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Autoras Departamento CONTENIDO Instrucciones para la recogida de muestras por los pacientes Cituria Conteo de Addis Determinacin cuantitativa de las protenas urinarias Determinacin de protenas de Bence Jones Filtrado glomerular Lic. Dania Consuegra Silverio Laboratorio Clnico
DESARROLLO Las pruebas que se realizan en este departamento son: Uroanlisis. Pruebas funcionales renales.
En el departamento se realizan anlisis de urgencia hasta las 3 p.m. El primer paso del trabajo en la seccin es la organizacin de las muestras, el registro de ellas en las hojas de trabajo y luego la realizacin del trabajo de la observacin del sedimento por el microscopio. En el caso de los anlisis minutados y de los de 24 horas como primer paso se homogeniza las muestras y se les toma el volumen para luego realizarle los anlisis qumicos como de las diluciones de las muestras para que sean mandadas a realizase en los equipos automatizados del laboratorio. Los resultados son reportados a la base de datos del Laboratorio en el da. La seccin apoya fundamentalmente los servicios de Nefrologa, Reumatologa, Medicina Interna, Cardiologa, Endocrinologa, Gastroenterologa y Hematologa. Adems, presta apoyo a otros hospitales, incluyendo Peditricos.
2 Orinar a las 10 PM en el bao y desechar esa orina; recoger toda la orina de las 8 horas siguientes (hasta las 6 AM inclusive) en una vasija ancha y verterlo con cuidado en el frasco.
Puesto de trabajo: Conteo de Addis Se organizan de forma consecutiva las muestras por orden de llegada cada uno con su identificacin. Se mide el volumen de cada muestra y se centrfuga 10 mL de orina en tubos plsticos graduados. Las rdenes organizadas se pasaran a las listas de trabajo que llevaran los siguientes datos: nombre, nmero, volumen, tiempo y los resultados de leucocitos, hemates, cilindros y albmina as como las observaciones de cada caso.
Puesto de trabajo: Nefrologa Las orinas de 24 horas se mezclan, se miden y se le separa una alcuota en un tubo de ensayo rotulado. Las muestras se separan de acuerdo a la determinacin que se le va a realizar.
3 cido sulfosaliclico 0.786 mol/L (20 %) Se pesan 20 gramos de cido sulfosaliclico y se disuelven en 100 mL de agua. Esta solucin es estable a temperatura ambiente y envasada en frascos de color mbar que garantice un correcto cierre. Tubos para ensayo de 13 x 100 o 15 x 125 mL Gradillas para los tubos de ensayos Pipeta graduada de 5 mL; vD 0,1 mL Microscopio con lente objetivo 40 y poca luz Cmara de Neubauer Pipeta Pasteur Cubreobjetos La muestra debe estar constituida por el chorro intermedio de la orina emitida inmediatamente despus de levantarse. En los anlisis de urgencias puede utilizarse la orina de emitida en cualquier momento del da o de la noche. Consta de dos partes: una para la determinacin de protena o albmina y otra para el examen microscpico del sedimento urinario.
Muestra
Procedimiento
de protena en la muestra aadiendo en un tubo de ensayo a 3 mL de orina 3 gotas de cido sulfosaliclico al 20 %. Se informa de acuerdo a la turbiedad que aparezca como: No contiene: Trazas: Contiene: Si se mantiene transparente. Si la turbiedad es mayor. Cuando forma precipitado blanco (proteinuria >1 g/L) Ligeras trazas: Si aparece una ligera opalescencia.
Examen microscpico del sedimento urinario: el examen microscpico del sedimento urinario se realiza en una cmara de Neubauer, la cual tiene 9 cuadrados de 1 mm de lado y 0,1 mm de altura.
