Prcticas de Biotecnologa

P1.

OBTENCIN DE PROTENAS.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la obtencin de protenas a partir de muestras naturales. Fundamento: Las protenas, debido al gran tamao de sus molculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formacin de cogulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70C o al ser tratadas con soluciones salinas, cidos, alcohol, enzimas, plantas, sustancias caotrpicas, etc. La coagulacin de las protenas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalizacin por los agentes indicados, que al actuar sobre la protena la desordenan por la destruccin de su estructura terciaria y cuaternaria. Otras tcnicas alternativas a la coagulacin son el intercambio inico y la micro y ultrafiltracin.

Material: Mechero. Tubos de ensayo. Tubos de centrfuga. Vasos de precipitados. Pipetas de 10 mL. Pipetas de Pasteur. Esptula. Placa calefactora. Centrifugadora.

Reactivos: Muestras: Procedimientos:

cido actico.

Huevo. Leche

OBTENCIN DE OVOALBMINA. OBTENCIN DEL SUERO LCTICO.

Salvador Camacho Garrido

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OBTENCIN DE OVOALBMINA: 1. De un huevo de gallina separa la yema y preserva la clara 1 . 2. Aade agua destilada y agita hasta que an quede una mezcla espesa. 3. Coloca en un tubo de ensayo una pequea cantidad de clara de huevo. 4. Aadir 5 gotas de cido actico y calentar el tubo a la llama del mechero 2 . 5. Agita hasta obtener una disolucin homognea. Caso de que existan flculos, eliminarlos mediante centrifugacin a 4000 rpm durante 5 min. Con ello se obtiene una disolucin de aprox. 5 mg/ml de protena 3 . 6. Preserva tanto las aguas madres como el centrifugado a temperatura de refrigeracin en sendos tubos de ensayo.

OBTENCIN DEL SUERO LCTICO: 1. 2. 3. 4. Toma unos 10 ml de leche. Calienta al bao mara. Aade 1 ml de cido actico. Agitando continuamente. Se forma un precipitado que contiene la casena 4 y la grasa quedando en disolucin 5 , los glcidos, las sales y las protenas solubles 6 . 5. Centrifuga. 6. Preserva tanto las aguas madres como el centrifugado a temperatura de refrigeracin en sendos tubos de ensayo.

De esa cantidad, el 10% aprox. es ovoalbmina, la protena mas abundante en la clara. 2 De forma alternativa, de una clara de huevo de gallina, toma entre 1-2 g con la ayuda de una esptula o una pipeta Pasteur. Diluye 20 veces con tampn fosfato. 3 Caso de suministrar una disolucin de albmina de 5 mg/ml, no es necesario realizar la extraccin. 4 Fosfoprotina insoluble. 5 Se denomina suero lcteo. 6 Lactoalbmina e inmunoglobulinas. Salvador Camacho Garrido

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P2.

RECONOCIMIENTO DE AMINOCIDOS Y PROTENAS.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinacin cualitativa de aminocidos, pptidos y protenas a partir de muestras naturales. Fundamento: Los aminocidos pueden detectarse con reactivos que reaccionen con sus grupos caractersticos, el carboxilo, el amino u otros de la cadena lateral. Aunque el nmero de ensayos es muy grande, uno de los ms utilizados es la deteccin con ninhidrina, que produce un color prpura que en algunos casos puede ser rosa o rojizo. Si partimos de protenas debemos hidrolizarla. La hidrlisis puede ser cida (HCl 6N/90C/18 h), bsica y enzimtica. La reaccin del Biuret la producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico (-CO-NH-) que se destruye al liberarse los aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, que en contacto con una solucin de sulfato cprico diluida, da una coloracin violeta caracterstica.

La reaccin xantoprotica es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro. Por otro lado se pone de manifiesto el azufre de los aminocidos por la formacin de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo, cuando se separa mediante un lcali, y se hace reaccionar con una solucin de acetato de plomo para formar sulfuro de plomo Material: Mechero. Tubos de ensayo. Tubos de centrfuga. Vasos de precipitados. Pipetas de 10 mL. Esptula. Placa calefactora. Cuentagotas.

Reactivos: Procedimientos:

Ninihidrina (1 mg/ml). Alanina (0,1 % en agua acidulada) Etanol. Hidrxido sdico al 20 %. Hidrxido sdico al 40 %. Sulfato de cobre al 1 %. cido ntrico. Acetato de plomo al 5 %

