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CONFRONTO TRA GLI ASPETTI DELLE CASEINE DEL LATTE

Uninteressante studio condotto presso lUniversit di Otago, in Nuova Zelanda, permette di approfondire una delle componenti del latte maggiormente in auge nella razza Bruna. Dalla ricerca emerge che la presenza e limportanza delle caseine nellindustria casearia ne hanno fatto un argomento diffuso degli studi biochimici, tanto da essere le proteine alimentari ampiamente pi studiate. La loro funzione primaria nutritiva, in quanto portano sia aminoacidi che minerali nel latte; inoltre, le caseine sono considerate come marcatori delle diverse funzioni della mammella e sono state usate come modello per lo studio del funzionamento dellapparato mammario.
Le caseine costituiscono il maggiore componente del latte della maggior parte dei mammiferi e sono secrete sotto forma di micelle, che portano anche unalta concentrazione di calcio. Sono fosfoproteine che rappresentano i prodotti di quattro geni, equivalenti a quelli che codificano le caseine bovine s1, s2, e . Esiste una significativa variazione nelle proporzioni relative delle caseine specifiche nelle diverse specie. La sequenza primaria delle caseine s1, s2 e mostra una significativa variazione tra le specie collegate alla rapida evoluzione dei geni, che si suppone abbiano un precursore comune. Al contrario, le caseine mostrano caratteristiche che dimostrano una loro origine e funzione separata laddove si ritiene stabilizzino la struttura delle micelle. Questa ricerca analizza il confronto tra gli aspetti delle caseine in un gruppo di razze di cui sono disponibili informazioni. Introduzione Le caseine sono una famiglia di fosfoproteine sintetizzate nella ghiandola mammaria come risposta alla produzione di prolattina o altri stimoli, che vengono secrete sotto forme di aggregati colloidali chiamati micelle, che sono responsabili di gran parte delle specifiche caratteristiche del latte. La loro presenza e la loro importanza per lindustria casearia hanno fatto di loro un argomento diffuso degli studi biochimici, tanto da essere le proteine alimentari ampiamente pi studiate [101]. Inoltre, le caseine sono considerate come marcatori delle diverse funzioni della mammella e sono state usate come modello per lo studio del funzionamento dellapparato mammario [95]. Inizialmente le caseine furono considerate sostanze omogenee, finch Lindstrom-lang et al. dimostrarono che esse erano composte da due frazioni separate: una che precipitava in presenza di calcio, la caseina calcio-sensibile, e laltra che era responsabile della stabilizzazione della prima, la caseina non calcio-sensibile [71]. Mellander [73] applic la tecnica dellelettroforesi a zone alla frazione di caseina e dimostr la presenza di tre componenti distinti, che chiam caseine , e . Grazie