La muestra se mezcla por rotacin o se invierte suavemente para resuspender os elementos sedimentados y con una pipeta Pasteur se carta la cmara de Neubauer (Se cubre la cmara con un cubreobjeto y la orina debe cubrir la zona cuadriculada de forma homognea o sea el
4 volumen completo de la cmara), para que los elementos se sedimentes se coloca en la platina del microscpico y se cuentan con el lente objetivo 40 y poca luz los eritrocitos y leucocitos en 4 de los 16 cuadrados de los que esta dividido cada mm de las esquinas de la cmara (los 4 cuadrados superiores) o sea en un rea total de 1 mm. Los cilindros se cuentan en el rea total ocupada por los 4 mm de las esquinas. Mtodo para los clculos La cantidad de leucocitos y eritrocitos comprendidos en un mL de orina se calcula de a siguiente manera:
Vc = 1 mm2 x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 0.0001 cm3 = 0.0001 mL dil = 1 Entonces: N = Ne x 1 mL/0.0001 mL x 1 = Ne x 10 000
N = Ne x 10 000
La cantidad de cilindros por mL de orina se calcula de la siguiente manera: C = Ce (1 mL / Vc) x dil. Donde: Ce: Vc: Vc: dil: Entonces: C = Ce x 1 mL/0.0004 mL x 1 = Ce x 2500 Es la cantidad de cilindros contados en a cmara Es el volumen de la cmara en que se contaron los cilindros 4 mm2 x 0.1 mm = 0.4 mm3 = 0.0004 cm3 = 0.0004 mL Es 1 la muestra no se diluye
C = Ce x 2 500
Se informa los resultados de la siguiente manera: Albmina: ------------No contiene [ ------------- ] x 10 000 leucocitos/mL [ ------------- ] x 10 000 eritrocitos/mL [ ------------- ] x 2 500 cilindros/mL
5 Control de la calidad Se hacen duplicados algunas muestras al azar. El resultado debe ser similar al de la muestra original. -Albmina.. -Leucocitos/mL -Eritrocitos/mL. -Cilindros/mL No contiene 0 a 10 000 0 a 10 000 0
Intervalo de referencia
Solucin de referencia: disolver 50 L con 250 L de solucin salina. Concentracin de 0.5 g/L. Aparatos, utensilios y medios de medicin Tubos plsticos de 10 mL graduados de centrfuga Tubo para ensayo de 13 x 100 15 x 125 mm Gradilla para los tubos de ensayos
6 Pipetas graduadas de 10 mL; vd 0.1: Pipeta automtica de 50L Cmara de Neubauer Cubre objeto Pipeta de Pasteur Microscopio con lente de objetivo 40 X y poca luz Foto colormetro o espectrofotmetro para leer a una longitud de onda entre 560 y 620 nm (preferiblemente de 580 nm) Cubeta de 1 mL de volumen y 1 cm de paso de luz.
Muestra
Addis de 2 horas
La muestra debe estar constituida por la orina de las dos primeras horas del da preferentemente de reposo. Mtodo de recoleccin: Descrito ms arriba.
Addis de 8 horas
La muestra debe estar constituida por la orina de las 8 ltimas horas del reposo nocturno. Mtodo de recoleccin: Descrito ms arriba.
Procedimiento Medir diuresis y anotar el volumen. Homogenizar la orina. Verter en un tubo de centrfuga graduado 10 mL de la muestra, centrifugar durante 5 minutos a 2 000 rpm. Decantar a un tubo de ensayo previamente rotulado 9 mL del sobrenadante. Resuspender el sedimento en el mL restante. Examen microscpico del sedimento urinario: Se realiza en una cmara de Neubawer. Se agita el contenido del tubo para que sea homogneo el sedimento resuspendido. La cmara, cubierta con un cubreobjetos que debe cubrir la zona cuadriculada, se carga con una pipeta Pasteur de forma homognea, o sea, el volumen completo de la cmara. Se deja en repos 3 minutos, para que los elementos se sedimenten.
