COMPARAO ENTRE PROTOCOLOS DE EXTRAO DE DNA DE PINHO MANSO

Juliana Silva Lemes1, Laura Lemons Moreira2, Raquel Bartz Kneib3, Srgio Delmar dos Anjos4 e Silva, Joo Guilherme Casagrande Jnior5, Thas Trindade de vila1

Introduo O pinho manso (Jatropha curcas L.) uma planta perene e oleaginosa que h pouco tempo foi includa em aes de P&D (Pesquisa e Desenvolvimento) da Embrapa Clima Temperado. Ainda uma espcie no domesticada, mas com bom potencial produtivo e teor de leo, por isso fundamental desenvolver um programa de melhoramento gentico para a cultura a fim de oferecer cultivares mais produtivas e com elevado teor de leo. Para o isolamento do DNA de plantas, diferentes protocolos de extrao de DNA tm sido utilizados, no entanto, para determinadas espcies alguns protocolos no se adequam, uma vez que no conseguem a extrao do DNA ou, ento, a pureza do extrato muito baixa. Os problemas no isolamento do DNA vegetal so, geralmente, relacionados ao co-isolamento de polissacardeos, substncias fenlicas e compostos secundrios. (VIDAL et al., 2006; ROMANO, 1998) O objetivo deste trabalho foi comparar diferentes protocolos de extrao de DNA para pinho manso de modo a avaliar a quantidade e a qualidade do DNA obtido, uma vez que o mesmo dever ser empregado em experimentos de marcadores moleculares. Material e mtodos Foram testados 7 protocolos de extrao para pinho manso. Os protocolos testados foram os descritos no quadro abaixo. Quadro 1: Identificao dos protocolos de extrao testados
Cod. 1 2 3 4 5 6 7 Protocolo Edwards et al. (1991) Protocolo de Extrao de plantas para DarT (Diversity Arrays Technology) Fernndez et al. (2000) com modificaes Doyle e Doyle (1991) com modificaes Dellaporta et al. (1983) Romano (1998) com modificaes Zhang e Stewart (2000) com modificaes

Para a extrao de DNA foram amostradas folhas jovens de plantas de pinho manso mantidas em campos experimentais da Embrapa Clima Temperado, foram testadas trs amostras para cada protocolo.

1 2

B. Sc., Bolsista CNPq, julianalemoes@yahoo.com.br Graduanda Biologia UFPel, Bolsista FAPEG, lauralmoreira@hotmail.com, 3 Graduanda Agronomia UFPel, Bolsista CNPq, raquelkneib@yahoo.com.br, 4 D. Sc., Pesquisador Embrapa Clima Temperado, sergio@cpact.embrapa.br 5 D. SC., Bolsista CNPq, jgcasajr@gmail.com

As amostras, constitudas de tecidos vegetais foram congeladas utilizando nitrognio lquido e maceradas com auxlio de basto de vidro. Posteriormente foi adicionado tampo de extrao (Tabela 1) pr-aquecido 65C, com exceo dos utilizados pelos protocolos descritos por Edwards et al(1991), Fernndez (2000) e Romano (1998) em que os tampes de extrao foram mantidos temperatura ambiente. No protocolo descrito por Dellaporta (1993) aps o tampo de extrao foi adicionado 50 L de SDS 20%. Tabela 1: Concentrao dos reagentes nos tampes de extrao e volume adicionado ao tecido vegetal Reagentes (Concentrao)
Tris HCl EDTA NaCl LiCl 2-mercaptoetanol CTAB Sarcosil Sorbitol Metabissulfito de sdio SDS PVP-40 Volume de tampo

Protocolos / Concentrao dos reagentes e volume(L) 1

200mM 25mM 250mM 0,5% 400L

2
600mM 11mM 800mM 4,16% 0,83% 145mM 0,5% 2% 750L

3
10mM 20mM 0,7M 0,4M 2% 1% 1% 1000L

4
100mM 20mm 1,4M 0,2% 1% 2% 900L

5
100mM 50mM 500mM 0,2% 600L

6
200mM 22mM 800mM 0,2% 0,8% 1% 140mM 600L

7
100mM 20mM 1M 10% 2% 2% 600L

Aps a homogeneizao da mistura por inverso durante 5 minutos, as amostras foram mantidas em banho-maria a 65C durante 30 15 minutos, com exceo do protocolo descrito por Edwards (1991) em que as amostras foram mantidas temperatura ambiente. Durante a incubao as amostras foram agitadas por inverso a cada 10 minutos. Decorrido o tempo de incubao, as amostras foram retiradas do banho-maria e resfriadas temperatura ambiente, e ento, foi adicionada soluo de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1). Os protocolos descritos por Dellaporta (1993) e Edwards (1991) no utilizaram a soluo, Dellaporta (1993) substitu por 200L acetato de potssio 5M seguido de incubao em gelo por 20 minutos, j Edwards (1991) no utiliza esta etapa. Aps a adio da soluo as amostras foram agitadas por inverso por 5 minutos e centrifugadas (Tabela 2). Aps centrifugao foi retirado o sobrenadante e transferido para novo tubo identificado. No protocolo descrito por Fernndez adicionou mais uma vez a soluo extratora e aps centrifugao transferiu-se o sobrenadante novamente para outro tubo. Adicionou-se amostra 0,7 volume de isopropanol gelado e armazenou-se a 20C overnight. No protocolo descrito por Dellaporta (1993) adicionou-se 0,1 volume de acetato de sdio 3M antes da adio de isopropanol.