al miglioramento delle tecniche di elettroforesi, si trov un numero ancora maggiore di componenti presenti nella frazione di caseina [106] e furono fatti molti studi per ottenere maggiori informazioni su questi componenti minori. Tuttavia, in seguito alla diffusione della biologia molecolare negli anni 70 e 80 che oggi si sa che esistono solo quattro tipi di caseine e che leterogeneit individuata dalla elettroforesi era dovuta agli effetti del processo post-traslazionale, ad una congiunzione alternativa del prodotto genetico, o al polimorfismo genetico [83]. Nel 1984 il Comitato per la Nomenclatura e Classificazione della Dairy Science Association ha proposto una nomenclatura elaborata per definire le caseine bovine, e cio s1, s2, e . Lo studio riguarda, in particolare, gli aspetti confrontabili delle caseine e dei loro geni nelle varie specie di cui sono disponibili informazioni. Le caseine s1 Tra le caseine calcio-sensibili, le -caseine sono caratterizzate da una maggiore solubilit in presenza di calcio. La differenza tra la famiglia della caseina s1 e quella della caseina s2 si basa sulla loro diversa sequenza di aminoacidi [56,100,101]. La caseina s1 la pi consistente frazione proteica presente nel latte bovino. una proteina altamente fosforilata ed esiste in una forma maggiore ed in una minore, che contengono, rispettivamente, 8 e 9 fosfati legami gruppi/molecole [28]. La sequenza degli aminoacidi delle caseine s1 di un certo numero di specie euteriane stata determinata direttamente, o dedotta dalla sequenza di geni del DNA [1.23.47.49.52.54.60.79.]. Lallineamento di queste sequenze presentato nella tabella 1. Da notare la presenza di una sequenza segnale altamente conservata, ma molto divergente, di 15 residui nelle proteine mature, che indica che sono stati codificati da una famiglia di geni in rapida evoluzione. Mentre la lunghezza della catena peptide matura generalmente simile a quella della caseina bovina s1 (199 residui), le omologhe catene di ratti e topi sono molto pi lunghe, a causa dellinserimento di una serie di ripetizioni di esapeptide [47.52.54]. Al contrario, la proteina delle cavie leggermente pi corta con 183 residui. Si pu affermare che esiste una maggiore identit dei livelli di aminoacidi tra i ruminanti (>85%) e i roditori (80%), che tra i bovini e i suini con il 48%. C solo il 29% di identit degli aminoacidi nella regione C-terminale delle caseine s1 dei bovini e dei ratti e ancora meno nel N-terminale. Melanie R. Ginger*, Murray R.Grigor**
* Dipartimento di Biochimica dell Universit di Otago,Dunedin, Nuova Zelanda **Gruppo di Ricerca per la Zootecnia da latte, Centro Ricerche Ruakura, Private Bag 3123, Hamilton, New Zealand Il lavoro degli autori stato finanziato da contratti MAF Policy, dalla Foundation for Research, Science and Technology, New Zealand.

