ANLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e Cssio Ricardo Fares Riedo Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica, CP 6154, 13084-862 Campinas, So Paulo - Brasil

RESUMO Este um texto de apoio ao aplicativo multimdia Anlise Quantitativa por Cromatografia (disponvel em Aplicativos e Programas). A sua finalidade a de oferecer ao leitor material similar, na forma impressa, ao do multimdia. Este texto mais detalhado do que o apresentado no aplicativo, mas tem um nmero muito menor de figuras. tambm uma forma complementar para a apresentao das informaes e interpretaes, podendo servir tanto como material de apoio como resumo do material original. Palavras-chave: Cromatografia, Curva Analtica, Tratamento de Dados, Teste de Huber

Introduo A anlise quantitativa em cromatografia baseada em estabelecer o valor da rea da banda cromatogrfica. Na cromatografia em coluna, isto , gasosa (CG) e em cromatografia lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) a banda registrada como um pico (Figura 1) que, idealmente deve ter formato gaussiano.

O parmetro quantitativo fundamental em cromatografia a rea da banda cromatrogrfica.

300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8

Figura 1. Esquema de um cromatgrafo gasoso e de um cromatograma obtido por cromatografia gasosa.

Em cromatografia gasosa de alta resoluo, onde so usadas colunas capilares, no incomum que os picos tenham perfil gaussiano, como demonstrado no detalhe da Figura 2, que o pico destacado em azul da Figura 1.
Na prtica da cromatografia so observados picos gaussianos.

150 100 50 0 3,9 3,95 4

Figura 2. Detalhe do pico destacado em azul na Figura 1, mostrando que ele tende ao perfil gaussiano. Similarmente ao que ocorre na cromatografia em coluna, as manchas observadas em cromatografia em camada delgada (CCD) tambm tendem distribuio gaussiana. Isto mostrado na Figura 3, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas para seces verticais:

As bandas cromatogrficas tendem ao perfil gaussiano.

2000 1500 1000 500 0

1 4 7 10 13 16 19 22

Figura 3. Distribuio das quantidades (figura inferior) de analito numa mancha (figura superior) de CCD.

Portanto, nos casos mostrados nas figuras anteriores, nas correspondentes bandas cromatogrficas as quantidades dos analitos tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro para a outra borda. Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de pico, a sua rea pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a rea do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico (Figura 4).

Clculo da rea de um pico cromatogrfico por triangulao: A = h Wb

h Wb
Figura 4. A = hWb. Clculo da rea de um pico cromatogrfico por triangulao. Na cromatografia em camada delgada a rea da mancha estabelecida por densitometria, cujo princpio est representado na Figura 5.

A densitometria faz a contagem do nmero de pontos de uma imagem.

Figura 5. O princpio da densitometria: o nmero de pontos que define a mancha (como vista por um densitmetro ou computador) proporcional rea da mancha.

O procedimento e princpio de obter reas em CCD a partir de imagens digitalizadas e arquivadas em computador est representado na Figura 6: as placas no caso com manchas visveis de corantes so digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a contagem dos pontos (pixeis o termo usado na rea de computao) que compem cada mancha. A contagem pode ser feita manualmente com muita pacincia ou por meio de um programa que conte os pixeis. O nmero de pontos proporcional rea da correspondente mancha e, conseqentemente, proporcional quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa o princpio de estabelecimento de reas cromatogrficas.

O nmero de pontos que compem uma mancha escaneada proporcional sua rea.
1074 pontos 664 pontos 641 pontos 554 pontos
Escanear.

Figura 6. Princpio do estabelecimento de rea de uma mancha de CCD por meio de escaneamento da placa cromatogrfica. Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para CG e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD. O uso das reas cromatogrficas a curva analtica medindo-se as reas cromatogrficas que se estabelecem as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor forma de realizar quantificaes a baseada numa Curva Analtica1. A Curva Analtica (Figura 7) a relao entre sinais no caso as reas e quantidades do analito a ser quantificado.

Curva Analtica o nome sugerido pela IUPAC para substituir o termo Curva de Calibrao.

rea

Toda anlise efetivamente quantitativa exige o uso da curva analtica.

