveniente de los adenovirus es que no se integran en el DNA de la clula husped. Por lo tanto, finalmente se pierden, originando una expresin del gen transitoria y la necesidad de reintroduccin del vector. 4.2.1.3 Terapia gnica en enfermedades no hereditarias Por ejemplo en el tratamiento del melanoma maligno se ha insertado ex vivo un gen codificador de factor de necrosis tumoral (TNF: tumor necrosis facto) en linfocitos que infiltran tumores. Aunque el TNF es toxico administrado por va sistmica, se espera que los linfocitos que infiltran tumores, que tienen como objetivo natural los melanomas, dirijan de forma especfica el TNF hacia los tumores y los destruyan. La terapia gnica se esta ensayando tambin en el tratamiento de la artritis reumatoide y su objetivo consiste en bloquear los efectos inflamatorios de la interleucina (IL-1). Se inserta un gen codificador de la protena antagonista del receptor IL-1 (IRAP) en las clulas sinoviales que revisten las articulaciones, limitando as la inflamacin causada por IL-1. 2. 3. Terapia de lnea germinal La terapia de clulas somticas consiste en la alteracin nicamente de las clulas somticas especificas y, por lo tanto, difiere poco en principio de muchos otros tipos de intervencin medica (P. Ej. los transplantes de medula sea). En cambio, la terapia gnica germinal implica la alteracin de todas las clulas del cuerpo, incluyendo las que originan a los gametos. Por lo tanto, este tipo de terapia gnica no solo afectara al paciente sino tambin a todos sus descendientes. La terapia de lnea germinal se desarrollo por primera vez en ratones en 1983, cuando se introdujeron con xito copias del gen de la hormona del crecimiento humano en embriones de ratones mediante microinyeccin (el gen se inserta directamente ene.

Interior del embrin utilizando una pequea aguja). En la minora de embriones en los que se integr el gen tambin se produjo una modificacin de los gametos y el gen de hormona del crecimiento humana se transmiti a las sgtes. Generaciones (los ratones alcanzaban un tamao anormalmente grande). Aunque en principio la terapia de lnea germinal es posible en los seres humanos plantea importantes problemas. En primer lugar, los embriones inyectados suelen morir y algunos desarrollan tumores y malformaciones. En segundo lugar, incluso en un trastorno autosmico dominante, la mitad de los embriones sern genticamente normales. Si fuera posible distinguir los embriones genticamente normales (P. Ej. mediante diagnsticos por PCR de productos fecundados in vitro), seria ms fcil implantar los embriones normales que alterar los anormales. Por ultimo, existen numerosas cuestiones ticas asociadas con la alteracin permanente de la herencia gentica humana. Por estos motivos, parece improbable que la terapia de la lnea germinal humana sea til o deseable. IV. V.

ENFERMEDADES TRATADAS POR TERAPIA GENICA

Existe una gran esperanza para pacientes afectados por alguna enfermedad puedan ser tratados por terapia gnica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo por un gen normal. An as, los obstculos que supone la terapia gnica son muy importantes. Se necesita mucha informacin sobre la patologa molecular de un desorden gentico, antes de que los investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la terapia gnica, y si es as, tambin habra que tener en cuenta diferentes asuntos sociales y ticos. El gen en cuestin debe ser clonado y adems debe existir una manera segura de introducir el gen en las clulas. Los primeros experimentos en los que clulas tratadas genticamente o manipuladas, y fueron introducidas en pacientes humanos comenzaron en 1.989, y las primeras pruebas clnicas sobre terapia gnica, para las eficiencia de adenosina desaminasa, comenzaron el Septiembre de 1.990. A continuacin discutiremos las tcnicas de terapia gnica empleadas en las diferentes enfermedades humanas as como sus problemas y resultados. 5.1 Fibrosis qustica Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes humanos en clulas sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la expresin gnica, es decir, que el gen introducido sea estable. El gen para la fibrosis qustica (CF) era un objetivo importante para la terapia gnica. In vivo se haban descrito anormalidades en la conductancia en los canales de cloro, y una lnea celular CF- expresaba el mismo defecto. Esta lnea celular se utiliz en ensayos que intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la clula. Uno de los

vectores que ms se han utilizado en la lucha contra la fibrosis qustica ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) era construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado en un vector retroviral. Las clulas CF- eran infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la clula con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418. Las clulas expresaban el gen CFTR. Los datos ms interesantes procedan de las medidas del grado de funcionamiento de los canales para el cloro. El flujo aninico de las clulas en respuesta a una estimulacin por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo aninico de las clulas CF- y de las clulas CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta rpidamente en clulas CF- con CFTR , pero en las clulas CF- el flujo permaneca bajo. Se utilizaron tcnicas electrofisiolgicas para determinar si la conductancia para el cloro influa en ese flujo aninico. Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban nicamente en las clulas CF- con CFTR. Significativamente, la respuesta de las clulas CF- con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia gnica para la fibrosis qustica , usando vectores retrovirales directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea posible. 5.2 Fibroblastos de la piel utilizados en terapia gnica Un tipo de clulas que sirve como vehculo para transferir genes son los fibroblastos de la piel. Estas clulas han sido usadas en pacientes afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales. Los fibroblastos se obtienen fcilmente crecen bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las clulas de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que contena un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de enzima en las clulas infectadas alcanz el nivel de las clulas normales. En el caso de la deficiencia de adenosina desaminasa, los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA produca ms ADA que las clulas normales. Los investigadores calculan que se necesitan ms de 4x10e8 fibroblastos tratados genticamente para producir efecto teraputico en pacientes. Una cuestin importante sera conocer si los fibroblastos de la piel podran sintetizar y secretar gran cantidad de una protena que no es un producto normal de esa clula. Por ejemplo, podra un fibroblasto de la piel tratado genticamente ser usado para producir el factor IX en pacientes con hemofilia B? Los fibroblastos humanos son infectados in vitro por un vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un ADNc del factor IX dirigida por un promotor intensificador