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Tutte le caseine s1 contengono siti multipli di fosforilazione, compreso il sito pi importante nei residui 100-110 (numerazione come in tabella 1). La fosforilazione si verifica nei residui di serine e treonine, che comprendono parte della ripetizione Ser/Thr-X-Y (dove X un qualsiasi amino acido e Y un residua di acidi). Quando il glutammato (o aspartato) occupa la terza posizione di questa sequenza, il sito viene definito come sito di fosforilazione primaria [75]. Le serine, o le treonine fosforilate possono determinare la fosforilazione di altre serine e tali siti sono chiamati siti di fosforilazione secondaria [75.78]. Questi sono osservabili sotto forma di una stringa composta da un

massimo di 6-8 serine, seguite da due glutammati. La caseina bovina s1 esiste in due forme fosforilate, che contengono 8-9 fosfati/mol [75.80]. Sono state descritte le varianti delle s1-caseine che si trovano in natura nelle singole specie. La tabella 1 riporta la sequenza bovina per la variante B, che contiene Glu nella posizione 192 del peptide maturo (posizione 319 nella tabella 1), invece del Gly presente nella variante C. Mentre la forma B predomina nel bestiame Bos taurus, la forma C si trova nel bestiame Bos indicus e si ritiene sia la forma ancestrale [83]. La razza Holstein ha >95% della variante B, mentre la razza Jersey ha circa il 60% della forma B e il 40% della forma C [32.83]. Una forma rara, la A, ha 13 delezioni residue tra il Glu14 e lAlas26 numerati come nel peptide maturo. Sono state descritte varianti multiple delle caseina a caprine che si caratterizzano per livelli di espressione decisamente diversi [13]. Le caseine s2 Le caseine del gruppo s2 sono un gruppo pi disomogeneo rispetto alle caseine s1 e sono state identificate in un certo numero di specie euterie, tra cui ruminanti s2, ratti , topi e , cavie caseina A e conigli s2a, s2b [3.7.11.14.19.50.52.54.96.100]. Nella tabella 2 riportato lallineamento di queste sequenze. I topi ed i ratti hanno raramente due geni della caseine s2. Come per le s1, la sequenza segnale ben conservata, ma le proteine mature sono alquanto differenti. La caseina dei topi (topo b nella tabella 2) sembra essere mozzata nella sua regione N-terminale. In generale, il livello di somiglianza degli amino acidi tra i due omologhi nei conigli e nei topi <40% rispetto al 64% delle sequenze dei bovini e dei suini. Come la casine s1, le caseine s2 sono peptidi altamente fosforilati. Il latte bovino contiene quattro isoforme diversamente fosforilate, che contengono 10-13 gruppi/mol fosfati [14.28]. I siti di fosforilazione putativi delle caseine bovine e delle caseine s2 sono riportati nella tabella 2. Le sequenze delle caseine a dei marsupiali, lo wallaby (Macropus eugenii) e dellopossum (Trichosaurus vulpecula) sono state descritte [16.35] (tabella 3). Bench siano molto simili alle caseine s1, hanno scarsissima affinit con le famiglie dei geni euteriani delle caseine . Hanno, tuttavia, la tipica sequenza segnale residua 15 e ci sono anche somiglianze per quanto riguarda la posizione e la natura dei maggiori siti di fosforilazione. Si possono individuare almeno sette livelli diversi di fosforilazione con lo spettrometro a massa nella caseina dellopossum che insolitamente glicosilata [35]. Le -caseina La famiglia delle caseina comprende almeno sette proteine euteriane, e ora anche due marsupiali, delle quali si conosce la sequenza di amino acidi e nucleotide [2.6.9.16.39.59.85.87.89.100.103.109]. Anche le sequenze rappresentative delle -caseine euteriane (tabella 4) sono caratterizzate da una sequenza segnale residua 15, anche se le proteine mature mostrano un certo grado di differenzazione tra le specie in termini di identit di aminoacidi, che simile a quella osservata per le caseine s1. Le -caseine sono particolarmente ricche di glutammine, la cui posizione ben conservata, come nel caso del sito principale di fosforilazione vicino al terminale-N. Il numero dei siti di fosforilazione e il livello di fosforilazione sono inferiori a quelli osservati per le s1-caseine e per le s2 -caseine. La -caseina bovina esiste in una forma completamente fosforilata, che contiene 5 fosfati/mol di proteine, mentre nel latte di altre specie (uomo, capre e opossum) la -caseina ha siti di fosforilazione multipli [35.38.39.89].

Tabella 1 - Allineamento multiplo delle sequenze proteiche delle s1-caseine. Allineamento delle sequenze di aminoacidi delle s1-caseina di alcune specie. Le sequenze sono state ottenute da Genbank (numero di accesso tra parentesi) e allineate usando il programma Pileup della Wisconsin Package version 9.1 Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Le caseine s1 delle cavie corrispondono alla caseina [49]. Le sequenze segnate sono in corsivo e i potenziali siti di fosforilazione in neretto.