Quantidade

A=a+bQ Figura 7. Esboo de uma Curva Analtica linear (representada pela equao de uma reta). Obtendo uma Curva Analtica O primeiro passo para obter a curva analtica preparar um conjunto de solues com um padro do analito que se deseja quantificar em amostras. Portanto, necessrio conhecer a identidade do analito e dispor dele na forma de padro (puro ou, se isso no for possvel, com pureza exatamente conhecida e determinada independentemente). Cinco a seis solues costumam ser suficientes para este trabalho. Estas solues so aplicadas lado a lado na placa cromatogrfica e realizada a corrida cromatogrfica. Como no incomum que numa anlise tenha-se que quantificar vrios analitos, as solues podem conter todos eles, do que resultar uma cromatoplaca como a mostrada nas Figuras 5 e 6. Ento as reas das manchas so obtidas (Figura 6) e tabeladas, como mostrado na Tabela 1. Dispondo de dados como o da Tabela 1 aplica-se a eles uma Regresso Linear para obter a equao da curva analtica, isto , a relao funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados da Tabela 1, a equao de reta que relaciona as reas com as concentraes do V402 :
Tabela 1. Concentraes preparadas e reas obtidas para as correspondentes manchas cromatogrficas o analito o corante Vermelho 40 (V40).

C (g/L)

rea

2,8 5,7 8,4 11,2 14,1

117 135 162 194 207

O V40 um corante artificial usado em alimentos.

A = 91,7 + 8,5 C (Equao 1) Note-se que a curva analtica definida como a relao entre sinais e quantidades; no entanto, na Equao 1 as quantidades so representadas pelas concentraes das solues. Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa cromatogrfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentrao; Q = quantidade; V =volume). Usando a curva analtica Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as quantidades do analito em amostras. As amostras so aplicadas em outra placa (mesmo volume usado das solues-padro), a corrida realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de padres e as reas do analito nas amostras so determinadas. Suponhamos que para uma amostra esta rea foi estabelecida como de 184 pixeis. Este valor substituido na equao (1) da curva analtica e obtm-se a quantidade do analito na amostra (no caso a sua concentrao): 184 = 91,7 + 8,5 C; C = (184 91,7) / 8,5; C = 10,9 g L-1
250
r e a

200 150 100 50 0 0,0

2,8

Numa curva analtica interpolam-se resultados. As extrapolaes no refletem resultados efetivamente quantitativos.

A = 91,7 + 8,5 C

5,0

10,0
Concentrao (g/L)

14,1

15,0

Figura 8. Grfico da curva analtica obtida para os dados da Tabela 1.

Nesta Figura 8 esto destacados os valores inferior (2,8 g L-1) e superior (14,1 g L-1) das concentraes usadas para obter a curva analtica. O valor acima calculado C = 10,9 g L-1 intermedirio entre estes extremos. Portanto, ele foi interpolado usando-se a Equao 1. Como somente se conhece o comportamento da curva entre

aqueles extremos, somente interpolaes so vlidas para fins efetivamente quantitativos. Extrapolaes no so aceitveis. Isto uma regra geral em Qumica Analtica. A confiabilidade dos dados (e da Curva Analtica) A curva analtica obtida com dados experimentais, que sempre esto sujeitos a erros e desvios. Por isto, os dados costumam oscilar e pode ser difcil ou impossvel obter uma equao que os represente com confiabilidade. Um dos motivos a inevitvel flutuao dos volumes aplicados na placa cromatogrfica. Um recurso para contornar esta dificuldade alm do cuidado com operaes experimentais tecnicamente corretas trabalhar com dados em replicatas. Em CCD isto corresponde a, por exemplo, preparar trs placas cromatogrficas e aplicar em cada uma delas as solues de concentraes variadas dos padres. A Tabela 2 mostra que, em cada placa aplicam-se amostras com cinco concentraes: 0,3; 0,6; 0,9; 1,2 e 1,5 g L-1. Assim, por concentrao, dispe-se de triplicata das reas cromatogrficas. comum que aps obter as triplicatas calculem-se as mdias das reas correspondentes a cada concentrao, para se aplicar a regresso linear sobre estas mdias e concentraes. Sem um critrio adequado isto pode levar a erros. Tomemos como exemplo a menor concentrao e suas reas 462, 416 e 462, cuja mdia igual a 447. No entanto, uma simples inspeo visual da Tabela 2, torna evidente que a rea 416 no deve ser usada no clculo da mdia; desprezando este valor obtem-se uma mdia mais representativa, que igual a 462. O valor 416 claramente oriundo de algum erro, possivelmente devido ao volume aplicado de amostra e, se usado no clculo, descaracteriza o significado da mdia. Diz-se que ele um valor anmalo, o qual, conseqentemente, no deve ser considerado. Ocorre que na Tabela 2 existem outros anmalos, e como um conjunto de 15 dados fica difcil identificar todos eles por inspees visuais como a acima referida. No entanto existe um conjunto de critrios bastante seguro para identificar e desprezar anmalos, que baseado na Curva de Linearidade.
A representatividade de mdias sempre deve ser verificada.
placa 1 placa 2 placa 3 C(g/L) 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

