UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Departamento de Ciencia y Tecnologa Bioprocesos II 2005 Segundo semestre

TRABAJO PRACTICO BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS

Introduccin
El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransfonnaciones es un rea de la Biotecnologa en continua expansin. Un aspecto clave del proceso es el uso del catalizador (clula o enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo dando como resultado una disminucin de los costos del proceso y otras ventajas como una mayor pureza del producto, mayor productividad etc. Tambin se puede pensar en la reutilizacin del biocatalizador en procesos batch. Para lograr este objetivo los biocatalizadores se inmovilizan. La definicin de la European Federation of Biotechnology (1983) aclara el concepto. "Los biocatalizadores inmovilizados son enzimas, clulas u organelos (o combinacin de ellos) confinados o localizados en cierta regin definida del espacio, con retencin de su actividad cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo repetido y continuo. Es necesario analizar tres de los conceptos incluidos en la definicin: Confinados o localizados": para cumplir con esta condicin es necesario formar una fase slida dispersa, macroscpica, de alta densidad y catalticamente activa, dentro de, o en contacto con, un medio reactivo lquido libre de biocatalizador. Se dice que el biocatalizador est compartimentalizado. Las caractersticas de la fase slida son tales que el transporte de reactivos hacia y desde el biocatalizador est gobernado por difsin exclusivamente. Por la resistencia al transporte difusional se establecen en la partcula gradientes de concentracin o de pH, con lo que el ambiente que rodea a la partcula de biocatalizador inmovilizado difiere grandemente del seno de la fase lquida. retencin de la actividad cataltica (y viabilidad)": los tratamientos a los que son sometidas t nto las clulas como las enzimas libres que sern inmovilizadas afectan en cierto a grado la actividad. Si bien es deseable, no es necesario que se retenga el 100% de la actividad del biocatalizador libre, pero, para mantener la rentabilidad del proceso, debe alcanzarse un valor que no debe ser menor al 25%. En el caso de clulas puede ser necesario mantener la viabilidad. La inmovilizacin, entonces, debe tratar de ser realizada en condiciones tales que la prdida de actividad sea reducida. uso repetido y continuo": surge inmediatamente que la gran ventaja del uso de biocatalizadores inmovilizados se relaciona con la fcil separacin del catalizador del medio de reaccin sin prdida de actividad, y por consecuencia directa, con su reutilizacin. Las clulas o enzimas inmovilizadas pueden ser separadas fcilmente. Es necesario saber cmo afecta el mtodo de inmovilizacin la estabilidad del biocatalizador, y por ende la extensin de su uso repetido. Las clulas libres en suspensin presentan un rpido decaimiento en su actividad cataltica; sin embargo, las clulas inmovilizadas presentan una estabilidad mayor, y por lo tanto la inmovilizacin es un requisito necesario para poder reutilizar las clulas. El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, vara normalmente entre 20 y 50 das. Un caso particular, ampliamente usado, es aquel en el que se desea efectuar una reaccin de una sola etapa donde la viabilidad celular no interesa. Mas aun esta se destruye deliberadamente mediante tratamientos fiscos o qumicos los que tambin estabilizan la estructura celular. En este caso las clulas no viables actan como soporte de la actividad cataltica de inters.

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METODOS DE INMOVILIZACION: Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y sean estables es necesario aplicar un mtodo de inmovilizacin adecuado, que depender del tipo de actividad cataltica de inters. Existen diversos mtodos para inmovilizar clulas, los cuales pueden dividirse en: ENTRECRUZAMIENTO FISICO (FLOCULACION). ENTRECRUZAMIENTO COVALENTE. ADSORCION SOBRE MATRICES INSOLUBLES ENLACE COVALENTE CON MATRICES INSOLUBLES. ENTRAMPAMIENTO FISICO EN MATERIALES POROSOS. ENCAPSULAMIENTO.