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Come nel caso delle -caseine, le -caseine dei due marsupiali sono troppo diverse da quelle delle -caseine euteriane per poter essere inserite nellallineamento sopra riportato. Le loro sequenze (tabella 5) mostrano la presenza di una regione octapeptide replicata 17 e 16 volte rispettivamente nelle sequenze dello wallaby e dellopossum. Un certo numero di frammenti di peptidi minori stato identificato nel latte bovino. Questi frammenti comprendono le caseine 1, 2 e 3 e componenti 5-8 del peptone proteoso. La solubilit del secondo gruppo in ambiente acido ha inizialmente determinato la loro errata individuazione come proteine del siero. Al contrario, come successivamente dimostrato, esse sono il prodotto di una proteolisi parziale delle -caseina ad opera della plasmina [26.27.36.46]. Sono state trovate tre varianti della caseina bovina B: as1, as2 e . La variante s2 predomina nel bestiame Bos indicus, mentre le varianti s1 e s2 hanno approssimativamente le stesse frequenze di allele nel bestiame Holstein. Lallele B, che del tutto assente nelle Holstein, ha una frequenza di allele di ~0.3 nel bestiame Jersey [83]. Le forme s1 e contengono un operone His nel residuo 67 (peptide maturo) rispetto al Pro presente nella variante s2, mentre la variante contiene un Arg nel residuo 122, mentre nelle varianti s1 e s2 presente un Ser [32.44.83]. Le caseine Si conosce la sequenza degli aminoacidi o sequenza del nucleotide della -caseina di molte specie euteriane [8.10.12.15.34.37.48.70.76.77.82.104]. Queste sequenze sono presentate nella tabella 6. La -caseina diversa dalle caseine calcio-sensibili per alcuni aspetti. la sola caseina che solubile in presenza di ioni di calcio ed ha componenti fosfati molto pi piccoli di qualsiasi altra caseina. I siti di fosforilizazione sono confinati nella regione terminale-C della molecola e sono presenti come siti singoli, a differenza dei grappoli, che generalmente si trovano nelle caseine calcio-sensibili. Il peptide-segnale contiene 21 residui (invece dei 15 delle caseine calcio-sensibili. La kappa-caseina la sola caseina euteriana che dimostarata contenere parti di molecole di carboidrati. Queste caratteristiche hanno portato a ritenere che la -caseina non sia in realt una caseina calcio-sensibile [8.65.81]. La -caseina sensibile alla segmentazione in presenza di proteasi aspartato, chimosina (rennina). Jolls et al. hanno dimostrato che nella -caseina bovina la segmentazione si verifica in uno specifico legame phe-Met nella porzione terminale-C [20.62]. I prodotti di questa segmentazione sono un fragmento molto caricato e glicosilato del terminale-C (chiamato macropeptide o glicomacroproteina) e il peptide idrofobo del terminale-N, la para -caseina. Nakhasi et al. [82] hanno suggerito che la -caseina possa essere classificata in due gruppi separati in base alla specie di origine. Le -caseine del gruppo I (vacche, pecore, capre, bufali) sono diverse dalle -caseine del gruppo II (ratti, topi, suini, umani) per la loro idrofobicit, per il contenuto di carboidrati, per la composizione degli aminoacidi e per sito di segmentazione proteolitica. Le caseine del gruppo I contengono il legame archetipo Phe-Met, mentre per le -caseine del gruppo II il sito di segmentazione specificato da Phe-Ile o Phe-Leu. La differenza potrebbe spiegare anche la diversit nel meccanismo della coagulazione nei mammiferi ruminanti e non ruminanti [53]. Le -caseine sono le uniche caseine, almeno tra le specie euteriane, che sono glicosilate. I gruppi carboidrati sono attaccati alla -caseina per mezzo di legami O-glisolici ai residui di serina e treonina con la porzione terminale-C della molecola. La glicosilazione avviene post-traslazionalmente ed catalizzata dalle transferasi O-glicosilate legate alla

Tabella 2 - Allineamento multiplo delle sequenze proteiche delle as1-caseine. Allineamento delle sequenze stimate di amino acidi delle as2-caseine di vacche, capre, cavie, topi, conigli, ratti e pecore. Le sequenze sono state ottenute da Genbank (numero di accesso tra parentesi) e allineate usando il programma Pileup della Wisconsin Package version 9.1 Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Sono stati introdotti spazi vuoti per migliorare lallineamento. Le sequenze dei ratti corrispondono alla g-caseina dei ratti [54], dei topi corrispondono alla g-caseina dei topi [96], dei topi b corrispondono alla e-caseina [52], delle cavie alla caseina A [50].

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Tabella 3 - Confronto delle sequenze di a-caseina nei marsupiali. Le sequenze di amino acidi per la a caseina dellopossum (thricosaurus vulpecula) e del tammur wallaby [16] sono state allineate usando il programma GAP del Genetic Computer Group (GCG). La sequenza del tammar stata correlata come nella bibliografia [35]. Le sequenze segnale sono in corsivo e i siti di fosforilazione putativi in neretto.