Tabela 2. reas medidas em triplicatas para as cinco concentraes.

rea
462 929 1386 1843 2310

rea2
416 924 1525 1848 2079

rea3
462 924 1340 1827 2305

Mdia
447 926 1417 1839 2231

so cinco reas por placa

A Curva de Linearidade A Curva de Linearidade origina-se de um princpio bastante simples: admite-se que os dados ajustam-se a uma equao de reta do tipo y = a + b x (Equao 2), a qual tem um coeficiente angular, b, constante. Experimentalmente o que isto significa? Significa que idealmente os quocientes entre as reas medidas e correspondentes concentraes seriam constantes, como mostrado na Figura 9 (A / Q).

A/Q

Com a curva de linearidade pode-se identificar dados anmalos.

Q1 Q2 Qn

Q1

Q2

Figura 9. A Curva de Linearidade ( direita): razes A/Q (correspondentes) vs Q resultaria (idealmente) numa reta paralela com o eixo X.

Portanto, usando os dados da Tabela 3 calculam-se os valores A/C, que so plotados em relao s correspondentes concentraes. Disto resulta o grfico da Figura 10. 1386
1550 1540

1537
C (g/L)

Tabela 3. Valores de concentrao e quocientes de rea por Concentrao (A/C).

0,9

1,2(A/C) 1 1540 1549 1540 1536 1540

(A /C) 2

(A/C))) 3

0,3 0,6 0,9

0,0 1,0 2,0

1386 1540 1694 1540 1386

1540 1540 1489 1522 1537

A/C
1530 1520

1,2 1,5

Concentrao Figura 10. Curva de linearidade para os dados da Tabela 3. Os valores de A/C superiores a 1546 e inferiores a 1534 indicados com campo sombreado na Tabela 3 foram rejeitados.

Nas consideraes da Tabela 3 e da Figura 10 no indicamos porque os pontos superiores a 1546 e inferiores a 1534 foram rejeitados. Isto pormenorizado a seguir.

A rejeio sistemtica de anmalos Para rejeitar anmalos com base na curva de linearidade, usando o procedimento chamado Teste de Huber, necessrio: (1) estabelecer um valor central (linha preta na Figura 10) e, acima e abaixo dela, intervalos de confiana (linhas vermelhas) que definem quais os dados aceitveis isto , os que pertencem ao intervalo de confiana. necessrio um critrio para estabelecer o valor central de forma que ele no dependa dos dados anmalos. Isto feito obtendo-se a mediana dos dados. Para estabelecer o valor central a mediana (md) prefervel mdia, porque o valor da mediana no afetado pelos anmalos. Para obter a md ordenam-se os dados (rea/concentrao) e, no presente exemplo, como so 15 dados, a md o oitavo deles, isto 1540. Portanto, o valor central deste conjunto de A/C md = 1540, como realado na Tabela 4. O prximo passo estabelecer os intervalos de confiana. Antes, porm, uma observao: a mdia deste conjunto 1525 (marcado em vermelho na Tabela 4), um valor bastante menor do que o da md, e claramente inadequado para representar o conjunto. Estabelecendo os intervalos de confiana O primeiro passo calcular as diferenas absolutas entre cada valor de A/C e a md. Por exemplo, para o primeiro valor de A/C: | A/C1 md| = |1522 1540| = 18 (Equao 3). A seguir obtido o chamado desvio absoluto da mediana (mad) dos quinze valores |A/Ci md| e o intervalo de confiana (IC) calculado como: IC = k mad (Equao 4) onde k um fator que pode variar de 2 a 8. Para os dados em considerao mad = 3,1; usando-se k = 2 os valores do intervalo superior e do inferior, que so os limites para desprezar resultados anmalos, so obtidos por:
O intervalo de confiana representa a faixa de variao que voc deve esperar para o seu experimento. Tabela 4. Valores ordenados em quocientes de rea por Concentrao (A/C).