PREPARACIN DE NINHIDRINA. ENSAYO CON NINHIDRINA. REACCIN DEL BIURET. REACCIN XANTOPROTICA, REACCIN DE AZUFRADOS. 3

Salvador Camacho Garrido

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PREPARACIN DE NINHIDRINA: 1. Pesa 100 mg de ninhidrina. 2. Disolver en 10 ml. de etanol a 95%. 3. Completar a 100 ml con agua destilada. ENSAYO CON NINHIDRINA: 1. Rotula cuatro tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina, albmina de huevo y suero lctico. 2. A cada uno de los tubos de ensayo agrega 1 mL. de las respectivas sustancias que indica el rtulo usando agua destilada para el tubo marcado como blanco. 3. Adiciona a cada tubo 1 mL. de reactivo de ninhidrina. 4. Calienta en bao de agua a ebullicin por 10 min. 5. Observa los colores desarrollados y anote los resultados. REACCIN DEL BIURET: 1. Procede como en los puntos 1 y 2 del anterior apartado. 2. Aadir 2cc. de solucin de hidrxido sdico al 20% en cada tubo. 3. A continuacin 4 5 gotas de solucin de sulfato cprico diluida al 1% 7 . 4. Observa los colores desarrollados y anote los resultados. REACCIN XANTOPROTICA: 1. Procede como en los puntos 1 y 2 del anterior apartado. 2. Aade 1 ml de HNO3 concentrado en cada tubo. 3. Calienta al bao mara a 100 C. 4. Enfra en agua fra. 5. Aade gota a gota una disolucin de sosa al 40 % hasta alcalinizacin. 6. Observa los colores desarrollados y anote los resultados. REACCIN DE AZUFRADOS: 1. Procede como en los puntos 1 y 2 del anterior apartado. 2. Aade 2 ml. de sosa al 20%. 3. Aade 10 gotas de solucin de acetato de plomo al 5% 8 .
Debe aparecer una coloracin violeta-roscea caracterstica. 8 Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizndose el azufre de los aminocidos, lo que nos Salvador Camacho Garrido
7

4. Calentar el tubo hasta ebullicin. 5. Observa los colores desarrollados y anote los resultados.

sirve para identificar protenas que tienen en su composicin aminocidos con azufre.

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P3.

DETERMINACIN DE ENZIMAS.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinacin de enzimas a partir de muestras naturales. Fundamento: La catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolimo celular, se forma una molcula txica que es el perxido de hidrgeno, H2O2 (agua oxigenada) que es necesario eliminar. Ya que la catalasa qumicamente es una protena, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al desnaturalizarse, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada. Por otro lado, otra enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva, acta sobre el polisacrido almidn, hidrolizando el enlace O-glicosdico, por lo que el almidn se terminar por transformar en unidades de glucosa. La presencia de almidn puede ser puesta de manifiesto mediante lugol (solucin yodo-yodurada), mientras que la glucosa (azcar reductor), puede ser puesta de manifiesto mediante la reaccin de Fehling. Material: Mechero. Tubos de ensayo. Bao de agua. Pipetas. Cuentagotas. Esptula. Placa calefactora. Centrifugadora.

Reactivos: Muestras: Procedimientos:

Fehling A. Fehling B. Lugol. Almidn soluble. Perxido de hidrgeno.

Hgado de res. Saliva.

OBTENCIN DE -AMILASA. DETECCIN DE -AMILASA. DETECCIN DE CATALASA.

Salvador Camacho Garrido

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OBTENCIN DE -AMILASA: 1. Se prepara un tubo de ensayo limpio sobre el que se coloca un embudo con un filtro de papel. 2. Este filtro se humedece con suero fisiolgico hasta aparicin de alguna gota de filtrado en el tubo de ensayo de recogida. 3. Activar en lo posible la secrecin de saliva y depositar sobre el embudo un poco de saliva escupiendo suavemente. 4. Para facilitar la filtracin y fluidificacin de dicha saliva, aadir 12 ml de suero fisiolgico en el embudo y esperar que el volumen de filtrado sea de unos 10 ml sobre el tubo de ensayo 9 . DETECCIN DE -AMILASA: 1. Pon en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4. 2. Aade en cada tubo 5 mililitros de una solucin diluida de almidn (0,5 %). 3. A los tubos 3 y 4 aadir 1 ml de la solucin de amilasa obtenida de la saliva. 4. En el tubo 1, haz la reaccin de Fehling 10 . 5. En el tubo 2, realiza la Reaccin de Lugol 11 . 6. Los tubos 3 y 4 que contienen el almidn, al que le hemos echado la saliva, ponerlos al bao Mara, a unos 37 C. 7. Dejarlo unos 15 minutos. 8. A continuacin en el tubo nmero 3, realizar la Reaccin de Fehling y en el tubo nmero 4, realizar la Prueba del Lugol. 9. Anota los resultados obtenidos. 10. Explica dichos resultados. DETECCIN DE LA CATALASA: 1. Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hgado. 2. Aadir 5 mililitros de agua oxigenada de 10 volmenes 12 . 3. Observa y anota el resultado
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4. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado. 5. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. 6. Despus de este tiempo, retirar el agua sobrante. 7. Aadir el agua oxigenada. 8. Observar y anota el resultado. 9. Interpreta la diferencia.

Puede utilizarse -amilasa 0.2 mg/ml. A 5 ml de la solucin de azcar agregarle 10 gotas de reactivo de Fehling A (7 g de sulfato cprico monohidrato en 100 ml de agua destilada)y 10 gotas de Fehling B (35 g de tartrato de sodio y 10 g de hidrxido de sodio en 100 ml de agua destilada), calentar a ebullicin por 1 minuto. Positivo: precipitado naranja a rojo. 11 En un tubo de ensayo unos 5 ml del glcido a investigar, aadir unas gotas de lugol (solucin de I2 al 1% en equilibrio con KI al 2% en agua destilada). Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azulvioleta, la reaccin es positiva. 12 Preferiblemente recientemente preparada. Salvador Camacho Garrido
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P4.

DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE UNA PROTENA.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinacin del punto isoelctrico (PI) de protenas a partir de muestras naturales. Fundamento: La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico) y representa del 77% - 82% de las protenas y el 2,7% en composicin de la leche lquida. Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos. Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente cido debido a que los grupos COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estaran protonados (-NH3+). De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto estara cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estaran desprotonados (-COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (-NH2). De lo anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin. Esta medida de la agregacin puede visualizarse por espectrofotometra de absorcin a 640 nm. Material: Reactivos: Muestra: Procedimientos:
AISLAMIENTO DE LA CASENA. PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE CASENA. PREPARACIN DE TAMPONES Y MEDIDA DEL pH. DETERMINACIN DEL PI. 7

Vasos de precipitados. Pipetas. Probeta. Matraces aforados. Embudo de vidrio. Papel de filtro. Termmetro. Placa calefactora. pH-mtro. Espectrofotmetro V. Cubetas de 1 cm de paso.

cido actico. Acetato sdico. Hidrxido sdico. ter etlico. Etanol (70%). Soluciones tampn (calibrado pH-mtro).

Leche de vaca entera.

Salvador Camacho Garrido

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AISLAMIENTO DE LA CASENA: 1. Calienta en un vaso de precipitado 150 ml de agua destilada a 38C. 2. Aade 50ml de leche. 3. Luego gota a gota y con agitacin, adiciona cido actico 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). 4. Deja sedimentar. 5. Filtra sobre papel. 6. Lava el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro. 7. Seca el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro. 8. Coloca el precipitado en un vaso pequeo y previamente tarado. 9. Pesa el vaso con el precipitado. 10. Adicione 5 ml/g de ter etlico. 11. Filtra nuevamente. 12. Desecha el lquido quedando un precipitado blanco de fcil manipulacin que es la casena. DISOLUCIN DE LA CASENA: 1. Pesa aproximadamente 0,2500 g de casena en un vaso de 50 ml. 2. Agrega 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N. 3. Agita hasta lograr una solucin total de la casena. 4. Aforada a 50 ml, con 5 ml de cido actico 1N y agua destilada 13 . PREPARACIN DE MEDIDA DEL pH: TAMPONES Y

homognea antes de verter una parte en la cubeta. 4. Anota los resultados. 5. Representa la absorbancia frente al pH. 6. Determina el pI aproximado de la casena 15 .

Electroforetrograma de la leche

Estructura micelar de la casena

5. Se debe preparar disoluciones de tampn de cido actico / acetato sdico, que cubran un rango de pH suficiente para la casena 14 . 6. Calibra el pH-mtro. 7. Mide el valor del pH de cada tampn. DETERMINACIN DEL PI: 1. Aade 1 ml de disolucin de casena a cada tubo. 2. Agita suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. 3. Mide la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetra de 1 cm de paso ptico, teniendo la precaucin de agitar bien el contenido de cada tubo para obtener una solucin/suspensin
La solucin debe ser clara y limpia y si no es as, debe volver a filtrar. 14 De 3,0 a 6,5 mnimo. . Salvador Camacho Garrido
13

15

Su punto isoelctrico promedio es de 4,6.

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P5.

SEPARACIN CROMATOGRFICA DE AMINOCIDOS.

e

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la separacin cromatogrfica identificacin de aminocidos a partir de mezclas de los mismos.

Fundamento: La cromatografa es una tcnica muy empleada para separar e identificar los componentes de una mezcla. La separacin se basa en la diferente interaccin de cualquier soluto con dos fases, una conocida como fase estacionaria, generalmente slida, y otra denominada fase mvil, que puede ser lquida o gaseosa. Debido a procesos como adsorcin en la fase slida, solubilizacin y arrastre por la fase mvil etc., cada soluto se distribuye entre las dos fases con un coeficiente de reparto caracterstico. Este coeficiente depende de la naturaleza de las fases y de los solutos, o componentes de la mezcla a separar. La cromatografa en capa fina (TLC) es una de las ms sencillas. Se denomina as porque la fase estacionaria es una capa fina de una sustancia hidroflica (slice, almina o acetato de celulosa) colocada sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones que migra por la fase estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se encuentra saturada de vapor de la fase mvil. En este tipo de cromatografa se utiliza un parmetro relacionado con el coeficiente de reparto, que se denomina Rf. Se define como la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por la fase mvil. En el caso de esta prctica, es directamente proporcional con la solubilidad de la sustancia en la fase mvil. Sus valores oscilan entre 0, para las sustancias insolubles, y 1 para las sustancias muy solubles en la fase mvil y que no interacciona con la fase estacionaria. En esta prctica, la cromatografa en capa fina se utiliza para separar e identificar aminocidos. Estos se revelarn en la placa mediante reaccin con ninhidrina. Material: Cubeta cromatogrfica. Vasos de precipitados. Pipetas. Matraces aforados. Capilares.

Reactivos: Muestras: Procedimientos:

Ninhidrina. n-propanol. Hidrxido amnico. Etanol. Aminocidos.

Mezcla de aminocidos.

PREPARACIN DE DISOLUCIONES. PREPARACIN DE LA PLACA. DESARROLLO. REVELADO E IDENTIFICACIN.

Salvador Camacho Garrido

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PREPARACIN DE DISOLUCIONES: Prepara la cantidad necesaria, de las disoluciones a utilizar, disolucin de patrones y mezcla problema, eluyente (en dos etapas) y solucin reveladora 16 .