de un citomegalovirus. Por radioinmunoensayo se determin que estas clulas infectadas producan gran cantidad de factor IX. Este factor IX es completamente funcional e indistinguible del factor IX original del plasma. Como conclusin, los ltimos avances a la hora de perfeccionar las tcnicas tanto en el cultivo de clulas de la piel como de producir vectores estables y fiables para expresar e introducir informacin gentica en estas clulas, unidos a la relativa facilidad con que estos cultivos son transplantados , hacen suponer que, en aos venideros, la piel ser uno de los primeros y ms atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante terapia gnica, contribuyendo as a la revolucin de los mtodos teraputicos que esta nueva disciplina, sin duda, introducir en la Medicina. 5.3 Terapia gnica aplicada a hepatocitos Otro tejido diana para la terapia gnica es el hgado . Un gran nmero de enfermedades metablicas hereditarias afectan al hgado, y el transplante de hgado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas tcnicas se han desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos. Ejemplos de la utilizacin de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por terapia gnica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la lipoprotena de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son homocigticos para la mutacin del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque al corazn antes de los 20 aos. En este experimento los vectores retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan para infectar cultivos de hepatocitos. Se obtenan lneas celulares que eran capaces de degradar las lipoprotenas de baja densidad a un nivel ms o menos normal. Hasta ahora este experimento slo se ha utilizado en cultivos celulares , aunque es uno de los ms seguros a probar en individuos. Un experimento que se quiere hacer en humanos y que ahora slo se hace en ratones es transferir los genes alfa-1 antitripsina humanos (hAAT) y el gen beta-galactosidasa de E. coli a hepatocitos. 5.4 Linfocitos modificados genticamente Un sistema de entrega a clulas de melanomas malignos est siendo utilizada en experimentos clnicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores slidos y que pueden matar clulas tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-2),que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producan la regresin del melanoma. Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento en clulas humanas genticamente

modificadas se utiliz un vector retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina. Antes de que los experimentos clnicos comenzaran, se ha visto que los TILs eran eficientes y establemente infectadas con un vector, que eran muy resistentes al G418 y de que la integracin retroviral no alteraba la caracterstica de crecimiento de las clulas. Cinco pacientes fueron tratados con estos TILs. Se le retir al tumor a cada paciente y los TILs se hicieron crecer en un cultivo con interleuquina-2 . Las clulas infectadas con un vector retroviral en los que los genes gag, pol y env fueron sustituidos por el gen para la resistencia a la neomicina. El porcentaje de las clulas en las que el neogn se haba integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes recibieron al menos 10e11 TILs que procedan de sus propios tumores. Muestras de sangre tomadas en das siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio que los TILs modificados genticamente que contenan el neogn estaban presentes en tres pacientes. Sesenta das despus slo se detectaba en dos pacientes. An as, se encontraron clulas que contenan el neogn en muestras de tejido tumoral, pero no est claro si estas clulas tomaron este neogn por suerte o por transferencia de un vector. La conclusin que se sac, es que los TILs son tiles para tratar clulas tumorales, pero todava no se ha comprobado el rendimiento que puede sacarse de esta facultad ya que los resultados son contradictorios segn diferentes pruebas. 5.5 Utilizacin de clulas hematopoyticas en la expresin de clulas en animales De la misma manera que el retrovirus acta como un vector para transportar un gen a una clula, la clula puede ser considerada como un vector en el siguiente paso del proceso, que es transportar el gen al cuerpo del paciente. Qu requisitos deben cumplir estas clulas? Deben ser fciles de obtener, crecer bien en cultivo y de soportar la infeccin retroviral. Despus de la infeccin, la clula vector debera ser fcil de devolver al paciente y debera continuar viva por varios meses, preferentemente por el bien del paciente. Las clulas de la mdula poseen algunas de estas caractersticas. La mdula contiene clulas stem que pueden dar lugar a todas las clulas de la serie hematopoytica. La infeccin de estas clulas stem hace que aparezcan diversas que contengan el gen teraputico. Tambin se han utilizado las clulas de la mdula para tratar enfermedades hematopoyticas, en otras palabras, las tcnicas para reconstruir la mdula de los pacientes se est trabajando intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de usar clulas de la mdula como vectores celulares, es que tienen dificultad de producir altos niveles de expresin del gen introducido. En uno de los experimentos, el gen intacto de la beta-globina humana con secuencias adyacentes en 3' y 5' son usadas en la construccin de retrovirus. El retrovirus que lleva el gen de la beta-globina se inyectaba en las clulas de la mdula y posteriormente se vio que eritrocitos que procedan de estas clulas medulares llevaban beta-globina funcional. 5.6 Deficiencia de adenosina desaminasa (inmuno deficiencia combinada grave)

Se debe a un trastorno autosmico recesivo. Su deficiencia origina una disfuncin intensa en las clulas T y B , que provoca la muerte de los pacientes antes de los dos aos de edad por infeccin masiva. Se comenz a estudiar su tratamiento por terapia gnica en 1.990 para una mutacin en el gen adenosina desaminasa. Los nios aquejados de este mal eran incapaces de iniciar una respuesta inmunitaria ante las infecciones y estaban abocados a una vida muy limitada, ( "nios burbuja"). Sin una especial atencin moran irremediablemente. Dos nios de cuatro y nueve aos con deficiencia de ADA estn recibiendo terapia gnica. De los nios se aslan linfocitos T, a los que se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son devueltos a los pacientes. Los nios han estado recibiendo clulas con genes corregidos cada uno o dos meses durante un ao y estos nios mostraron mejoras clnicas significativas. Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decrecin del nmero de infecciones. El nio de menor edad, que ha sido tratado por ms tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy esperanzadores, y si la terapia gnica en clulas stem de la mdula avanza, no ser necesario un injerto continuo de clulas modificadas. Actualmente, el tratamiento preferido es el transplante de mdula sea de un donante HLA idntico, que puede producir una curacin completa aunque conlleva una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano HLA idntico. La sustitucin enzimtica no consigue una restitucin completa y produce otros efectos txicos. Un tratamiento sustitutorio consiste en inyectar el enzima ADA combinada con polietilenglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante. Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace ya ms de cuatro aos ensayos clnicos de transferencia gnica de ADA hacia los linfocitos T perifricos, previamente tratados in vitro. Aunque algunos pacientes experimentaron una notable mejora clnica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los ndices de la funcin inmunitaria. En opinin de algunos, ni en este pionero ensayo ni en otros existen evidencias inequvocas de que el tratamiento gentico ha producido beneficios teraputicos . Los riesgos de posible mutagnesis insertiva de genes relacionados con el cncer, despus de repetidas transferencias retrovirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clnicos en Italia y Pases Bajos. Segn sus autores, en uno de estos ltimos ensayos la transferencia gentica haba funcionado y se haba conseguido la reconstitucin inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo tambin inyecciones rutinarias de ADA sinttica, y estos tratamientos convencionales podran ser responsables en buena parte de su buena salud. 5.7 Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia muscular Duchene