7 Se coloca en la platina del microscopio y se cuentan con el lente objetivo 40 y poca luz, los eritrocitos y leucocitos en 4 de los 16 cuadrantes de los que esta dividido cada mm2 de las esquinas de la cmara (los 4 cuadrados superiores de cada mm2 de las esquinas o sea en un rea total de 1 mm 2) Los cilindros se cuentan en el rea total ocupada por los 4 mm2 de las esquinas. Determinacin de las protenas urinarias: Se realiza en la forma descrita para cituria. Si la turbiedad es de trazas o mayor, se dosifican las protenas por el mtodo de azul de Comassie: En un tubo de ensayo se vierten:
Mezclar y espear 5 minutos. Leer contra blanco reactivo a 580 nm, con cubeta de 1 mL de volumen y 1 cm de paso de luz
Grfico de calibracin Se prepara distintas diluciones de la solucin matriz para obtener 0.2; 0.5, 0.7 y g/L. Este mtodo es lineal solo hasta 1 g/L, que generalmente nos corresponde con 0.4 de extincin; por eso a valores mayores de extincin debemos diluir la orina y repetir la determinacin con orina diluida y luego multiplicar el resultado por la dilucin. Mtodo para los clculos
Proteinuria
La concentracin (C) de protenas en la orina calcularla de siguiente manera D.O (orina) C= D.O (sol. referencia) x C (sol. referencia) x dil.
La concentracin puede obtenerse tambin del grfico de calibracin. Los resultados se expresan en g/L.
En el conteo de Addis se informa las protenas en mg/min y se calcula de la siguiente forma:
Protenas excretadas/min
Diuresis (mL) g xC N de horas x 60 min 1000 =como g/1000= mg entonces Diuresis (mL) N de horas x 60 min X C (mg/mL) = Protenas (mg/min)
dil: Dilucin la orina en este caso es 1/10 (resuspendimos en 1 mL el sedimento de los 10 mL) N= N= N: Ne x 1 mL / 0.0001 mL x 1 / 10 Ne x 1 000 Expresa # de clulas por mL. N= Ne x 10 000 x 1 / 10
En el conteo de Addis se informa la cantidad de clulas que se excretan por minuto (Nm) y se calcula as: Diuresis (mL) N de horas x 60 min Diuresis (mL) N de horas x 60 min Entonces: Nm (N cel./min) = Ne x 1000 x Diuresis (mL) N horas x 60 min X N (N clulas/mL) = Nm
X N (N clulas/mL) = Nm (N cel./min)
9 Ce: Es la cantidad de cilindros contados en la cmara Vc: Volumen de la cmara en que se contaron los cilindros (Fig 2) Vc = 4 mm2 x 0.1 mm = 0.4 mm3 = 0.0004 cm3 = 0.000 4 mL Dil: Es 1 / 10 C = Ce x 2 500 x 1 / 10 C = Ce x 250 (Cilindros / mL) En el conteo de Addis se informa la cantidad de cilindros que se excretan por minuto (Cm) y se calcula as: Diuresis (mL) N de horas x 60 min Diuresis (mL) N de horas x 60 min X C (N cilindros/mL) Entonces: X 250 x Ce = Cm (N cilindros/mL)
Parmetros
Volumen Leucocitos Hemates Cilindros Protenas
Resultados
[ ---------- ] mL [ --------- ] / min [ --------- ] / min [ ---------- ] / min [ ---------- ] mg/ min
Control de la calidad: Una muestra al azar se hace por duplicado. El resultado debe ser similar al de la muestra original. Intervalo de referencia Addis de 2 horas
Parmetros
Volumen Leucocitos Hemates Cilindros Protenas
Resultados
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]
Valores referencia
mL 0 hasta 1 000 x min 0 hasta 1 000 x min 0 hasta 1 000 x min No contiene