PREPARACIN DE LA PLACA: 1. Sobre una placa de silicagel de 10 x 10 cm se traza con un lpiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de ste de 2 cm 17 . 2. Sobre esta lnea se pone n+1 puntos equidistantes entre si y sobre los bordes 18 . 3. En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminocidos) se aplicarn tres gotas de la solucin de aminocidos y solucin problema (un aminocido en cada punto y en el ltimo la solucin problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca con un secador de pelo despus de haber aplicado cada gota. 4. Se marca con lpiz, y en el extremo opuesto de la placa, algn indicativo del grupo que realiza la cromatografa.

DESARROLLO: 1. Se aade al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. 2. Se mete la placa en el tanque, se tapa. 3. se deja desarrollar la cromatografa hasta que el eluyente alcance el borde superior, (1-2 h aproximadamente) 19 .
16 17

Solucin reveladora (se prepara el da de uso). No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que la contaminaramos con aminocidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolgrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marquis. 18 Donde n es el nmero de patrones a utilizar. Salvador Camacho Garrido

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Sin llegar a sobrepasarlo.

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REVELADO E IDENTIFICACIN: 1. Terminada la cromatografa se saca la placa. 2. Se marca la distancia recorrida por el eluyente. 3. Se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire 20 . 4. Se roca con un pulverizador que contiene la solucin reveladora (en la campana de gases). 5. Mide las distancias necesarias para calcular el valor del Rf de cada uno de los componentes de la mezcla, y de los patrones usados. 6. Identifica los componentes de la mezcla.

20

La placa se secar hacindole llegar aire caliente con el secador. Salvador Camacho Garrido

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P6.

SEPARACIN ELECTROFORTICA DE PROTENAS.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la separacin electrofortica de protenas a partir de muestras naturales. Fundamento: La electroforesis es una tcnica basada en los movimientos de molculas cargadas en un campo elctrico, cada molcula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (ctodo y nodo), este movimiento denominado electroforesis da nombre a la tcnica. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables (principalmente - COO- y -NH3+) pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. Adems de sobre papel y en gel se puede utilizar como soporte tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorcin mnimas, por lo que se evita la formacin de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Las protenas de suero se pueden separar mediante esta tcnica. Sus puntos isoelctricos estn entre 4,9 (Albmina) y 7,4 (Gamma-globulinas). Al realizar la electroforesis con un tampn de pH = 8,6, todas las protenas del suero tendrn carga negativa.

Material: Tiras de acetato de celulosa. Cubeta electrofortica. Fuente de alimentacin de electroforesis. Matraces aforados. Balanza analtica. Pinzas. Aplicador. Rodillo. Papel de filtro.

Reactivos: Muestra: Procedimientos:

Tris base [tris(hidroximetil)aminometano]. Glicina. Negro amido. cido actico. Metanol.

Plasma (de rata o humano).

PREPARACIN DE DISOLUCIONES. PREPARACIN DEL SOPORTE. ELECTROFORESIS. REVELADO. MEDIDA. 13

Salvador Camacho Garrido

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PREPARACIN DE DISOLUCIONES: Tampn: Tris 0,025 M, glicina 0.192 M pH=8,6

Solucin de tincin:
0.5% (p/v) negro amido en metanol 45% (v/v) + cido actico10% (v/v)

Solucin de distincin:
Metanol 45% (v/v) + cido actico 10% (v/v) PREPARACIN DEL SOPORTE: 1. Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para su equilibrado. 2. Eliminar el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. 3. Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie penetrable quede hacia la parte superior 21 . ELECTROFORESIS: 1. Depositar con ayuda del aplicador dos muestras de suero en cada tira, en el extremo prximo al ctodo. 2. Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 200 voltios. 3. Mantn durante 60 minutos. REVELADO: 1. Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con solucin de tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10 minutos. 2. Lavar las tiras en solucin de destincin hasta que se observen bien las bandas de protena (azules) sobre un fondo blanco. 3. Limpiar las tiras en agua del grifo durante unos segundos. 4. Colocar las tiras entre 2 lminas de transparentes, eliminando las burbujas con un rodillo. MEDIDA: 1. Escanear las electroforesis.
21

2. Realizar el clculo del porcentaje de las protenas del plasma el programa informtico scion image. 3. Calcular los porcentajes relativos de las protenas contenidas en suero, a partir del escaneado. 4. Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto de aplicacin de la muestra. 5. Identificar las protenas que corresponden a cada banda y justificar el orden.

bandas

obtenidas

por

El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha. Salvador Camacho Garrido

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P7.

CUANTIFICACIN DE PROTENAS.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinacin cuantitativa de protenas a partir de muestras naturales. Fundamento: Las protenas pueden medirse por espectrofotemtra de absorcin UV a 280 nm. No obstante es mucho ms sensible usar reacciones de coloracin. Las protenas pueden determinarse mediante espectrofotometra visible, hacindolas reaccionar con reactivos que den de forma cuantitativa productos coloreados, utilizando la interpolacin en una curva de calibrado. Los procedimientos a utilizar varan en funcin del mtodo de coloracin y de eliminacin de interferencias, pudiendo citarse como los ms utilizados los mtodos de Bradford, Lowry, Lowry HEPES y Lowry TCA. Se emplea un colorante hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende, pues de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y lquidos orgnicos como el metanol. El mtodo de Bradford utiliza, como colorante azul de Coomassie G250, patrn de protena la -globulina bobina o seroalbmina bovina (BSA) y mide la absorbancia a 595 nm. Material: Vasos de precipitados. Pipetas. Esptula. Matraces aforados. Balanza analtica. Espectrofotmetro V. Cubetas de 1 cm de paso. Cuentagotas. Papel de filtro de alta calidad.