1525

ICs,i = md k mad = 1540 2 3,1 (Equao 5) ou seja, IC s = 1546; IC i = 1534; de forma que os dados rejeitados so destacados pelos sombreados mostrados na Tabela 5. Naturalmente esta definio de intervalos de confiana - e do critrio para rejeies de anmalos - deve ser comentada. Em primeiro lugar, o critrio parece ser excessivamente subjetivo pois, afinal, quem decide o valor de k e, portanto, da rigidez com que os dados so desprezados o analista. Mas, de fato, com bom senso o critrio deixa de ser absolutamente subjetivo. Este bom senso implica, entre outras coisas, em adicionar mais um parmetro na avaliao do resultado final (que a equao da curva analtica). Este outro parmetro chama-se resduo, rs. Quais so os dados rejeitados? Antes de discutir os resduos necessrio estabelecer quais os dados a serem rejeitados. Na Tabela 4 esto os dados A/C rejeitados, mas no com estes que se constri a curva analtica. No entanto, aos valores indicados na Tabela 5 correspondem a reas que esto na Tabela 2, que so, respectivamente, (considerando colunas-linhas): 416, 929, 1525, 2079, 1340 e 1827. Portanto, estas so as reas a serem rejeitadas. O uso dos resduos Aps eliminar os dados anmalos supe-se que os remanescentes representem adequadamente a relao existente entre rea e Concentrao com reas e concentraes que se constri a curva analtica. Portanto, a regresso linear aplicada s reas no rejeitadas da Tabela 5, obtendo-se a seguinte equao para a possvel curva analtica: A = 2,10 + 1537,7 C; r = 1,000 (Equao 6)
Os resduos representam o grau de confiabilidade de interpolao de dados com a sua curva analtica. Observe que, no teste de Huber, o estabelecimento do valor do coeficiente k no totalmente arbitrrio. Tabela 5. Reproduo da Tabela 3 indicando os dados rejeitados. C (g/L) (A/C)1 (A/C)2 (A/C)3

0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

1540 1549 1540 1536 1540

1386 1540 1694 1540 1386

1540 1540 1489 1522 1537

10

Nesta equao (6) pode-se substituir os valores das concentraes (0,3 g L-1 a 1,5 g L-1) para obter valores interpolados de reas (Aint). Ento so calculadas as diferenas relativas (%) entre estes Aint e as mdias das correspondentes reas experimentais (exp). Por exemplo, para a concentrao de 0,3 g L-1 a exp = 462 e a Aint = 463, de forma que: rs = 100 (Aint - exp)/100 = + 0,3% (Equao 7). Os valores rs (calculados para todas as concentraes) so os resduos, isto , as medidas de quanto as reas interpoladas se afastam das experimentais. Para o exemplo considerado os resduos esto relacionados na Tabela 6. Agora dispe-se de mais informaes para decidir se a escolha de k = 2 foi adequada para o critrio de rejeio. Os resduos mostrados na Tabela 6 sugerem que o erro mximo a ser cometido em interpolaes com a equao obtida para a curva analtica estariam em torno de 0,3 %. Para cromatografia em camada delgada pode-se considerar este como um resultado muito bom. Por outro lado, considerando os sinais dos resduos existe suficiente compensao entre resduos positivos e negativos. Ademais, o coeficiente de correlao obtido r = 1,000 indicativo de tima preciso da curva obtida. Portanto, pelo conjunto de argumentos acima pode-se concluir que a seleo de k = 2 foi um critrio adequado para a rejeio de resultados. O contrrio ocorreria se, por exemplo, dos 15 dados fossem rejeitados 7 ou 8; neste caso seria necessrio repetir o procedimento com k = 3 e reanalisar os resultados. Outra possibilidade e seria dos resduos uma serem excessivamente elevados apresentarem distribuio
Tabela 6. Valores de reas interpoladas e resduos.

A int 463,4 924,7 1386,0 1847,3 2308,6

rs ( %) + 0,3 - 0,1 0,0 - 0,1 0,0

claramente no-aleatria entre valores positivos e negativos (caso onde o modelo linear de calibrao no aplicvel). Estes casos poderiam sugerir erros experimentais e, inevitavelmente, a repetio de todo o procedimento cromatogrfico.