Los mioblastos son las clulas stem del msculo esqueltico. Durante el desarrollo, los mioblastos se fusionan para formar fibras musculares multinucleadas. Un pequeo nmero de mioblastos no se fusionan y forman clulas individuales, llamadas clulas satlite, que se sitan entre las membranas de las fibras musculares y de la matriz extracelular que cubre las fibras musculares. Las clulas satlite poseen la habilidad de fusionarse con otras clulas satlite y fibras musculares para tomar parte en la regeneracin muscular. Los mioblastos se convierten as en las clulas vector ideal para transportar genes a las fibras musculares. Un obstculo en la terapia gnica de la DMD es que el gen y su ADNc son muy grandes. Esto se ha conseguido superar por la construccin con un ADNc completo para la distrofina, que se puede expresar en clulas. Dos ADNc bibliteca ( A y B ) fueron construidos en los cuales la reversotranscriptasa fue directamente a comenzar la sntesis de las primeras cadenas de ADN en dos puntos del ARN mensajero de la distrofina. Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers que hibridaban por la mitad (biblioteca A) o con el extremo 3' (biblioteca B) del ARN mensajero. Estos clones contenan 78Kb. del extremo 5' del gen y 8 Kb. fueron aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B respectivamente. Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a una porcin de un sitio de restriccin para dar un ADNc completo. Esto se clon en un vector SV40 y se transfect por electroporacin en clulas COS. Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se produca una molcula correcta de distrofina en las clulas COS, y estudios inmunofluorescentes demostraron que se localizaba en la membrana celular. Aunque estos experimentos demuestran que genes grandes como el de la distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero puede pasar mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener aplicaciones clnicas. 5.8 Terapia gnica en la cura del cncer El diagnstico del cncer a nivel molecular permitir un pronstico ms preciso; pero an podemos llegar ms lejos utilizando una terapia gnica que tiene como finalidad la destruccin selectiva de la clula tumoral. La prdida del oncosupresor p53 puede ser corregida introduciendo una copia sana en la clula neoplsica; la sobreexpresin del oncogn k-ras tambin puede suprimirse introduciendo el gen k-ras antisentido que inactive su expresin o bloquee sus ARNs. Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un tumor ya que infectarn e insertarn su ADNc en clulas en divisin; los adenovirus, aunque no integren en el husped pueden permanecer activos el tiempo suficiente para destruir el tumor. Tambin es posible introducir en el tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2) , que potencialmente protege de distintos tipos de cncer y de sus recidivas. Las inmunotoxinas son el resultado de acoplamiento de toxinas muy letales (como la diftrica o la ricina) a anticuerpos monoclonales especficos de carcinomas, constituyendo las denominadas bombas biolgicas, puesto que son como proyectiles letales dirigidos contra clulas tumorales. Por ltimo , la terapia gnica permite elaborar

vacunas a partir de las propias clulas tumorales de un paciente por manipulacin ex vivo y reinsercin en el organismo de partida. Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia gnica en el hombre, se puede considerar el cncer como el rea ms importante y de ms rpida expansin. 5.8.1 Sustitucin de oncosupresores defectuosos por ingeniera gentica Las propiedades neoplsicas de numerosos cultivos celulares pueden revertirse con frecuencia, al insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden ser rb, dcc o p53. Es muy posible que la introduccin de p53 en un tumor que carezca de la funcin de este gen, pueda restaurar la normalidad tisular. Se estn realizando ensayos clnicos en los que se depositan broncoscpicamente en las inmediaciones de un tumor de pulmn , retrovirus que llevan una copia intacta de p53. La eficacia de esta terapia se ver incrementada si en vez de hacer llegar al tumor un nico oncosupresor, se elaboraran "lotes gnicos" de varios oncogenes y oncosupresores que simultneamente corrijan las alteraciones acumuladas en las clulas del tumor. Un nico vector que porte varios oncogenes/oncosupresores o una mezcla de vectores que contenga cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores son las dos modalidades con las que se especula en la actualidad. 5.8.2 Inhibicin molecular de la expresin de oncogenes Tanto los tumores slidos como las leucemias y linfomas exhiben activacin mutacional o sobreexpresin de oncogenes u oncosupresores mutados ; la malignidad de las clulas podra desaparecer impidiendo la expresin de los oncogenes y oncosupresores por administracin de pequeos oligodesoxinucletidos complementarios a los ARNs mensajeros y ADNs correspondientes. Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de tratamiento difiere sustancialmente de las terapias genticas tradicionales. En la mayora de los tratamientos genticos, se suministran genes enteros y sanso para sustituir las versiones que faltan o que son defectuosas e incapaces de dirigir la sntesis de una protena necesaria. Los oligonucletidos no pueden producir protenas. Su virtud radica en la capacidad para bloquear la expresin de genes existentes. Los oligonucletidos antisentido son la primera de las nuevas medicinas genticas que han llegado a la etapa de ensayo clnico. De su potencialidad teraputica se sospech ya a principios de los 80, cuando se descubri que ciertos microbios, adems de fabricar ARNs mensajeros, tambin producan de forma natural ARN antisentido. La explicacin ms lgica para este comportamiento pareca ser que el organismo utilizaba las molculas antisentido como forma de regular la expresin gnica. Si el ARN antisentido se empareja con su molcula complementaria de ARN mensajero, cabe pensar que bloquear la maquinaria celular encargada de traducir en protenas la cadena con sentido.