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membrana allinterno dellapparato di Golgi delle cellule epiteliali della mammella [63.74.102]. La glicosilazione aumenta durante la produzione del colostro ed in risposta ad una infezione come la mastite, ma diminuisce nei periodi successivi della lattazione [24]. La -caseina umana molto pi glicosilata di quella delle pecore e delle vacche e i residui di carboidrati possono ragTabella 4 - Allineamento multiplo delle sequenze di proteine della b-caseina di alcune specie euteriane. Allineamento delle sequenze di amino acidi della b-caseina di alcune specie. Le sequenze sono state ottenute dalla Genbank (numeri di accesso tra parentesi) e allineati usando il programma Pileup del Genetic Computer group (GCP). Le sequenze segnale sono in corsivo e i potenziali siti di fosforilazione in neretto.

giungere anche il 55% del peso totale della molecola [21]. La frazione di carboidrati della -caseina bovina formata da galattosio, galaottosamine N- acetile e acido neuroamminico N-acetile. La caseina delle pecore contiene acido neuroamminico-glicolico-N, oltre a questi tre zuccheri [63]. La caseina umana ancora pi complessa e contiene fucosio, galattosio, galattosamine N- acetile e acido neuroamminico N-acetile [21.31.108]. La presenza di varianti della caseina bovina accuratamete descritta. Due delle forme principali, la A e la B si distinguono al residuo 136 e 148 (A: Thr e Asp B: Ile e Ala). La frequenza degli allele delle varianti A e B predominante nel Bos indicus e nel bestiame Holstein, mentre il contrario per le Jersey [32.43.83]. Propriet fisiche e formazione delle micelle Le caseine sono refrattarie alla cristallizzazione, di conseguenza stato impossibile fare delle indagini sulla loro struttura utilizzando i metodi di diffrazione a raggi x [101]. Sono state, invece, utilizzate altre tecniche spettrometriche, come il dicroismo circolare, la dispersione ottica rotatoria e la spettroscopia a infra-rossi, per determinare le proporzioni degli elementi strutturali nelle soluzioni acquose delle caseine isolate [94]. I primi studi spettrografici indicavano che le caseine possiedono una struttura secondaria parzialmente regolare [53]. Questo stato confermato da altre misurazioni idrodinamiche, come la NMR, che segnalava che le caseine hanno una struttura aperta e flessibile, caratteristica di una conformazione a spirale casuale [94.98]. Le caseine sono presenti nel latte intero come aggregati termo-molecolari di proteine e minerali chiamati micelle. La concentrazione della caseina totale nel latte varia moltissimo, da meno di 10g/l a oltre 100g/l, a seconda della specie. I valori pi bassi si trovano generalmente nel latte dei primati, per esempio 4.6 g/l negli umani, e la massima concentrazione nei roditori, nei conigli e in alcune foche [58]. Nel latte bovino le caseine ammontano a 25-26g/l con la stessa quantit di caseine s1 e (9-11 g/l) e di caseine s2 e (3g/l). Inoltre, si possono trovare anche piccole quantit di caseine non-micellari. Il latte umano contiene solo quantit minime di -caseine e le -caseine sono quelle principali [45]. Il latte dei ratti contiene 90-100g/l di proteine totali e circa 60g/l di caseine [40]. Le principali caseine sono la caseina (s1) e la caseina (41% e 36%), con minori quantit di caseine (s2) e di caseine (10% e 5%) (Grigor MR Carne A. Smith MG, inedito) Il latte degli opossum contiene sia le caseine che le caseine in rapporto di 2:1 [35]. Una tipica micella bovina contiene 104 molecole singole di caseina in associazione collodiale con fosfato di calcio e piccole quantit di magnesio, sodio, potassio e citrato [55]. Le proteine sono tenute insieme da una miscela di interazioni idrofobiche ed elettrostatiche, che sono intrinseche delle singole caseine e della loro interazione con il fosfato di calcio. La presenza di fosfato di calcio fondamentale per la conservazione dellintergrit delle micelle. Waugh [107] sostiene che la caseina sia localizzata, soprattutto, sulla superficie delle micelle e determini la dimensione della micella stessa. Questa affermazione confermata dagli studi condotti con il microscopio elettronico, utilizzando tecniche di marcatura e immunologiche con caseina localizzate, soprattutto, sulla superficie delle micelle [57.68.97.98]. Dalgleish et al [18] hanno determinato la composizione e la dimensione delle frazioni micellari isolate per mezzo di ultra-centrifugazione, analizzando le proteine ed i minerali e le misurazioni a dispersione luminosa. Le loro scoperte ci dicono che la superficie delle micelle contiene una stessa quantit di caseina e (oltre a una minima presenza di caseina ), mentre linterno formato da una quantit equimolare di caseine e .