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Um resumo do procedimento Dispondo das reas cromatogrficas o que se faz (as etapas de 1 a 6 constituem o chamado Teste de Huber, baseado em medianas para rejeio de anmalos): 1. Dividir as reas pelas correspondentes concentraes, para plotar um esboo de curva de linearidade: A/C vs C. 2. Calcular a md das razes A/C. 3. Calcular as diferenas absolutas entre as A/C e md. 4. Obter a mediana mad dessas diferenas absolutas. 5. Calcular os IC = k

mad e estabelecer os limites superior e

inferior ICS,I = md k md. 6. Rejeitar as A/C de valor acima ou abaixo dos ICS,I e, conseqentemente, as correspondentes reas. 7. Aplicar a regresso linear s mdias das reas no rejeitadas e concentraes para obter uma equao para a curva analtica. 8. Substituir os valores das concentraes nesta equao para obter reas interpoladas e calcular os resduos.

Uma generalizao da curva de linearidade e um critrio mais genrico para a aplicao do teste de Huber As discusses anteriores foram baseadas no fato de que se a curva analtica obedece a uma equao do primeiro grau, A=a+b

C ou, como mostrado na equao 2, y = a + b

x, ela

tem um coeficiente angular, ou a sua primeira derivada, constante. Isto tambm aplica-se quando o coeficiente angular, b, diferente de zero, pois: ento,

b=

Aa (Equao 8). C

A equao 8 permite generalizar o critrio de quais dados aplicar o teste de Huber. Consideremos um segundo exemplo de obteno de curva analtica.

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Obtendo a Curva Analtica quando o coeficiente linear muito diferente de zero Na Tabela 7 est outro conjunto de dados obtidos por cromatografia em camada delgada. Ao calcular as razes A/C com estes dados e plota-las na forma de uma curva de linearidade obtem-se o grfico da Figura 11.
Tabela 7. reas em triplicata obtidas para as concentraes da coluna 1. C rea 1 rea 2 rea

0,3 0,6 0,9 1,2

872 1341 1796 2252 2720

785 1334 1976 2258 2448

872 1334 1737 2232 2714

A/C

4000 2000 0 0,0 0,5 1,0

Linearidade ?

1,5

1,5

2,0
C A curva de linearidade tem um aspecto de curva de segundo grau quando o coeficiente linear da curva analtica muito diferente de zero.

Figura 11. Grfico obtido com os dados de rea e concentrao da Tabela 7.

visvel na Figura 11 que inexiste uma curva de linearidade. Isto ocorre porque a correspondente curva analtica tem (como se ver a seguir) um coeficiente linear bastante diferente de zero. Em outros termos, todas as reas obtidas experimentalmente tm embutido o valor correspondente ao coeficiente linear. Isto cada rea experimental tem um componente Ai proporcional correspondente concentrao, mais um valor constante a, de forma que os quocientes A/C so sucessivamente menores,

A i + a A ii + a A +a > > n C1 C2 Cn
o que faz com que o grfico de A/C vs C tenha o aspecto no linear e decrescente mostrado na Figura 11. A generalizao vista na equao 8:

b=

Aa , C

auxilia no contorno a esta dificuldade.

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Se as quinze reas Ai, as concentraes Ci e o coeficiente linear a so substitudos nesta equao obtm-se quinze valores para o coeficiente linear a. No entanto, qual o valor de a para tais clculos, j que ele est embutido nas reas experimentais? O fato que este valor pode ser estimado aplicando-se uma regresso linear sobre os dados da Tabela 6. Esta regresso exploratria resulta na equao: A = 434,0 + 1493,4 C; r = 0,9981 (Equao 9) de forma que o provisrio a = 434,0 pode ser substitudo na Equao 9 para obterem-se valores bi correspondentes s concentraes Ci. Quando isto feito obtm-se os valores bi 1-3 listados na Tabela 8. Os valores bi da Tabela 8 (que idealmente seriam constantes), so submetidos ao teste de Huber (com k = 2) resultando na rejeio de bi = 1169, 1713, 1343 e 1447 e correspondentes valores de reas (785, 1976, 2448 e 1737) na Tabela 7. Ento, s mdias das reas remanescentes e correspondentes concentraes aplica-se a regresso linear, obtendo-se a equao da curva analtica: A = 416,5 + 1533,8 C; r = 1,0000 (Equao 10). Os resduos % calculados a partir desta Equao 9 so (respectivamente da menor para a maior concentrao): + 0,5; 0,0; 0,1; - 0,4 e 0,0, indicando que o critrio de aplicar o teste de Huber aos valores bi (obtidos com a Equao 9 a partir de um valor estimado de b conforme a Equao 10) adequado para obter uma curva analtica com coeficiente linear diferente de zero. Este critrio geral, de forma que tambm se aplica quando este coeficiente linear pode ser considerado como estatisticamente nulo.
O critrio geral baseado no fato de que uma reta tem coeficiente angular constante. Tabela 8. Valores do coeficientes angulares (b) obtidos pelas substituies de A e C (Tabela 7) na Equao 9. C (g/L)