Segn la ruta seguida para su preparacin los sistemas pueden clasificarse en cuatro: 1.- INMOVILIZACIN SIN CARRIER: es el caso de clulas unidas con otras clulas, tanto por adsorcin o por uniones covalentes. La floculacin de clulas, durante su fermentacin o por procesos secundarios mediante variacin en parmetros fisicoqumicos (pH, fuerza inica) es un proceso de unin por adsorcin. Este proceso puede ayudarse por el agregado de pequeas cantidades de agentes de floculacin (polimeros). Es tambin comn el uso de agentes qumicos bifuncionales, tal como el glutaraldhedo para unir clulas mediante entrecruzamiento qumico. El caso tpico es la floculacin de algunas cepas de Zymomonas mobilis, empleadas en la produccin de etanol. El mtodo de inmovilizacin es sencillo, pues espontneamente se producen flocs cuando se crecen clulas en un medio adecuado sin agitacin. Los flocs as formados se utilizan como inculo de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la produccin de etanol a partir de glucosa en reactores especialmente diseados. Las clulas inmovilizadas son retenidas dentro del reactor. Este mtodo permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a cabo en condiciones de reaccin suaves, que no perjudican la estabilidad del biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia mecnica frente a la agitacin y a la compresin, hay limitaciones difusionales al transporte de nutrientes, y est limitado a pocas clases de microorganismos. 2.- INMOVILIZACION DEL BIOCATALIZADOR EN CARRIERS PREFORMADOS: es la estrategia tpica en la inmovilizacin de enzimas, especialmente por medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones en condiciones fsicas y qumicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las caractersticas de estabilidad mecnica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el caso de clulas, el problema estriba en cmo favorecer la adhesin de las clulas (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor dimetro que la clula para permitir la penetracin a las superficies internas. Se emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersin en suspensiones celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la generacin de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o carboxilo libres presentes en la enzima. 3.- INMOVILIZACION DURANTE LA PREPARACION DEL CARRIER: Es la estrategia ms comn en la inmovilizacin de clulas enteras Si bien hay dos mtodos, entrampamiento y encapsulamiento, este ltimo es de limitada importancia. Debido al tamao de las clulas enteras, es relativamente sencillo preparar redes de porosidad

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tal que garanticen la completa retencin de las clulas, y que los procesos de transporte de sustratos y productos sean suficientemente rpidos para obtener alta eficiencia en la actividad cataltica. La dificultad se encuentra e la bsqueda de condiciones de preparacin de carriers n que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el mtodo de inmovilizacin ms usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones de reaccin (en el caso de polmeros naturales). 4.- INMOVILIZACION POR CRECIMIENTO DE CELULAS PREVIAMENTE INMOVILIZADAS: En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es utilizada para aumentar la concentracin de clulas dentro del carrier, por lo que, evidentemente, slo sirve para inmovilizacin de clulas. Permite inmovilizar clulas que contienen sistemas multienzimticos, ya sea en estado estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en caso de clulas libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas. Generalmente se realiza por entrampamiento en redes inicas. Es posible restaurar la actividad cataltica, e inclusive aumentarla. Es un mtodo til para obtener clulas difciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio celular. La tcnica en este caso consiste en la inmovilizacin de esporos en matrices insolubles, los cuales originarn micelio una vez inmovilizados en la matriz. TIPOS DE CARRIERS. Desde el punto de vista qumico, las sustancias usadas para soportar a los biocatalizadores pueden ser divididas en inorgnicas u orgnicas, y el origen de las mismas puede ser natural u obtenidas por sntesis. INORGANICOS: - Naturales: arena, silicatos, arcillas. - Sintticos: vidrios de porosidad controlada, cermicas. ORGANICOS: - Naturales: virutas de madera, antracita, colgeno, celulosa, alginatos, carragenatos, albmina. - Sintticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio inico, epxidos, poliuretanos. La seleccin del material se realiza siguiendo algunos criterios heursticos: materiales de alta disponibilidad y bajo costo materiales que permitan un proceso de inmovilizacin simple y efectivo respecto de la retencin de la actividad. materiales con alta capacidad y eficiencia materiales que permitan un diseo de reactores sencillo. Los dos prirneros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que permitan tcnicas de inmovilizacin por adsorcin. Los dos ltimos criterios dirigen la eleccin hacia carriers orgnicos complejos. Obviamente la eleccin final deber tener en cuenta el biocatalizadr a utilizar, el proceso en el cual va a participar y, fundamentalmente, el producto que se desea obtener. De todos los mtodos mencionados se har especial nfasis en aquellos que involucran la formacin de redes polimricas a partir de prepolmeros de cadena larga, tales como alginatos y kappa-carragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas de este tipo es tan grande