Reactivos: Muestra: Procedimientos:

Azul de Coomassie G250. Albmina de suero bovino (BSA). Etanol. cido fosfrico.

Leche de vaca desnatada.

PREPARACIN DEL REACTIVO DE BRADFORD. PREPARACINDE LA SOLUCIN PATRN MADRE DE BSA. PREPARACIN DE PATRONES. PREPARACIN DE DISOLUCIONES PROBLEMAS. REACCIN DE COLORACIN. MEDIDA.

Salvador Camacho Garrido

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Prcticas de Biotecnologa

PREPARACIN BRADFORD:

DEL

REACTIVO

1. Pesa 100 mg de azul de Coomassie G250 en 50 ml de etanol del 95% 22 . 2. La solucin despus se mezcla con 100 ml de cido fosfrico del 85%. 3. Llevar a 1 L con agua destilada. 4. El reactivo se debe filtrar a travs del papel de filtro de Whatman N 1 y despus guarda en una botella mbar a temperatura 23 ambiente . PREPARCIN ALBMINA: DEL PATRN DE

3. Calcula para cada dilucin de la muestra su concentracin. 4. Teniendo en cuenta los volmenes utilizados en cada caso, calcula el contenido protico de la leche. 5. Obtn el valor medio de la leche expresado en g de protenas por cada 100 mL de leche. 6. Calcula la absortividad del complejo coloreado para el BSA 27 .
Reactivo de Bradford

Disolver 100 mg de albmina bovina en 100 ml de agua destilada 24 . PREPARACIN DE PATRONES DE LA CURVA DE CALIBRADO: Se debe preparar disoluciones que contengan de 0 (blanco) a 60 g/ml en agua destilada a un volumen final de 25 ml 25 . PREPARACIN DE LAS DISOLUCIONES PROBLEMAS: 1. Hacer una dilucin 1:20 de la leche comercial. 2. A continuacin realizar tres diluciones diferentes 5:100, 7:100 y 10:100 para un volumen final de 100 ml 26 . REACCIN DE COLORACIN: 1. Tanto a las disoluciones patrones como a las diluciones problemas se le debe aadir colorante en la proporcin 1:10. 2. Agita y deja reposar. MEDIDA: 1. Mide las absorbancias de todas las disoluciones coloreadas frente al blanco a 595 nm. 2. Realiza la recta de calibrado, preferentemente por regresin lineal.
22

Disoluciones patrones

Disoluciones de la muestra

Curva de calibrado
Curva de calibracin Bradford Std.
0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 Absorba ncia.

0,333 0,172 0,046 0

5 10 15 20 Masa de protena [ug] 25 y = 0,0168x R2 = 0,9873

0,082

No confundir el Coomasie G-250 con el Coomasie R250. 23 Es estable por varias semanas. Sin embargo, durante este tiempo el colorante puede precipitar de la solucin y as por tanto el reactivo guardado se debe filtrar antes de uso. 24 Con lo que tenemos una disolucin madre con una concentracin de 1 mg/ml. En general se suele comprar como patrn. 25 El mtodo propone a volumen final de 300 l. 26 El mtodo propone a volumen final de 300 l. Salvador Camacho Garrido

27

la albmina del suero vacuno es 0,66.

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Prcticas de Biotecnologa

P8.

EXTRACCIN DE ADN.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la obtencin de ADN a partir de muestras naturales. Fundamento: La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas, y separado de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico, probablemente el nico reactivo de esta prctica que no suele haber en una cocina.

EXTRACCIN

Material: Mortero de vidrio. Probeta. Vasos de precipitados. Pipetas. Varilla de vidrio. Filtro de tela.

Reactivos: Muestras: Procedimientos:

Dodecil sulfato sdico (SDS). Cloruro de sodio. Alcohol de 96. Alcohol isoamlico. Azul de metileno.

Higadito de pollo.

SEPARACIN DE NUCLEOS. SEPARACINDE CROMATINA. ELIMINACIN DE PROTENAS. EXTRACCIN DE ADN.