10 Se basa en la reaccin del azul de Comassie con los grupos que componen el enlace peptdico de las protenas formando un color azul con un mximo de absorbancia en 580 nm Para la proteinuria cualitativa: cido sulfosaliclico 20 % Reactivo de azul de Comassie (reactivo de protenas) En un matraz aforado de 1 000 mL disolver 40 mg de azul de Comassie Serva G en 40 mL de metanol Aadirle 100 mL de cido fosfrico 85 % y aproximadamente 800 mL de agua destilada Aadir 30 mg de duodecil sulfato de sodio y enrasar Guardar en frasco de polietileno. protegido de la luz y a temperatura ambiente Rotular: reactivo de protena Patrn de protenas (solucin matriz) Aparatos, utensilios y medios de medicin (igual que el anterior) Muestra Una alcuota de orina homogenizada de 24 horas Homogenizar la orina y medir diuresis Guardar una alcuota de la orina rotulada Determinar cualitativamente el contenido de las protenas de la alcuota aadiendo en otro tubo 3 mL de orina con 3 gotas de cido sulfosaliclico Se compara con el tubo enumerado y se informa de acuerdo a la turbiedad que aparezca. Si la turbiedad es de trazas, o mayor, se cuantifican las protenas por el mtodo de Azul de Comassie. Si el precipitado nos indica que la concentracin de protenas es mayor que 1 g/L se diluye la orina antes de cuantificarla porque el mtodo solo es lineal hasta 1 g/L En un tubo de ensayo se vierten: Procedimiento
11
de
calibracin La solucin matriz de 3 g/L se diluye con solucin salina a 1 g/L. Se enumeran tubos del 1 al 11 y se le aaden las siguientes cantidades de solucin de calibracin para 2 mL del reactivo de Azul de Comassie.
N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Concentracin (g/L)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
D.O
0
o Se leen los tubos contra el 1 que es el blanco reactivo en un espectrofotmetro a 580 nm. Plotear las concentraciones vs. las D.O. Es lineal hasta 1 g/L. Mtodo para los clculos La concentracin C de protena en orina se calcula mediante la formula: Am C = ----------- x Cr = factor * Am Ar Donde: Factor = Cr/Ar o cotangente o pendiente Am: Absorcin de la muestra
La concentracin tambin se puede obtener del grfico de calibracin. Los resultados se expresan en g/L y se aproximan hasta las dcimas. Como esta prueba se realiza con orina de 24 horas los resultados se expresan en g/ 24 horas y se calculan as: C x Vol. 24 h/ 1000 = Conc. protenas (g)/ 24 h Control de Calidad Se controla la variacin de los resultados con un material de control adecuado (orina control). Intervalo de referencia:
De 0 a 0,15 g/24 h
Muestras
Procedimiento
Control de calidad
Muestra
Procedimiento
14 Se homogeniza la orina de 24 horas, en una probeta y se mide la diuresis, luego se rotula un tubo de ensayo y se conserva una alcuota de la orina. En una planilla se enumeran los sueros de los pacientes a los que se les ha indicado filtrado glomerular y, a continuacin, las orinas se diluyen 1 en 20 y se envan para ser procesadas en el equipo Hitachi por el mtodo de Jaff cintico. El filtrado glomerular se calcula por la aclaracin de la creatinina. La formula para el aclaramiento de la creatinina es la siguiente U crea (mol /L) x 20 x Vol. / min. 1.73 FG = ------------------------------------------- x ----------- (mL/min) P crea (mol /L) SC Donde: Urea: Pcrea: Vol/min: SC: - Concentracin de creatinina en orina diluida - Concentracin de creatinina en plasma - Volumen de orina de 24 horas / 1440 min - Superficie corporal del paciente. L (0.725) x P (0.425) x 71.84 SC = ------------------------------------------ m2 10000 Donde: L: Longitud del paciente en cm P: Peso en kg. Control de calidad Se controla la calidad de las determinaciones de creatinina Intervalo de referencia:
70-160 mL/min.