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que pueden subdividirse segn los mecanismos de formacin de las redes polimricas: 1. Precipitacin: formacin de red sin reaccin qumica, por separacin de fases. 2. Gelificacin: formacin de redes sin reaccin qumica, por transicin de fase debida a cambios de pH, temperatura, etc. 3. Gelificacin ionotrpica: formacin de redes con reaccin qumica (intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas polinicas con contraiones multivalentes. 4. Entrecruzamiento covalente: formacin de redes con reaccin qumica debida al entrecruzamiento de polmeros multifuncionales entre s o con reactivos bifuncionales de bajo peso molecular. En el trabajo prctico se estudiar la inmovilizacin de clulas de levadura con actividad invertasa en geles de alginato de Ca+2 , con el fin de emplearlas en la hidrlisis de sacarosa. Por lo tanto, se describirn brevemente los mecanismos de entrampamiento por gelificacin y por gelificacin ionotrpica. GELIFICACION: La gelificacin por transicin de fase suele ser promovida por cambios en temperatura o en pH. Los agentes gelificantes usados tradicionalmente son gelatina y agar, los cuales promueven una fcil gelificacin pero presentan la desventaja de originar geles blandos y mecnicamente inestables. Una mejora significativa constituye la introduccin de K-carragenato, heteroopolisacrico con ~-D-galactosa sulfato y 3,6-anhidro a-D-galactosa, soluble en agua a temperaturas entre 40 y 60 C y que gelifica a temperatura ambiente. Este material permite la formacin de bolillas, bloques y membranas que pueden ser usados como soporte de biocatalizadores. Hay dos reas donde se aplica el K-carragenato: - Conversiones catalizadas por sistemas monoenzimticos, donde pueden usarse clulas muertas. La matriz es post-tratada con glutaraldehido o hexametilendiamina, reactivos que estabilizan la actividad cataltica. - Inmovilizacin de clulas vivas, donde hay crecimiento de clulas en la matriz. GELIFICACION IONOTROPICA: El sistema ms comn es el entrecruzamiento de alginatos con iones Ca+2 . Los alginatos son polmeros de cido manurnico y gulurnico, solubles en agua a temperatura ambiente como alginatos de Na+ y que gelifican en presencia de ciertos iones polivalentes. En general una solucin de alginato de Na+ se deja gotear en una solucin de CaCl2 obtenindose en tiempos cortos, bolillas esfricas de tamao controlado y homogneo. Es un mtodo que presenta gran flexibilidad, pues alginatos de distinto peso molecular y distinta composicin qumica (distintas proporciones de cidos gulurnico y manurnico) rinden geles de muy buenas caractersticas qumicas y fsicas. El requerimiento de Ca+2 depende de la composicin qumica del gel. La concentracin de CaCl2 en la mezcla de gelificacin puede variar entre 0,05 y 2 %. El rango de temperaturas de operacin va desde 0 hasta 80 C. Las bolillas que se obtienen presentan dimetros entre 0,1 y 5 mm. y pueden presentar una alta carga celular por entrampamiento directo (hasta 30 g de clulas hmedas por ml de catalizador). Este sistema puede someterse a un secado parcial, con lo que el tamao disminuye y aumenta la estabilidad mecnica sin variacin en la porosidad. La desventaja que presenta es la inestabilidad frente a ciertos agentes capaces de secuestrar iones Ca+2 (p. ej.: fosfatos). Los puntos destacables de este mtodo son: Reversibilidad de la gelificacin: obliga a tornar precauciones en cuanto a la

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composicin del medio a utilizar, principalmente pH y presencia de agentes que puedan secuestrar a los contraiones por precipitacin o por formacin de complejos. Buena estabilidad mecnica respecto al empaquetado en columna y a la agitacin. e Formacin de bolillas regulares, y con tamao controlado. e Formacin de redes macroporosas, que se conserva an despus del secado parcial. Alta capacidad de carga sin prdida de estabilidad mecnica, pero con prdida de eficiencia debido a resistencias difusionales. Rendimientos de actividad cataltica de entre 80 y 100% en condiciones de reaccin controladas. e Mtodo suave, que permite que las clulas mantengan viabilidad y estabilidad. TRABAJO EXPERIMENTAL Se estudiar la hidrlisis de sacarosa mediante clulas de levadura comn de panificacin (Saccharomyces cereviseae) con actividad de invertasa (-n-fructosidasa) inmovilizadas en geles de alginato de Ca+2 . FUNDAMENTO La invertasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de la sacarosa en D-fructosa y Dglucosa. En la levadura comn, dicha enzima se encuentra como un complejo fosfomanano protena localizada en el espacio periplasmtico y su funcin hidrolizar la sacarosa proveniente del medio ya que no est descripta la existencia de transportadores especficos para sacarosa en la membrana plasmtica. Se utiliza ampliamente en industria de edulcorantes y confitera. La hidrlisis parcial o total de la sacarosa presenta las siguientes ventajas: mayor higroscopicidad, menor actividad acuosa y mayor poder edulcorante (de 1 a 1.1) ya que la mezcla fructosa-glucosa obtenida en sustancialmente ms dulce en comparacin a la sacarosa original (Tabla 1). Estas propiedades del hidrolizado se aprovechan en confitera para la preparacin de fondants, gomas y bombones y en general en confituras hmedas. En ciertos casos la enzima se agrega junto a la sacarosa para proveer centros lquidos en bombones caramelos etc. Industrialmente el azcar invertido se puede emplear para la produccin de sorbitol y manitol. Edulcorante Glucosa Dextrosa Sacarosa Fructosa Azcar invertido Maltosa Lactosa Aspartame Ciclamatos Sacarinia Valor edulcorante relativo 70-75 90 100 140-175 100-130 30 15 18.000 30.000 30.000-50.000