Salvador Camacho Garrido

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SEPARACIN DE NCLEOS: 1. Triturar medio higadito de pollo en un mortero. 2. Aadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas de y queden los ncleos sueltos. 3. Aadir al triturado, 50 ml de agua. 4. Remover hasta hacer una especie de papilla o pur. 5. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper. SEPARACIN DE CROMATINA: 1. Medir el volumen del filtrado con una probeta. 2. Aadir al filtrado un volumen igual de cloruro sdico 2M 28 . ELIMINACIN DE PROTENAS: A continuacin se aade 1 ml de SDS 29 . EXTRACCIN DE ADN: 1. Aadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96 30 . Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. 2. En la interfase, precipita el ADN. 3. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma direccin. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupacin de muchas fibras de ADN. 4. observa con lupa binocular y si tienes tiempo tie con un colorante bsico 31 y observa al microscopio.
Si queremos usar DNA de mayor pureza, por ejemplo para su cuantificacin, se debe purificar o reextraer usando fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1) otra vez. El envase con el DNA se debe almacenar, en caso necesario, en un refrigerador 4C.
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Con ello conseguimos producir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina. 29 Si no se dispone de este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas, tipo Mistol o similar. La accin de este detergente es formar un complejo con las protenas y separarlas del ADN. As nos quedar el ADN libre de las protenas que tiene asociadas. 30 Mejor alcohol isoamlico a 0 C. 31 Por ejemplo hematoxilina (Hematoxilina de Mayer 10-15 min. y lavar bajo flujo de agua corriente hasta azulear), o azul de metileno. Salvador Camacho Garrido

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P9.

ELECTROFORESIS DE ADN.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la electroforesis de ADN a partir de muestras naturales. Fundamento: La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. Material: -

Reactivos: Muestras: -

Micropipetas. Matraz aforado. Erlenmeyer. Placa calefactora. Equipo de electroforesis. Transluminador UV. Cmara fotogrfica sensible.

Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano]. EDTA (sal disdica). cido brico. Agarosa. Bromuro de etidio.

Extracto De ADN (P8 u otro).

Procedimientos:
PREPARACIN TAMPON TRIS BRICO EDTA PREPARACIN DEL GEL DE AGAROSA PREPARACIN DEL ADN ELECTROFORESIS

Salvador Camacho Garrido

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PREPARACIN DEL TAMPN TBE: Prepara un litro de tampn TBE (Tris borato a pH 8). PREPARACIN DEL GEL DE AGAROSA: 1. Se vierten en un matraz 30 ml del tampn de electroforesis TBE y 0,21 g de agarosa (0,7 %). 2. Se funde la solucin de agarosa en un microondas o placa calefactora. 3. Se deja enfriar la suspensin hasta que alcance unos 50C aproximadamente. 4. Se sella con cinta adhesiva el soporte donde se va a verter el gel de agarosa y se coloca el peine que servir para formar los pocillos del gel. 5. Una vez que la solucin de agarosa ha alcanzado los 50C, se le aaden 2 L de bromuro de etidio (10 mg/ml) y se mezcla bien. PONEROS GUANTES!!! 32 6. Se vierte la solucin de agarosa con bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 30 minutos. PREPARACIN DEL ADN: Se toman 20 l del DNA aislado y purificado y se le aaden 5 l de tampn de carga. ELECTROFORESIS: 1. Se quita la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y se coloca en la cubeta de electroforesis 33 . 2. Se aade tampn de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel de agarosa. 3. Se aplican 10 l de la muestra preparada en el apartado anterior en dos de los pocillos. 4. Se aplican 10 l de marcadores de peso molecular en dos de los pocillos 34 . 5. Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de alimentacin. Se comprueba que est bien conectada. 6. Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la electroforesis que durar unos 30-45 minutos. 7. Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografa de la imagen.
El bromuro de etidio agente intercalante y alquilante es un conocido carcinognico, por lo que es obligado el uso de guantes y de la vitrina extractora. 33 OJO!!: Los pocillos deben de estar cerca del ctodo (polo negativo, color negro). 34 Si se poseen. Salvador Camacho Garrido
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Tampn

Visualizacin

Nota: Si se dispone de ms de un marcador se puede utilizar para el clculo del peso molecular de los fragmentos de ADN segn la grfica:

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P10. CUANTIFICACIN DE ADN.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la cuntificacin de ADN a partir de muestras naturales. Fundamento: Para la cuantificacin del ADN, existen dos mtodos indirectos que permiten estimar la concentracin del ADN en las muestras, por visualizacin y mediante espectrofotmetro. El mtodo indirecto ms recomendable para la determinacin de la concentracin de ADN en una muestra es mediante la visualizacin de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas. No obstante se puede efectuar una estimacin mediante espectrofotometra UV. La longitud de onda de mxima absorcin es de 260 nm, pero desgraciadamente a esa longitud de onda tambin absorben las protenas que pudieran impurificar la muestra, por lo que se recurre a medir las absorbancias a 260 nm y 280 nm. Para determinar pureza, se utiliza la razn de ADN/protenas. Un buen ADN (calidad y pureza) es aquel cuyo A260/A280 es de 1.7 a 2.0. La abundancia de protenas residuales en el extracto se determina midiendo absorbancia a 260 nm: g/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilucin X 50 g ADN/ml)

Material: Vasos de precipitados. Pipetas. Matraz aforado. Agitador magntico. Espectrofotmetro UV. Cubetas de cuarzo de 1 cm de paso.

Reactivos: Muestras: -

Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano]. EDTA (sal disdica). cido clorhdrico. Sucrosa. Fenol. Cloroformo. Isopropanol.

Extracto De ADN (P8 u otro).