Las clulas vegetales y animales emplean a veces la estrategia antisentido para controlar la expresin gnica. Con la ayuda de las tcnicas del ADN recombinante crearon genes que producan versiones antisentido de ciertos ARN mensajeros seleccionados. Cuando se introducan esos genes en las clulas se comprobaba que, en efecto, ocasionalmente se consegua disminuir la produccin de la protena cifrada por la cadena de ARN que era blanco del antisentido. Los resultados sugeran la posibilidad de disear molculas antisentido que funcionasen a la manera de drogas e impidiesen selectivamente la traduccin. Sin embargo, para utilizarlas como tales drogas, haba que enviarlas al interior de las clulas del cuerpo, y hacerlo de una forma fcil y eficaz. En la mayora de los casos, lo mejor sera administrar pequeos fragmentos de antisentido sintticos, en vez de genes enteros. La construccin del primer oligmero surgi en 1.978, reconoca el ARN mensajero del virus del sarcoma de Rous y disminua su replicacin en la clula lo que indicaba que haba bloqueado la produccin de protenas vricas. Dos consideraciones a la hora de fabricar un oligonucletido son: primero, los oligonucletidos sin modificar portan una carga negativa en la cadena del grupo fosfato. Las molculas dotadas de carga suelen tener dificultades para atravesar las membranas celulares, que no estn cargadas. La mayora de los investigadores daban por supuesto que los oligmeros con muchas cargas seran incapaces de entrar eficazmente en las clulas. En segundo lugar, las clulas poseen numerosas enzimas que degradan el ADN forneo. Caba pensar entonces en una pronta degradacin de los oligmeros que consiguiesen entrar en las clulas. Para ello reemplazaron un tomo de oxgeno de cada grupo fosfato por un grupo metilo (-CH3 ). Convertan as los fosfatos cargados negativamente en unidades sin carga: los metilfosfonatos. De esa manera los oligonucletidos entraban mejor en las clulas y resistan el ataque enzimtico. Pero al eliminar las cargas, los oligmeros se volvan hidrofbicos y se hacan insolubles en soluciones acuosas, esta falta de solubilidad puede dificultar la produccin en masa. Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar un tomo de oxgeno de los grupos fosfato por un tomo de azufre cargado negativamente. Estos oligmeros fosfotiolados son conocidos como oligos S, que son solubles en agua, fciles de producir y resistentes a la degradacin enzimtica. Los oligonucletidos antisentido pueden bloquear la traduccin al menos de dos maneras. Obstaculizan la "lectura" normal del ARN con sentido y, adems, al unirse al ARN mensajero estimulan a una enzima (ribonucleasa H) que corta, y por tanto destruye, al ARN mensajero que participa en la unin. Los oligonucletidos son muy caros y la estabilidad de los compuestos debe mejorarse. Habr que elaborar mtodos ms idneos para introducirlos en las clulas en las cantidades adecuadas.

Una nueva estrategia gentica est basada en los llamados trplices, que son oligonucletidos sintticos que actan igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda se acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la forma B del ADN. Hoy sabemos que los oligonucletidos suelen unirse a una de las cadenas de la doble hlice, y slo a las bases pricas de esa cadena mediante uniones de tipo Hoogsteen. As, los oligonucletidos son capaces de unirse a la regin de control del gen diana, para impedir que los factores de transcripcin iniciasen dicho proceso. Hasta el momento in vitro, han tenido xito oligonucletidos contra ras, p53, myc, myb, bcr-abl, bcl-2 y contra el factor de crecimiento semejante a la insulina. Se encuentran en fase clnica la utilizacin de oligonucletidos contra el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En la fase preclnica, se introdujeron in vitro molculas de ARN antisentido en clulas tumorales procedentes de un glioblastoma de rata, estas clulas se inyectaron en ratas genticamente idnticas con tumores cerebrales. Los tumores desaparecieron incluso en ratas con tumores extendidos a otras partes del cuerpo. Las clulas introducidas desencadenaron una respuesta inmunolgica estimulando clulas T citotxicas que erradicaron el tumor o los tumores a la vez que protegieron al organismo de la aparicin de nuevos microtumores. En las pruebas clnicas, son clulas del propio paciente las que se modifican ex vivo con la introduccin del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en vez de ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque los hbridos ARN-ARN son ms estables que los ADN-ARN. La inhibicin de la expresin del oncogn ras se puede conseguir in vitro con la insercin en la clulas tumorales de genes que transcriban un ARN mensajero antisentido, complementario al ARN mensajero normal del oncogn ras. Estos antigenes eliminan especficamente la produccin del producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por hibridar con l, impidiendo as que sean sustrato de traduccin por los ribosomas celulares. El mayor problema de esta terapia gnica es asegurarse de que todas las clulas tumorales reciben el oligonucletido antisentido, ya que cualquiera que escape tendr una ventaja proliferativa sobre las otras y prevalecer induciendo de nuevo el tumor. El segundo mtodo de bloqueo del oncogn ras acta a nivel de protena. La protena Ras ocupa una posicin importantsima en la transmisin deseales para que la clula responda a los factores de crecimiento. Las mutaciones Ras producen una transmisin continua de seales de proliferacin independientemente de la presencia de los factores estimulantes. Tanto la protena Ras normal como la mutada precisan de una transformacin o maduracin que las convierta en protenas biolgicamente activas y esta modificacin consiste en una farnesilacin, es decir, la adquisicin de un grupo farnesil que permitir a la protena anclarse en su lugar habitual de la membrana celular, desde donde transmite la seal de proliferacin. La farnesil transferasa es la enzima que normalmente facilita el grupo farnesil; as, inhibidores de la enzima impedirn que Ras adquiera su forma biolgicamente activa.

El compuesto CBBX (cistena, 2 Benzodiacepinas y un aminocido variable) es muy buen inhibidor de la farnesil transferasa y parece inocuo para las clulas. Clulas transformadas en cancerosas por haberles introducido un gen ras mutado, se incubaron en presencia del compuesto CBBX, impidindose de modo muy eficiente la farnesilacin y observndose un crecimiento tpico de clulas normales no cancerosas. La inhibicin no ha de ser total puesto que las clulas necesitan una cierta cantidad de Ras para funcionar correctamente; adems hay otras protenas que han de farnesilarse para adquirir su capacidad funcional. Es necesario controlar muy bien las dosis para que se inhiba la enzima lo suficiente para impedir un crecimiento incontrolado, pero permitiendo el resto de las funciones de la clula. La inhibicin de oncogenes en clulas tumorales in vitro es un requisito imprescindible para su utilizacin in vivo. En animales de experimentacin (ratas) estas tcnicas han logrado la desaparicin de tumores experimentales sin aparicin de recidivas o secuelas de otro tipo. 5.8.3 Insercin tumoral de vectores suicidas: expresin constitutiva o selectiva Los vectores suicidas que se emplean para erradicar tumores son preferentemente retrovirus defectivos en los que los genes propios del virus ( gag, pol y env) han sido sustituidos por un gen de seleccin (neo) y por otro gen capaz de inducir su propia muerte. Un ejemplo de gen suicida es el gen de la timidina quinasa (tk) del Herpes simplex (HS), que al expresarse en la clula tumoral confiere sensibilidad al antibitico antiherptico ganciclovir. La quinasa del Herpes no es tan estricta como su homloga celular y fosforila anlogos de la guanina (ganciclovir o aciclovir), que pueden as ser insertados e incorporados en la molcula del ADN paralizando la replicacin y provocando la muerte celular. Solamente aquellas clulas que hayan adquirido la quinasa del Herpes incorporarn clulas en divisin, caracterstica diferencial de las clulas tumorales que se desarrollan en tejidos especializados, las cuales normalmente ya no se dividen. El cerebro adulto es uno de los rganos en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. El sistema se ha puesto a punto en la rata, donde pueden ser inducidos tumores cerebrales malignos por inyeccin directa de clulas neoplsicas. Los retrovirus portadores del gen tk del HS se introdujeron en las clulas murinas empaquetadoras que poseen en su genoma un retrovirus defectivo. Este retrovirus defectivo es poseedor de los genes que se eliminaron del retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ), pero carece de una regin imprescindible para el empaquetamiento de la partcula; estas clulas murinas se convierten entonces en fbricas de retrovirus teraputicos y se denominan clulas productoras. La introduccin en el seno de un tumor cerebral de clulas productoras origina un gran nmero de retrovirus que infectarn lgicamente las clulas prximas del tumor. Al cabo de unos das, en los que cada vez ms clulas tumorales adquieren el retrovirus teraputico, se inicia el tratamiento de la rata con el ganciclovir, que , efectivamente es capaz de provocar el suicidio de todas las clulas tumorales . En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales malignos por terapia gnica con retrovirus portadores del gen tk del Herpes, se encuentra en la actualidad en fase de