Tabella 5 - Confronto tra sequenze di b-caseina dei marsupiali. Le sequenze di aminoacidi della caseina b dellopossum (Trichosaurus vulpecula) [35] e della tammar wallaby (Macropus eugenii) [11] sono state allineate usando il programma GAP del GCG. Le sequenze segnale sono in corsivo, mentre i siti putativi di fosforilazione sono in neretto. La regione replicata octapeptide occupa i residui da 144 a 249.

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La concentrazione di calcio del latte bovino intero di circa 30mM oltre il minimo della concentrazione richiesto per far precipitare le caseine e . Inoltre, gran parte del calcio associato alle micelle sotto forma di una combinazione di calcio micellare (direttamente legato alle caseine per mezzo dei residui della fosforilazione) e di calcio collodiale (associato con le micelle, ma non direttamente legato al polipeptide della caseina) [29.55]. stato dimostrato che i gruppi carbossile dei residui di glutammato e aspartato presenti nei grappoli fosfati possono partecipare al legame del calcio, poich una quantit leggermente inferiore di calcio viene legata rispetto a quanto prevedibile al numero di gruppi fosfati presenti allinterno della molecola [55.101]. Tuttavia, meno del 40% del calcio associato con le micelle calcio micellare. Struttura dei geni della caseina La struttura dei geni che caratterizza le caseine calcio-sensibili ha rivelato la presenza di strutture conservate dei geni delle caseine s1, s2 e in numerose specie. La caseina dei ratti [66] stata la prima i cui geni furono studiati e comprende una unit tradizionale di 7.2kb, che contiene 9 esoni e 8 introni. La dimensione degli esoni varia da 21 a 525 bp., mentre gli introni sono molto pi grandi e costituiscono l85% del gene. Lesone I contiene la regione non traslata 5. Lesone II lungo 63bp e contiene la traccia di una regione non traslata, il peptide segnale e i primi due amino acidi della proteina matura. Gli esoni III VI sono corti (21-42 bp) e codificano il dominio idrofilo del terminale-N, che contiene tutti i siti potenziali di fosforilazione. Il principale sito di fosforilazione formato dalla congiunzione dellesone IV e dellesone V. L esone VII lesone principale e codifica la porzione idrofoba terminale-C della molecola. Lesone VIII codifica il codone finale della proteina matura. La regione non traslata 3 viene codificatata, rispettivamente, dagli esoni VIII e IX. Lanalisi della sequenza genomica della caseina delle capre [93], delluomo [51.72] dei bovini [9] dei conigli [86.103] e dei topi [110.111] dimostra che questa struttura degli esoni si mantenuta in tutte le sei specie e che le variazioni della dimensione della unit di trascrizione sono dovute alle variazioni della dimensione degli introni (tabella 7). Lunica eccezione la caseina umana , in cui lesone III codificato in modo criptato, a causa delle modificazioni intervenute dei siti di segmantazione di questo esone. Unaltra caratteristica della struttura del gene della caseina riguarda la conservazione dei siti di fosforilazione. Il sito principale di fosforilazione formato da una fragmentazione del RNA, che si contrappone al codone glutammato (codificato dal finale 5 dellesone V) accanto al sito secondario di fosforilazione codificato dal fianle 3 dellesone precedente in modo tale che essi formano parte della sequenza consenso della fragmentazione del RNA [66]. La sequenza e la struttura dei geni che codificano le caseine s1 di conigli, bovini, capre e le caseine s2 dei bovini e dei ratti (caseina dei ratti) e dei bovini sono state studiate [22.41.61.67.69.112]. Queste sono geni grandi, che, nel caso dei bovini, contengono 18 o 19 esoni distribuiti su 17-18.5 kd di sequenza contigua. Il confronto della sequenza genomica nella sua lunghezza complessiva dei geni delle caseine s1 e s2 suggerisce che ci siano molte caratteristiche comuni [41.67]. In particolare, queste comprendono la piccola dimensione degli esoni 5, la struttura e la dimensione invariata dellesone II e la separazione dei siti principali di fosforilazione nei diversi esoni e nei domini idrofobici codificati dallesone pi grande. Inoltre, le sequenze conservate sono state trovate nella regione laterale 5 di tutte le caseine calcio-sensibili, dimostrando con certezza che queste sequenze sono responsabili della regolazione corretta degli ormoni dei geni della caseina. [8.42.47.81].