bi 1 1460 1512 1513 1515 1524

bi 2 1169 1500 1713 1520 1343

bi 3 1460 1500 1447 1498 1520

0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

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O uso do mtodo da padronizao interna Os dois exemplos anteriores de obteno de curva analtica foram baseados no Mtodo da Padronizao Externa (MPE), isto , preparam-se vrias solues com concentraes diferentes do analito e aplica-se na placa volumes iguais destas solues (Figura 12).

C = Q / V , de onde, Q = V C

V tem de ser constante

Figura 12. Representao esquemtica do princpio do Mtodo da Padronizao Externa (MPE). O Mtodo da Padronizao Externa tem, dentre outras, uma condio rgida: os volumes aplicados devem ser iguais, o que dificilmente se consegue na prtica, de forma que as reas cromatogrficas podem oscilar substancialmente, levando a resultados como os apresentados na Tabela 9 e Figura 13.
Tabela 9. Conjunto de dados de reas e Concentraes. Os dados com sombreado foram rejeitados aps o teste de Huber. A correspondente curva analtica mostrada na Figura 13.

800

400

C (g/L)
0 0 0,5 1 1,5 2

A1

A2

A3

0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

138 277 416 553 693

180 379 457 554 624

135 258 310 548 692

A = 0,22 + 461,1 C ; r = 0,9999

Figura 13. Grfico e equao da curva analtica obtida para os dados da Tabela 9.

A curva analtica acima s tem aparncia de boa qualidade, pois ela foi obtida depois que oito dos quinze dados originais foram rejeitados pelo teste de Huber. Isto certamente demasiado, pois foram rejeitadas mais de 50 % da informao. Este problema, que ocorreu por excessiva flutuao dos volumes de amostra aplicados,

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pode ser contornado com o Mtodo da Padronizao Interna (MPI). O mtodo da padronizao interna O MPI consiste em adicionar s solues usadas para obter a curva analtica um composto, de forma que sua concentrao seja a mesma em todas as solues (Figura 14). Este composto denominado de padro interno (PI).
C= 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 O mtodo da padronizao interna atenua os problemas oriundos da incerteza do volume de amostra aplicado.

C = 0,1 Tabela 10. Triplicatas das Razes de Concentrao e Razes de rea.

Rz (C)
Figura 14. MPI: cinco solues do analito com concentraes variadas, s quais adicionado o PI em concentrao nica.

Rz(A1) 0,33 0,64 0,97 1,31 1,60

Rz(A2) 0,40 0,86 1,09 1,30 1,46

Rz(A3) 0,32 0,59 0,96 1,26 1,65

3 6 9 12 15

Depois de preparadas as solues do analito mais o PI elas so aplicadas na placa, efetua-se a corrida cromatogrfica e medemse as reas. As reas do analito (variveis) so divididas pela rea do PI (que deveria ser constante), obtendo-se as razes de rea, Rz (A). As concentraes do analito so divididas pela concentrao (valor nico) do PI, obtendo-se as razes de concentrao Rz (C). Para o exemplo em questo estes dados esto na Tabela 10. Agora a curva analtica do tipo Rz (A) vs Rz (C), supostamente uma reta. Portanto, o teste de Huber aplicado sobre os quocientes Rz (A) / Rz (C) que correspondem inclinao da curva Rz (A) vs Rz (C). Com isto so rejeitados os dados destacados em sombreado na Tabela 11. Aos dados no rejeitados aplica-se a regresso linear obtendo-se a seguinte equao de reta: Rz (A) = - 0,006 + 0,1083 Rz (C) (Equao 11) r = 0,9999

Tabela 11. Rz (C) e Rz (A) (triplicata) s quais aplicado o teste de Huber. Os dados destacados foram rejeitados.