ensayos clnicos; el tratamiento del enfermo con ganciclovir produce en algunos casos la disminucin del tumor tratado. Tratamientos similares se estn aplicando tambin a otros tipos de tumores, como melanomas cutneos o cnceres de ovario. Una variante ms verstil y selectiva se podra conseguir aadiendo al gen suicida un promotor de clulas tumorales. Se conocen algunos genes que se expresan preferentemente en determinados tumores, en muchos de estos casos se han aislados los promotores y se han acoplado enzimas que confieren un efecto suicida. Un promotor especfico de un tipo de tumores impedira que la enzima suicida se expresara en cualquier otra clula distinta a la neoplsica, aunque pudiera ser infectada por el retrovirus teraputico por encontrarse en fase proliferativa. Se prevee su uso clnico en un futuro prximo para hepatomas, melanomas, cnceres de mama y cnceres de pncreas. 5.8.4 Inmunotoxinas para combatir el cncer Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales surgi la idea de elaborar inmunotoxinas para el tratamiento del cncer acoplando anticuerpos tumorales especficos a toxinas mortales. Estas inmunotoxinas se uniran y mataran clulas neoplsicas. Se les denomin bombas biolgicas o balas mgicas, ya que funcionan como proyectiles dirigidos para hacer blanco en clulas cancerosas. Problemas de toxicidad en las aplicaciones teraputicas pusieron de relieve que simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se curara el cncer. Aunque no se han resuelto todos los problemas originales, se puede decir que las inmunotoxinas actuales estn muy mejoradas y ya se estn realizando ensayos clnicos que permitiran muy pronto evaluar el alcance de esta tecnologa en la cura del cncer. Para eliminar un cncer humano todas las clulas neoplsicas deben quedar expuestas a suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su destruccin sin causar daos adicionalesen las clulas normales. Esto requiere una alta especificidad, estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la clula diana y efecto celular letal. La estructura de la inmunotoxina empez siendo la inmunoglobulina G (Ig G) completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en el interior de la clula el puente disulfuro se reduce liberando la toxina. Un paso adelante lo constituy la sustitucin de toda la molcula de Ig G por una parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas, como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos heterodmeros (Fab')2 y Fab' unidos entre s por puentes disulfuro. Cada dmero est formado por una cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente disulfuro por la parte constante. Los fragmentos Fab' se pueden unir directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados como consecuencia de la reduccin de (Fab')2. La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera es su menor tamao, lo cual facilita notablemente la penetracin en la clula. Los conjugados toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniera gentica fusionando a nivel de ADN las regiones que codifican por cada parte, o bien por medio de un enlace qumico que una las dos partes in vitro.

Las partes variables de Fab', unidas por un puente disulfuro y que constituyen las FvTx. Slo se pueden obtener por ingeniera gentica fusionando a nivel de ADN las regiones codificantes correspondientes, pero son algo inestables. La inclusin de un pptido de conexin estabilizador en las molculas recombinantes (Fv cs-Tx) ha solucionado este problema. La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son ms especficos que los polivalentes, por estar dirigidos contra una pequea parte especfica de la protena (epitopo) y no contra su totalidad. Los anticuerpos deberan estar dirigidos contra las partes especficas de las protenas que estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los anticuerpos autnticamente especficos de carcinomas deberan reconocer las formas mutadas de las molculas que controlan el crecimiento celular pero en sus versiones normales. En la mayora de los casos no se consigue una especificidad tan precisa y la mejor aproximacin son los anticuerpos cuasi-especficos que reaccionan con antgenos que se expresan predominantemente en determinados carcinomas y muy poco en las clulas normales. Otros requisitos para que la inmunotoxina sea eficiente son :

Que el antgeno est en la superficie de la clula , de ah que se utilicen receptores o carbohidratos de membrana. Que el complejo antgeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma celular por endocitosis.

Las toxinas que ms se utilizan son la ricina, la toxina diftrica y la exotoxina de Pseudomonas. Las tres matan la clula inhibiendo la sntesis de protenas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes, necesitndose muy pocas molculas para inactivar todos los ribosomas celulares. Sus genes han sido clonados, caracterizados y parcialmente alterados para mejorar sus propiedades txicas. El mayor inconveniente de las toxinas es que pueden reaccionar indiscriminadamente con cualquier clula causando toxicidad inespecfica. Se han conseguido delecciones gnicas que eliminan una pequea regin de ADN responsable de la interaccin toxina-clula; ello disminuye notablemente la toxicidad inespecfica evitando que toxinas conjugadas o aisladas, puedan causar la muerte de otros tipos celulares. El efecto antitumoral de la toxina es mucho ms rpido ( unos siete das ) que el desarrollo de una respuesta inmunolgica seria. An no disponemos de la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las clulas tumorales sin producir efectos ms o menos deletreos en el resto del organismo. La causa principal de estos decepcionantes resultados es que las inmunotoxinas no llegan realmente a todas las clulas tumorales, particularmente en los tumores slidos. Los motivos de esta inaccesibilidad son varios: poca vascularizacin del tumor, una gran presin del fluido intersticial en los ndulos tumorales, presencia de membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y ocultamiento de los posibles antgenos antitumorales que deberan exhibirse en las membranas de las clulas neoplsicas. Todo esto contribuye a que la efectividad de las inmunotoxinas no haya alcanzado an las espectativas esperadas.