La struttura del gene della caseina alquanto diversa da quelle delle caseine calcio-sensibili. La dimensione del peptide segnale, la distribuzione dei siti di fosforilazione e le propriet delle sequenze sono diverse da quelle delle caseine calcio-sensibili [8.81]. La struttura dei geni dei coniTabella 6 - Allineamento multiplo delle sequenze proteiche della caseina k. Lallineamento delle sequenze di aminoacidi previste delle caseine k selezionate. Le sequenze sono state ottenute dalla Genbank (numeri di accesso indicati) e allineate usando il programma Pileup del GCG. La posizione del legane chimosina sensibile indicato dalla linea verticale.

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Tabella 7 - Lorganizzazione delle caseina b che codifica i geni di euteriani. Sono presentate le dimensioni dellesone e dellintrone dei geni della caseina-b delle vacche [9], capre [93], uomo [51], topi [111], conigli [103], ratti [66] e pecore [86]. Nella caseina umana lesone III codificato in modo criptato [104] e perci lintrone ii apparentemente pi grande. Adattato da Bibl. [81].

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gli, degli uomini e dei bovini nota [1.5.25.42] e la sequenza parziale dei geni delle capre e delle pecore disponibile [15.99]. Il gene della caseina bovina contiene 5 esoni separati da ampie sezioni di sequenze di introni. La dimensione complessiva del gene circa 13kb. Lesone I formato da 65 bp di sequenza non traslata. Lesone II contiene la traccia della sequenza non traslata e 19 codoni che caratterizzano il peptide segnale. La traccia del peptide segnale e il terminale N della polipeptide maturo vengono codificati dai 33bp dellesone III, mentre la maggior parte dei polipeptidi maturi viene codificata dallesone IV. Concludendo, 210 nucleotidi della sequenza non traslata sono contenuti negli esoni IV e V (4). Confrontando questo gene con quelli dei conigli e delluomo si nota che una struttura simile conservata in tutte tre le specie, bench il gene dei conigli abbia introni pi corti e, di conseguenza, sia pi piccolo degli altri. Gli elementi conservati sono stati individuati nelle regioni prossimali delle caseine di pecore, capre, vacche e uomo che sembrano essere diverse da quelle trovate nelle regioni laterali 5 dei geni delle caseine calcio-sensibili. Esiste oggi la prova, relativa a tre specie, che i geni delle caseine calcio-sensibili comprendono una piccola famiglia di geni, che, insieme alla -caseina, formano parte del grappolo di geni sul cromosoma euteriano. Recentemente, Rijnkels e associati hanno presentato una mappa ad alta risoluzione del locus del gene della caseina di vacche e topi [88.90.92]. Il locus della caseina bovina copre unarea di 250 kb e lordine dei quattro geni allinterno del locus, s1, , s2 e lo stesso presentato precedentemente [30]. I geni strettamente collegati della caseina s1 e sono separati solamente da 20kb e sono trascritti in modo convergente. La prossimit fisica di questi due geni spiega lalto livello di collegamento genetico osservato per questi due geni nei bovini [83]. I geni della caseina s2 e della caseina (rispettivamente ) sono localizzati 70 e 200 kb a monte del gene della caseina e sono trascritti secondo lo stesso orientamento della caseina s1. Questo posizionamento si conservato nel locus della caseina dei topi con leccezione che il grappolo dei topi contiene un gene simil- s2 in pi, la caseina . In tal caso i geni della caseina e sono strettamente correlati e sono trascritti in modo convergente. Inoltre, questo posizionamento della caseina s1, simil- s2 e anche stato rilevato nel locus del gene della caseina umana, anche se lorientamento della trascrizione dei singoli geni non sia ancora noto [33.91]. Levoluzione dei geni della caseina Nonostante lassenza di una omologia tra le sequenze di codificazione delle caseine calcio-