Tabela 2: Condies de centrifugao Velocidade (rpm)

14.000 13.000 12.000 10.000 7.000

Tempo (em minutos) por protocolo 1

1 -

2
5 -

3
5 -

4
10 -

5
5

6
10

7
5

As amostras foram centrifugadas e, retirado o sobrenadante, lavou-se o pellet com etanol 70% e 95%. As amostras foram secas temperatura ambiente e incubadas em 50L de TE e 2L RNAse por 45 minutos em banho-maria a 37C. O DNA foi quantificado por eletroforese em gel submerso de agarose 1% corado com brometo de etdio e por espectrofotometria na regio do ultra violeta(260 m e 280m). A concentrao do DNA foi calculada pela frmula: [DNA]= 50g/mL x D x A260, onde D a diluio da amostra de DNA e A260 a absorbncia lida em 260 m.(ROMAMO, 1998) A pureza da amostra medida pela razo entre as leituras em 260 m e 280m, uma amostra pura deve ter razo maior que 1,7 e menor que 2,0. (ROMANO, 1998). Resultados e Discusso A Figura 1 apresenta as concentraes de DNA mximas, mnimas e mdias em (g/L) quantificadas por espectrofotometria no comprimento de onda de 260 m, a Figura 2 apresenta a razo entre os comprimentos de onda 260 m e 280m indicando a pureza das amostras.
7.000 6.000
2,5 3

5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 1 2 3 4 5 6 7

1 1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c 4a 4b 4c 5a 5b 5c 6a 6b 6c 7a 7b 7c Protocolos/repetio

Mximo Mnimo Mdia

1,5

Figura 1: Grfico das concentraes de DNA Figura 2: Grfico das razes entre 260 m e mximas, mninas e mdias (g/L) por 280m do DNA extrado para cada protocolo. protocolo. Faixa selecionada razo maior que 1,7 e menor que 2,0, indicando as amostras puras. Na Figura 1 pode-se observar que dos 7 protocolos testados apenas o terceiro gerou amostras com concentraes inferiores a 1.000 g/L, nos demais protocolos as concentraes mdias de DNA foram superiores a 2.000 g/L.

Pelo protocolo 2 obteve-se a maior concentrao, superior a 6.000 g/L, seguido pelo protocolo 7 no qual, o maior rendimento foi superior a 5.000 g/L, porm conforme observado na Figura 2, apenas pelo protocolo 2 obteve-se duas amostras com qualidade desejada. As tcnicas de extrao descritas por Edwards et al (1991), Doyle e Doyle (1991), Dellaporta et al. (1983), Romano (1998) e Zhang e Stewart (2000), embora eficientes no rendimento do DNA extrado (Figura 1), geraram produtos de baixa pureza, indicando alto ndice de co-isolamento (Figura 2). O protocolo descrito por Fernndez, gerou produto de baixa pureza e concentrao. O protocolo de extrao de plantas para DArT foi eficaz na extrao de DNA desta cultura como se pode observar nas Figuras 1 e 2, pois apresentou elevada concentrao de DNA e amostras de boa qualidade. Concluses O protocolo mais eficiente para extrao de DNA de folhas de pinho manso o protocolo de extrao para DArT, pois gerou produtos maior pureza e concentrao. Referncia EDWARDS, K., JOHNSTONE, C., THOMPSON, C., A simple and rapid method for the preparation of genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 19, n. 6, 1349, 1991. VIDAL, M. S., COUTINHO, T. C., HOFMAN, L. V., Comparao entre protocolos de extrao de DNA para algodo, Campina Grande: Embrapa Algodo, 2003. 8p. ROMANO, E. Extrao de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO, V. T. C. (Ed.). Manual de transformao gentica de plantas. Braslia. Embrapa-SPI EmbrapaCENARGEN, 1998. p. 163-177. Protocolo de extrao de DNA de plantas para DArT (Diversity Arrays Technology). Disponvel em <http://www.DiversityArrays.com/pub/DArT_DNA_isolation.pdf>. Acesso em : 11 fev. 2008. ZHANG, J., STEWART, J.; Economical and rapid method for the extracting cotton genomic DNA. Journal of Cotton Science, Cordova, v. 4, p. 193-201, 2000. FERNDEZ, J. F., SORK, V. L., GALLEGO, G., LPEZ, J., BOHORQUES, A., TOHME, J.; Cross-amplification of microsatellite loci in a neotropical quercus species and standardization of DNA extration from mature leaves dried in silica gel. Plant Molecular Biology Reporter, Nova Zelndia, v. 18, 397-397, 2000. DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS. J. B. A plant minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, Nova Zelndia, v. 1, p. 19-20, 1983. DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, Carlsbad, v. 1, p. 1315, 1991.