5.8.5 Incremento de la inmunogenicidad tumoral y vacunas contra el cncer Ciertas molculas producidas en la clula tumoral pueden convertirse en antgenos de rechazo. Las clulas tumorales producen al menos dos tipos de antgenos que pueden ser reconocidos por las clulas T citotxicas: Los productos de los oncogenes, es decir, protenas aberrantes distintas a las originadas por los protooncogenes y exclusivas de clulas tumorales. Antgenos tumorales formados por los productos de genes embrionarios que no se expresan en las clulas normales de adultos. Claramente la habilidad para crear respuestas contra antgenos propios especficos de tejido puede ser de gran utilidad para el tratamiento de cnceres derivados de rganos no esenciales como la prstata, pero por otra parte los antgenos especficos de tejido pueden crear problemas de autoinmunidad, que deben ser superados. Recientemente se han utilizado vacunas tumorales para el tratamiento de pacientes con tumores slidos. Las estrategias empleadas han sido variadas y los resultados inconsistentes. Sistemticamente clulas tumorales irradiadas se mezclaban con diversos coadyuvantes, como el bacilo de Calmette-Guern, para estimular la respuesta inmunolgica. La inclusin de coadyuvantes no pareci incrementar la accin mediada por las clulas T, pero en algunos casos las clulas tumorales irradiadas mostraron un rechazo inmunolgico. Desgraciadamente, en la mayora de los casos la magnitud de la respuesta fue pequea, y no se consigui erradicar tumores ya establecidos. 5.8.6 Perspectivas de la terapia gnica y molecular Todos los tratamientos de terapia gnica que se han descrito estn ms indicados para cnceres de tipo metasttico que primario; dado que an hoy no se conoce el alcance de la curacin, es preferible que los pacientes hayan agotado otros mtodos de curacin y que los riesgos de la terapia gnica sean menores de los derivados de la evolucin de la propia enfermedad. Hay muchos problemas pendientes : cmo transferir de manera estable y eficiente a tumores in vivo; cmo evitar los riesgos de infeccin vrica en pacientes y operadores; cmo generalizar los tratamientos de terapia gnica,... La eficiencia de toda esta tecnologa en la cura de una de las mayores "plagas" de nuestra sociedad es an nfima para el nmero de trastornos que se ocasionan y a su especial rapidez y avance de la enfermedad. La solucin por tanto no es enfocar la respuesta a un nico tratamiento teraputico, sino combinar con diferentes tcnicas (quimioterapia, radioterapia, tratamientos farmacolgicos de ltima generacin, terapia gnica,....) las habilidades de stos, y preparar mediante estudios detallados y especficos la mejor respuesta al caso. As, que an hoy tras dcadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y aunque estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe preguntarnos si ser la respuesta definitiva a tanto tiempo de espera y en muchos casos de impotencia y resignacin. 5.9 Terapia gnica en infeccin por HIV

La terapia gnica para el HIV est destinada a realizar muchos propsitos. Los propsitos son proteger clulas no infectadas residuales y eliminar clulas infectadas. Pero lo que ms se intenta es reducir la infeccin en personas infectadas y evitar la expansin del virus a travs de la poblacin. Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a travs de estos esquemas: 5.9.1 Objetivos potenciales de la terapia gnica para infeccin por el HIV La mayora de los procesos del ciclo viral tiene puntos vulnerables que pueden ser desvaratados con mtodos genticos. Algunos aspectos como son la transcripcin y translacin son llevadas a cabo por la maquinaria de la clula hospedadora es probable que la inhibicin significativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos especficos del virus son utilizados como puntos de arranque: la entrada en la clula, la transcripcin inversa, o la integracin. La interaccin entre los ARN tat y rev con protenas es un punto claramente vulnerable al igual que el empaquetamiento del ARN genmico. 5.9.2 Inmunizacin por protenas del HIV La expresin in vivo de una protena viral puede ser utilizada como una vacuna gentica para atacar al virus. Usando sistemas con virus influenza en modelos animales han demostrado la eficacia de esta vacuna gentica, en la cual una inyeccin directa de ADN plasmdico puro que codifica protenas virales lleva a una expresin persistente de los genes virales. En infeccin por HIV es importante conservar regiones del virus genmico como inmunognico porque el virus posee gran habilidad de mutacin y de evitar respuestas neutralizantes. Se ha visto que en pacientes con SIDA que la evasin de la respuesta inmune contra epitopos especficos de las clulas T citotxicas pueden ocurrir incluso en porciones relativamente conservadas del HIV, como es el gag. La entrega de genes virales junto a genes que codifican molculas inmunoestimulatorias, como la molcula B7/BB1, es otro desarrollo potencial. El pg160, protena precursora de la envuelta expresada en clulas singnicas, est siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares en ratones. Una vez que clulas que desarrollan la inmunidad expresan la protena inmunognica probablemente sern destruidas por contener un virus transcipcionalmente activo. La gran proporcin de clulas infectadas albergando un virus latente persistir y proveer un pozo del que emergern mutantes capaces de evitar la respuesta inmunitaria. Es por esto por lo que la inmunizacin con protenas del HIV sigue siendo muy difcil por no decir casi imposible, al menos con la tecnologa actual. Adems hay que sumar el hecho de que es un virus con una elevada tasa de mutacin, con lo cual la creacin de inmunidad para un tipo de producto gnico puede verse intil si el virus cambia por mutacin. 5.9.3 Inhibicin mediada por interfern