sensitive entro e tra le diverse specie sia giustificata dalla rapida evoluzione della famiglia di geni, ci sono delle caratteristiche conservate che indicano che questi geni possono essere evoluti da un gene ancestrale comune. Questo si riferisce alla sequenza segnale, alle regioni 5 al sito di inizio della trascizione e le regioni che codificano i principali siti di fosforilazione. Oltre a ci, esistono delle somiglianze nei geni delle caseine calcio sensibili che contengono un certo numero di esoni piccoli. Ci fa pensare che sia possibile che questi geni siano evoluti da un gene antenato comune attraverso una serie di eventi come il rimescolamento degli esoni e la duplicazione dei geni [112]. Lorientamento invertito dei geni delle caseine s1 e e dei geni delle caseine s2 () e delle caseine dei topi potrebbe essere la prova della duplicazione di larghe regioni del DNA allinterno del locus della caseina. Al contrario, i geni della caseina sembrano essere evoluti seguendo un diverso percorso. Lanalisi della struttura dei geni della caseina conferma che la caseina non imparentata con le caseine calcio-sensibili. La possibilit che la caseina sia collegata alla catena- del fibrinogeno confermata dalle somiglianze della sequenza cDNA di entrambe le proteine [105]. Ci sono anche un certo numero di somiglianze tra le due proteine, come la posizione conservata dei residui di cisteina e il legame chimosina-sensibile e la possibile struttura secondaria che circonda questo legame [65]. interessante pensare che una proteina coinvolta nella coagulazione del latte sia evoluta da una famiglia di proteine negli stadi finali dei processi di coagulazione del sangue. Ci sono, in realt, numerose somiglianze funzionali tra questi due processi: sono originati da una segmentazione proteolitica che determina la produzione di peptidi solubili (glicomacroproteine e fibrinoproteine A e B); le glicomacroproteine e le fibrinoproteine hanno una significativa carica negativa; il sito di segmentazione conservato tra le specie; e i processi vengono accellerati dalla presenza di ioni di calcio e ritardati dalla presenza di moieti glicosilati [64]. Se la caseina e il fibrinogeno- sono evoluti da un comune antenato, allora ci si pu aspettare che la struttura di congiunzione debba essere conservata. In realt, in qualsiasi caso, le regioni omologhe esistenti tra la caseina e il fibrinogeno sono limitate su almeno un lato da giunture nel gene del fibrinogeno- [4]. Le ricerche condotte sulla struttura dei geni di altri membri della famiglia dei fibrinogeni rivelano che le posizioni degli introni sono scarsamente conservate tra i singoli geni. Sembra possibile che gli introni siano andati persi dopo la divergenza di questi geni [17]. Perci, ammesso che quella struttura di congiunzione sia mal conservata nella famiglia nei fibrinogeni, sembra possibile che la -caseina e il fibrinogeno- siano evoluzionisticamente imparentati e che la divergenza delle due proteine dipenda dal rimescolamento degli esoni e dalla perdita di introni da parte del gene della caseina . Conclusione Le caseine sono una famiglia di proteine diverse generalmente codificate da non pi di quattro geni in tutte le specie. La funzione primaria delle caseine nutritiva, in quanto portano sia aminoacidi che minerali nel latte. Ad eccezione della caseina , ci sono altri limiti funzionali della struttura delle proteine se non quello di fornire siti adatti alla fosforilazione e al conseguente legame di minerali come il calcio. Di conseguenza, i geni stanno evolvendo rapidamente, come testimoniato dalla decisa diversit esistente tra le caseine e dei marsupiali rispetto a quelle delle specie euteriane. Un futuro sbocco delle ricerche comparate delle caseine potrebbe riguardare lo studio delle strutture dei geni delle caseine dei marsupiali e le loro propriet di frammentazione, le propriet micellari dei diversi miscugli di caseina, la co-evoluzione delle caseine e la chimosina dello stomaco e la regolazione dellespressione dei geni delle caseine nelle diverse specie.

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