Procedimientos:
PREPARACIN TAMPON TRIS EDTA SUCROSA PURIFICACIN DE ADN .DILUCCIN DE ADN MEDIDA DE ADN 21

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PREPARACIN SUCROSA 35 :

TAMPN

TE-

1. Pesa 1,21 g de Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano] en un vaso de precipitados de 1 l. 2. Disuelve con ayuda de agitador magntico. 3. Ajusta el valor del pH hasta aproximadamente 8 con cido clorhdrico 36 . 4. Aade 0,29 g de EDTA (sal disdica anhidra) y disuelve. 5. Aade 250 g de sucrosa 37 y disuelve. 6. Afora a 1 L con agua destilada. PURIFICACIN DE ADN 38 : 1. Suspende el ADN bruto obtenido en la prctica anterior en agua. 2. Aade un volumen igual de fenol / cloroformo / alcohol isoamlico (25:24:1) 39 . 3. Centrifuga. 4. Elimina el sobrenadante totalmente. 5. Suspende en agua. 6. Incuba a 65 C durante 5 minutos. 7. Conserva a temperatura de refrigeracin. DILUCIN DE ADN: Prepara una disolucin 1:20 purificado con TE-Sucrosa. MEDIDA DE ADN: 1. Llena una cubeta de cuarzo con la disolucin de ADN en TE-Sucrosa. 2. Llena otra con solucin de TE-Sucrosa. 3. Mide las absorbancias a 260 y 280 nm de la primera cubeta utilizando como blanco la segunda. 4. Anota los resultados: del ADN

g ADN/ml g = (Abs260 X 20 X 50 g ADN/ml)/(volumen muestra [ml o g])

5. Calcula la concentracin de ADN. En la muestra original. 6. Estima la cantidad total de ADN referida a la muestra.
g/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilucin X 50 g 40 ADN/ml )

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Solucin de TE-sucrosa (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8, 25% sucrosa). 36 Se necesitan aproximadamente unos 42 ml. 37 Tambin denominada sacarosa o dextrosa. 38 Como alternativa puede usarse algn protocolo de extraccin total de ADN. 39 Como alternativa puede usarse isopropanol absoluto a -20 C. 40 50 mg ADN/ml es un factor de conversin. Salvador Camacho Garrido

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P11. DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO Y COMPATIBILIDAD.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicacin de las tcnicas inmunolgicas para diferentes determinaciones a partir de muestras naturales. Fundamento: Un grupo sanguneo es una forma de agrupar ciertas caractersticas de la sangre que dependen de los antgenos presentes en la superficie de los glbulos rojos y en el suero de la sangre. Las dos clasificaciones ms importantes para describir grupos sanguneos en humanos son los antgenos y el factor Rh. Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el suero de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tienen la combinacin contraria, glbulos rojos con antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el suero de su sangre. Los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antgenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. A causa de estas combinaciones, el tipo 0 puede ser transfundido sin ningn problema a cualquier persona con cualquier tipo AB0 y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo AB0. En 1940, el Dr. Landsteiner descubri otro grupo de antgenos que se denominaron factores M. Rhesus (factores Rh), porque fueron descubiertos durante unos experimentos con monos Rhesus. Las personas con factores Rhesus en su sangre se clasifican como Rh positivas; mientras que aquellas sin los factores se clasifican Rh negativas. Las personas Rh negativas forman anticuerpos contra el factor Rh, si estn expuestas a sangre Rh positiva. El Factor Rh es una protena integral de la membrana aglutingena que est presente en todas las clulas. Un 85% de la poblacin tiene en esa protena una estructura dominante, que corresponde a una determinada secuencia de aminocidos que en lenguaje comn son denominados habitualmente Rh+. Rh- es tener la misma protena pero con modificaciones en ciertos aminocidos que determinan diferencias significativas en la superficie de los glbulos rojos, y hacen a los humanos Rh- disponer de anticuerpos (aglutininas) en el plasma que reaccionan con los glbulos rojos Rh+. La determinacin ms simple del sistema ABO (+, -) es utilizar la tcnica de hemoaglutinacin, que puede hacerse tanto en placa como en tubo, y consisten en poner en contacto la sangre (o una dilucin de la misma) en contacto con antisueros A, B, AB (o mezcla A +B), y D y observar si existe o no aglutinacin.

Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccin inmunolgica que puede desembocar en hemlisis, anemia, fallo renal, shock, o muerte. Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles. El grupo O- es compatible con todos, por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universal. Por otro lado, una persona cuyo grupo sea AB+ podr recibir sangre de cualquier grupo, y se dice que es un receptor universal La transfusin de sangre de un Rh+ a un Rh- que no tiene dicho aglutingeno induce la formacin de anticuerpos, que en sucesivas donaciones puede aglutinar la sangre (formar grumos). De ah que en las donaciones de sangre y rganos se tenga en cuenta dicho factor. Es necesario por tanto tener un procedimiento sencillo en el laboratorio para determinar la compatibilidad sangunea, el ms simple de los cuales es el test cruzado de Coombs.
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Tabla de compatibilidad entre grupos sanguneos

Donante O- O+ B- B+ A- A+ AB- AB+ AB+ ABA+ AB+ BO+ OX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Receptor

La prueba cruzada de la sangre del donador con la del receptor puede constar de dos partes, conocidas como fase mayor y fase menor. La fase mayor consiste en mezclar los eritrocitos del donador con el suero del receptor tanto en presencia como en ausencia del suero de Coombs, mientras la fase menor consiste en mezclar los glbulos rojos del receptor con el suero del donador, con y sin el suero de Coombs. La fase mayor recibe ese nombre por que permite descubrir en el suero del receptor los anticuerpos que suelen presentar la causa ms comn de las reacciones hemolticas graves o fatales ante las transfusiones. La reaccin a la transfusin suele ser leve, cuando se debe a incompatibilidad en la fase menor de la prueba cruzada. Material: Tarjetas sanguneas. Pipetas Pasteur. Tubos de centrfuga. Centrfuga. Placa de toques. Lupa binocular.