ADNs copia de interferones han sido clonados e insertados en vectores para su expresin constitutiva o inducible en clulas diana. El tratamiento con interfern induce algunas protenas celulares una de las cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interacta con la estructura en bucle del ARN que codifica rev y puede inhibir la expresin de protenas gag-rev dependientes. 5.9.4 Destruccin autoltica de clulas infectadas Se han desarrollado varias estrategias para que clulas infectadas por HIV se autodestruyan. La subunidad A de la toxina diftrica (DT-A) est codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen suicida inducible. Slo una pequea molcula de DT-A puede ser suficiente para matar a una clula. Otros genes letales que se usan incluyen a la timidina quinasa de HSV (tk) , que es inocua al menos que en el medio haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de estos compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como ya dijimos en su aplicacin en el cncer ), la clula muere. Otros resultados prometedores se han obtenido usando in vitro la toxina quimrica CD4 de Pseudomonas que mata clulas que producen el pg120 del virus. Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside en la interaccin tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor muy promiscuo , que es activado por un gran nmero de protenas adems de tat, incluyendo factores transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un control limitado de la expresin del gen suicida inducible por tat, y la destruccin de la clula puede ocurrir bajo otras circunstancias que no sean la infeccin por HIV. 5.9.5 Interferencia directa con procesos virales La interferencia en la replicacin viral se puede hacer por interrupcin de procesos virales como son la entrada en la clula, o ms fcilmente, en la salida, aqu el ADN del provirus no es un objetivo prctico. Para aumentar la posibilidad de inhibicin antes de la integracin del HIV probablemente se necesite la produccin constitutiva de genes antivirales. - La interferencia se puede realizar por varios mtodos . Uno de ellos es la modificacin de la molcula CD4. Bloqueando la molcula CD4 para que el pg120 viral no pueda adsorberse sobre l es una proposicin esperanzadora. In vitro se ha visto tambin que clulas mutantes para el CD4 no reconocen la glicoprotena de la envoltura del HIV por lo que son resistentes ante la infeccin del virus. Otra manera sera inyectar grandes cantidades de CD4 en la sangre, pero se ha visto que la dosis requerida para que sea detectable en el plasma, es ms alta de lo esperada. Otros se realizan utilizando terapia basada en nucletidos, de los que hay tres clases de ARN antivirales y que son: el ARN antisentido, los ribozimas y el ARN decodificante. - El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado por un vector AAV, y produce una reduccin superior al 90% de las replicacin del HIV. Estas molculas antisentido necesitan estar presentes en ms nmero que su secuencia diana, lo que dificulta su produccin y eficacia.

- Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran despus de cada interaccin cataltica no se requieren en gran cantidad. Los ribozimas anti-HIV expresados establemente en clulas HeLa-CD4+ pueden inhibir la replicacin del HIV. Este mismo efecto se produce en blancos que posean la integrasa RT y las regiones tat y env. 5.9.6 Estrategias centradas en protenas Protenas mutantes pueden a veces interferir en la funciones normales. Esto se conoce como fenmeno transdominante negativo , en el que un pequeo nmero de protenas mutantes pueden interferir en los efectos de una gran cantidad de protenas normales. Las protenas ms utilizadas para este experimento son las protenas tat y rev. Tambin se ha visto que en mutantes dominantemente negativos de la protena de la envoltura puede inhibir la produccin de HIV, y mutantes dominantemente negativos en el dominio de unin a CD4 pueden reducir la cantidad de CD4 y disminuir la produccin del virin. 5.9.7 Secuestro en trans de protenas En teora se pueden secuestrar algunas protenas estructurales del virus. El secuestro de una envoltura viral por un CD4 que contiene una seal de retencin del retculo endoplasmtico, se ha podido ver en varios experimentos . Cadenas sencillas de anticuerpos se han desarrollado para secuestrar la protena de envoltura en el retculo endoplasmtico. La co-transfeccin de cadenas sencillas de anticuerpos especficos para pg120, tambin reduce los niveles de partculas HIV infecciosas, sin afectar al nivel de produccin de la protena gag. Estas metodologas son particularmente sensibles al acercamiento de la terapia gnica y parece probable que dentro de los prximos 5-10 aos una combinacin de terapias, incluyendo agentes farmacolgicos y agentes de terapia gnica, puedan ser usados en concierto para minimizar la propagacin del HIV dentro de un individuo afectado y de este modo prolongar su vida libre de enfermedad. Una vacuna basada en la terapia gnica es tambin una seria posibilidad. El HIV por si mismo puede paradjicamente llegar a ser una valiosa arma teraputica y la terapia gnica del SIDA puede llegar a ser el campo pionero para el desarrollo de acercamientos similares a otros agentes infecciosos. VI. TERAPIA GNICA: PERSPECTIVAS FUTURAS Y CONSECUENCIAS 1. Datos econmicos indican que los costes de los primeros aos de transplantes cardiacos son unos 90.000$ por paciente (dlares de 1.983) en los EEUU, sera razonable preguntarse si la terapia gnica ser otra tecnologa cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de mdula sea, en la terapia gnica humana ser trabajada intensamente y supondra unos considerables costes iniciales. Pero an cuando nadie asigna un valor econmico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo ms seguro es que algn da la terapia gnica costar considerablemente menos que la hospitalizacin repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis mstica. En breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad gentica causado por el defecto en

un gen, la terapia gnica se puede convertir en un mtodo de cura bastante costoso. En un futuro ms lejano, las perspectivas para la terapia gnica en humanos todava no estn claras . Pero si se rompiese el eslabn entre el transplante de mdula sea y la terapia gnica, sta se podra aplicar a un crculo de pacientes ms extensos. Por ejemplo, si vectores especficos para un particular tipo de clula diana se pudiera desarrollar, la combinacin vector/gen, quiz pueda ser administrada de forma intravenosa. A este nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina estar en el umbral de una nueva era para el tratamiento de ms de 3.000 desrdenes genticos que afecten a nuestra especie. 2. CUESTIONES ECONMICAS El rango potencial y la versatilidad de la terapia gnica han sido perfilados en puntos anteriores de este trabajo. Esta es una nueva forma de intervencin teraputica a un nivel molecular, con aplicaciones en muchas reas del tratamiento mdico que engloba desde la correccin de un locus individual de un defecto gnico heredado por inmunizacin, tratamiento de enfermedades infecciosas hasta el cncer. Esta es tambin una nueva farmacologa. Mientras muchos frmacos corrientes persiguen modificar procesos endgenos por la aplicacin de novedosos, compuestos artificiales, la terapia gnica reparte un agente biolgicamente activo muy especfico a un sitio determinado y a la vez con la posibilidad de permanentes, transitorios o inducibles estados de la expresin. Como un nuevo frmaco debe ser testado en el contexto de la herencia. La heredabilidad requiere dos funciones: primero, la transmisin de la informacin de generacin en generacin, y segunda, la expresin de la herencia. Transmisin y expresin estn separadas a nivel molecular, y , en organismos multicelulares, a nivel celular. La determinacin celular va seguida por la diferenciacin en un estado temprano que separa irreversiblemente el linaje somtico de los portadores potenciales de informacin a la siguiente generacin: las clulas de la lnea germinal. La expresin del gen teraputico puede ser afectada transitoriamente por el uso de vectores que no se integran o por clulas diana con una vida biolgica limitada. Si, como es normal, la expresin es requerida a largo plazo, deberemos usar vectores que se integren o autoreplicativos. Estos son ms difciles de distribuir y controlar. El material gentico en un cromosoma est influido directamente por partes del genoma cercanas y distantes que actan en cis y trans. Esto no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con la transferencia gnica como prctica corriente es la expresin a largo plazo del gen transducido cuando la