Rz (C) 3 6 9 12 15

Rz (A1) / Rz(C) 0,110 0,106 0,108 0,109 0,106

Rz (A2) / Rz(C) 0,133 0,144 0,121 0,109 0,097

Rz (A3) / Rz(C) 0,107 0,098 0,107 0,105 0,110

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Esta equao permite interpolar razes de reas (a partir das correspondentes razes de concentrao com os seguintes resduos: -1,9; +0,6; +0,4; +0,3; -0,4. Estes resultados so melhores do que os obtidos sem o recurso do MPI, isto para os dados de reas e concentraes da Tabela 6, quando oito de quinze dados foram rejeitados. Resta Compreender o porque da melhora, o que simples: como o PI est junto com o analito em todas as solues cromatografadas, a oscilao de volume de uma aplicao para outra afeta, na mesma proporo, as reas de ambos. Portanto, quando elas so divididas o efeito da variao do volume aplicado atenuado. Finalmente, para quantificar o analito na amostra, adicionase a ela o PI na mesma concentrao usada anteriormente e, com a razo de reas obtidas para a amostra interpola-se a correspondente razo de concentraes e calcula-se a concentrao desconhecida do analito. Concluses A anlise quantitativa implica na obteno de uma curva analtica para o analito a ser quantificado. Dificilmente pode-se usar outro composto para obter a curva, porque a sensibilidade de resposta do detector (a inclinao da curva analtica) pode, alis costuma, ser tpica do composto. Com a equao da curva interpolam-se valores de quantidade (que pode ser concentrao quando o volume aplicado constante) do analito em amostras desconhecidas. Extrapolaes no so vlidas, porque o comportamento linear (s avaliamos curvas descritas por equaes do primeiro grau, que so as mais comuns) s foi estabelecido na faixa estudada. Para determinar a regio de linearidade usa-se o princpio da curva de linearidade, apoiado num mtodo de identificao e rejeio de dados anmalos os que desviam-se da linearidade por razes experimentais. Caso a curva analtica tenha coeficiente linear igual ou muito prximo de zero, a rejeio com o teste de Huber pode ser realizada com sucesso diretamente sobre os quocientes de rea por Concentrao (A/C - de fato, generalizando, Sinal/Quantidade). Existindo coeficiente linear diferente de zero mais conveniente

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aplicar o teste sobre valores do coeficiente angular. Para tal submete-se os pares rea, Concentrao a uma regresso linear para obter uma equao tentativa, com a qual interpolam-se os coeficientes angulares a serem inspecionados para rejeio como este um mtodo geral, o mais conveniente seria tambm aplic-lo para os casos de coeficiente linear igual ou muito prximo de zero. A inspeo final da qualidade e confiabilidade da curva analtica obtida envolve o clculo dos resduos, avaliando-se seus valores e sinais (pois, por exemplo, excesso de resduos negativos ou positivos sugere algum erro experimental e, consequentemente, repetio do experimento); claro que o total de dados rejeitados tambm um fator importante. Uma faixa de resduos compatvel com os recursos qumico analticos disponveis e um coeficiente de correlao prximo da unidade sugerem que o procedimento para obteno da curva analtica foi adequado. No processo acima descrito o teste de rejeio de anmalos fundamental. Propomos o uso do teste de Huber, porque ele baseado na rejeio em relao a medianas um mtodo robusto, pois independente dos anmalos. O teste de Huber implica na definio do valor do fator k pelo analista, o que no deixa de ser subjetivo. Contudo, a subjetividade baseada em conhecimentos da metodologia analtica e pode ser avaliada para vrios valores de k, buscando-se coerncia entre incertezas conseguidas com a curva analtica e as esperadas para metodologia analtica. Alm deste procedimento eliminar uma subjetividade absoluta, ele tem como grande vantagem a interao do analista com seus dados, o que certamente aumenta a sua viso da metodologia analtica que tem em mos. Finalmente, curvas analticas tem de ser obtidas com muitos dados, o que torna impraticvel rejeies por inspees visuais, assim como torna muito tedioso aplicar o teste de Huber com clculos manuais, o que sugere o uso de recursos como uma planilha eletrnica que, quando adequadamente estruturada, recalcula todos os dados quando se altera o valor de k.

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