Tabla 1: Valores relativos como edulcorantes de diferentes glcidos (equivalente a una solucin acuosa al 10 % de sacarosa).

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Una alternativa es la inmovilizacin de la enzima purificada en soportes tales como los mencionados en esta gua. Sin embargo, esta estrategia trae aparejada la necesidad de purificar la enzima. Otra posibilidad es el empleo de clulas enteras no viables como catalizador. Este mtodo hace innecesario los pasos de separacin y purificacin, y es el que ser empleado en el Trabajo Prctico. Las clulas son luego inmovilizadas en una matriz polimrica (alginato de Ca+2 ). Esto se logra resuspendiendo las clulas en una solucin de alginato de Na+, alcanzndose la gelificacin mediante el reemplazo de los iones Na+ por iones Ca+2 . Las bolillas as formadas se emplean para hidrolizar una solucin de sacarosa. Para ello se prepara un dispositivo en el cual las bolillas son retenidas en una columna a travs de la cual se hace circular la solucin de sacarosa. La conversin alcanzada (que es una medida del grado de hidrlisis) se determina midiendo la concentracin de glucosa a la salida del reactor. Ajustando los parmetros de operacin (caudal, carga celular, dimetro de bolilla) se puede regular la conversin del sistema. PROTOCOLO: 10 g de levadura comercial de panificacin se resuspenden en 90 ml de agua destilada. Por otro lado se prepara 100 ml de una solucin de alginato de Na+ al 3.0 % en solucin fisiolgica de NaCl (0,9 %). El alginato no se disuelve fcilmente en agua fra. Conviene para ello ir adicionando el polmero lentamente a la solucin fisiolgica caliente con agitacin intensa (las soluciones de alginato son muy viscosas). Alternativamente se puede agregar una pequea cantidad de lquido a temperatura ambiente hasta formar una pasta con el polmero, dejar humectar 20-30 min y luego adicionar la solucin fisiolgica. Concluida la solubilizacin del polmero se mezcla la suspensin de levaduras y la solucin de alginato. Para formar las bolillas, la mezcla se deja gotear (con ayuda de una bomba peristltica y una aguja) sobre 200 ml de una solucin gelificante de CaCl2 (2%). Concluida la operacin se adiciona a la solucin con bolillas 10 ml de glutaraldehido al 2 % 5 y se incuba 20 min a temperatura ambiente. Las botillas se filtran y lavan con abundante agua destilada. Las bolillas se colocan en una columna con camisa, que se mantiene a 37 C, y se hace circular una solucin de sacarosa al 10 % ajustada el pH a 5.0 con cido actico y conteniendo 0.1 % de cloruro de calcio. El efluente de la columna es recogido peridicamente y en l se realiza la determinacin de glucosa mediante un mtodo enzimtico. Se estudiar el efecto del caudal de alimentacin sobre la conversin BIBLIOGRAFIA KIein, J. and Wagner, F. (1983). Methods for the immobflization of microbial cells. Appl. Biochem. Bioeng. 4, 11-51. e Poulsen, P.B. (1984) Current applications of immobilized enzymes for manufacturing purposes. Biotech. Gen. Eng. Rev. 1, 121-138. Woodward, J. (1988) Methods of immobilization of microbial cells. J. Microbiol. Meth. 8, 91-102.