transferencia se produce en secuencias mnimamente contextuales. La familia del gen de la globina lo ilustra bastante bien. El control de la expresin depende de cuatro regiones distantes aguas arriba reconocidas por su hipersensibilidad ADNasa I y se les llam regiones para el control del locus (LCRs). An con estas regiones incluidas la transferencia del gen de la globina era imprescindible ya que se poda reorganizar de diferentes maneras. Cmo podemos solventar este problema? En principio se comenz a "limpiar" la construccin de motivos de interferencia extraos por escaneo de las secuencias del vector que actuaban como seales cis, las cuales podran ser las responsables de las distintas formas de reorganizar, y se intent posteriormente eliminarlos sistemticamente por deleccin o por mutacin puntual dirigida. La sustitucin por un gen anormal o no funcional por recombinacin homloga es una segunda posibilidad, y tericamente, la forma ideal de terapia gnica. Hasta ahora esto se ha ido practicando sucesivamente en lneas celulares o en clulas stem embrionarias de animales. La confianza que nos proporciona los procesos celulares endgenos para la recombinacin son insatisfactoriamente bajos. Sin embargo, desde hace aos se conocen enzimas que catalizan la escisin e insercin de material gentico por reconocimiento de una secuencia nucleotdica particular, esto es lo que se est usando en la transferencia de genes eucariticos. El sistema mejor conocido es el sistema cre/loxP de los bacterifagos. La enzima cre reconoce una secuencia oligonucleotdica particular y corta una pieza de material gentico existente entre dos de esas secuencias, y despus ligar los extremos del material gentico cortado. Las secuencias que cortan las enzimas se llaman loxP. Introduciendo sitios loxP se crean sitios de insercin y delecciones especficas en clulas stem embrionarias. Una tercera posibilidad es intentar transferir una unidad gentica grande que contenga el gen y todo la unidad llevar asociada regiones de control junto a genes accesorios en un formato auto replicativo. A esto se le llama cromosoma artificial , y que nos supera las limitaciones en el tamao del ADN que puede ser transportado a base de vector. Esto se ha demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de levadura) para crear ratones transgnicos. Los cromosomas artificiales tambin evitan los problemas en el control del sitio de integracin del ADN exgeno. Los centrmeros y telmeros de levadura parece que no son funcionales en clulas de mamferos por lo que el objetivo ms corriente sera la produccin de vectores de cromosomas artificiales que lleven los centrmeros y telmeros que combinen la habilidad de transportar grandes piezas de ADN (varios cientos de kilobases), con la capacidad de segregacin con un cromosoma independiente en sincrona con el genoma del hospedador en la clula en divisin. Por ltimo, varios sistemas estn siendo explorados para el reparto de hormonas, factores de coagulacin, anticoagulantes, y otros agentes teraputicos. Cuando sus genes estn introducidos dentro de fibroblastos o clulas del endotelio

vascular, sus productos pueden ser detectados en sangre durante diversos perodos de tiempo. Estudios recientes en ratones sugieren que mioblastos pueden ser particularmente ventajosos como clulas diana para el reparto de protenas recombinantes. Transferencia gnica in vitro seguida por el reinjerto de las clulas est siendo explorado para restaurar funciones de enfermedades crnicas del sistema nervioso. Si se consigue probar como efectivo tales tcnicas de implantacin combinadas con los genes transfectados podran ofrecer un nuevo camino de tratamiento para desrdenes crnicos tales como el Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. En otoo de 1.998, French Anderson uno de los pioneros de la terapia gnica propuso una solicitud de aprobacin de un protocolo para el estudio de la terapia gnica in tero. Anderson se propone tratar dos enfermedades genticas muy graves; la alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un defecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial, el del enzima adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar el metido en fetos portadores de estas anomalas genticas, cuyas madres hayan decidido abortar. Slo despus de la interrupcin del embarazo podrn los investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todava se necesitarn de dos a tres aos de trabajo en vectores y de ensayos en el animal para que estos proyectos sean tcnicamente aceptables. Si la terapia gnica in tero se revela eficaz, el principal problema tico que, con el tiempo, suscitar este tipo de intervencin en el feto ser el riesgo de modificacin de las clulas del grupo germinal, precursoras de las clulas sexuales y, por tanto, del patrimonio gentico que se transmite a la descendencia. Ahora bien, la prohibicin de la terapia goza de consenso. El proyecto de convencin de biotica del Consejo de Europa, por ejemplo, excluye tal posibilidad. Incluso del RAC (Recombinant Advisory Committee), rgano del National Institutes of Health (NIH). 3. PERSPECTIVAS FUTURAS 4. CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GNICA La modificacin del material gentico de una clula afecta tanto a la clula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que disea deliberadamente cambios genticos que son potencialmente propagables. Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genticas de la lnea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero, cules son estos riesgos? 6.3.1 MUTAGNESIS Todas las integraciones cromosmicas, aparte de los cambios homlogos, poseen el potencial de alteracin de locis endgenos fortuitos y por lo tanto producir mutagnesis, que puede derivar en oncognesis.

Si realizamos la terapia gnica en clulas somticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas clulas somticas a las futuras generaciones pero alteramos la lnea gentica del individuo. La intervencin directa en las clulas somticas difiere del tratamiento mdico convencional slo en que aqu hay una clara y directa conexin entre la terapia y la seleccin gentica. En el caso de sndromes causados por locis dominantes el conjunto completo de genes est representado por los individuos afectados. Su xito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamao de este conjunto en la siguiente generacin. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la frecuencia del gen en la poblacin est mantenida por que ocurran nuevas mutaciones. En las enfermedades genticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el nmero de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se vern afectados) la influencia del xito de la terapia en la frecuencia gnica ser tambin mayor. La modificacin deliberada de la lnea germinal tendra efecto sobre la estructura de la poblacin slo por una transformacin gentica a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sera la introduccin de resistencia a una enfermedad patgena. Si slo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podra existir la posibilidad de un gran cambio gentico en la poblacin Sera la terapia gnica en la lnea germinal realmente necesaria? La terapia gnica somtica, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformacin gnica de la lnea germinal puede slo tener efectos sobre la descendencia an no nacida. Esto por lo tanto no afectar al paciente que est siendo tratado. Con las posibilidades de investigacin de prenatales de la preimplantacin tanto como de la donacin de esperma y vulos y adopcin es muy difcil ver como la intervencin deliberada en la lnea germinal puede ser ticamente justificable. No obstante esta idea ser ms profundizada en el siguiente apartado, sobre la tica en la terapia gnica.