Reactivos: Muestras: -

Suero salino. Suero anti-A. Suero anti-B. Suero anti-D (anti-Rh).

Sangre.

Procedimientos:
PRUEBAS CRUZADAS. DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO.

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PRUEBAS CRUZADAS (salina) 41 : 1. Hacer una extraccin de 3 ml de sangre al donador y receptor. 2. Preparar una suspensin al 5% de glbulos rojos en suero fisiolgico en un tubo de hemlisis, tanto del donador como del receptor. 3. Dejar coagular la sangre, desprender el cogulo por medio de un aplicador, centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos, separar el suero por medio de una pipeta Pasteur de ambos tubos. 4. Marcar tres tubos de la siguiente manera: Ds (prueba mayor), Rs (prueba menor) y Ts (autotestigo). 5. Al tubo Ds colocar dos gotas de suero del receptor ms una gota de glbulos rojos del donador y mezclar. 6. Al tubo Rs colocar dos gotas de suero del donador ms una gota de glbulos rojos del receptor y mezclar. 7. Al tubo Ts colocar dos gotas del suero del donador ms una gota de glbulos rojos del donador 42 . 8. Centrifugar los tubos Ds Rs y Ts a 3400 r.p.m. durante 30 segundos y observar si hay aglutinacin. 9. Mezcle y centrifugue a 340 r.p.m. durante 30 segundos y observe si hay aglutinacin. 10. Anota los resultados. DETERMINACIN SANGUNEO: DEL GRUPO

En Tarjeta:
1. Prepara una tarjeta con cartulina normal y cartulina plastificada (en amarillo segn la imagen). 2. Colocar en la tarjeta una gota se suero antiA, una de anti-B, una mezcla de anti-A y anti-B, y una gota de anti-D, cada una en su casilla correspondiente. 3. Desinfecta o mejor esteriliza un alfiler de diseccin. 4. Pinchar la yema del dedo, previa desinfeccin con alcohol o agua oxigenada. Depositar una gotita de sangre en cada casilla y mezclar con los sueros. 5. Observar los resultados. 6. Determina el grupo sanguneo.

41 42

Puede realizarse con albmina y solucin liss. Tambin puede hacerse con el receptor. Salvador Camacho Garrido

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5. Centrifuga a 1000 r.p.m. durante un minuto o bien a 3500 r.p.m. durante 30 segundos. 6. Resuspenda los glbulos rojos con agitacin ligera. 7. Observa si hay hemoaglutinacin.

En Placa:
1. Prepara una suspensin de glbulos rojos al 2% en solucin salina fisiolgica, (al 0.85% o 0.9%), o bien proceder con sangre total. 2. Coloca una gota de sangre total en cinco 43 excavaciones de una placa, previamente marcadas para no confundirse. 3. Aada a la primera gota de sangre una gota de suero anti-A, a la segunda, una gota de suero anti-B, a la tercera una gota de suero anti-AB 44 y a la cuarta una gota de suero anti D o Rh. 4. Con ayuda de un aplicador de madera mezcla cada uno de ellos (debe emplearse, un segmento de aplicador para cada uno). 5. Agita suavemente cada una de las placas o la placa con movimientos suaves y circulares de balanceo durante 30 segundos aproximadamente. 6. Lea el resultado; si hay duda, deje reposar la placa por un minuto aproximadamente y lea nuevamente la hemoaglutinacin 45 .

En tubo:
1. Prepara una suspensin de glbulos rojos al 2% en solucin salina fisiolgica al 0.85%. 2. Adicionar una gota de suspensin de glbulos rojos a cada uno de los cinco 46 tubos, previamente marcados. 3. Agregar a cada tubo dos gotas de suero anti -A, anti-B, anti-AB y anti-D respectivamente. 4. Mezcla.
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Un tubo ser el testigo. O una gota de anti-A y otra de anti-B. 45 Para una mejor visualizacin puede emplearse una lupa binocular. 46 Un tubo ser el testigo. Salvador Camacho Garrido

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P12. DETERMINACIN DEL EMBARAZO.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicacin de las tcnicas inmunolgicas con anticuerpos monoclonales para diferentes determinaciones a partir de muestras naturales. Fundamento: La deteccin de la gonadotropina corinica humana (hCG) constituye el fundamento de las pruebas inmunoqumicas realizadas en suero y orina para el diagnstico del embarazo normal o patolgico. Esta hormona se produce, en condiciones normales, por el tejido trofoblstico de la placenta y pertenece a la familia de las gonadotropinas glucoproticas, tiene alta homologa estructural con la hormona luteotrpica (hLH) con la cual comparte no slo la subunidad alfa, como el resto de las hormonas glicoproteicas de origen pituitario, sino gran parte de la beta. Los inconvenientes analticos asociados a la similitud estructural de la hCG y LH que ocasionaron en el pasado confusiones entre el diagnstico de embarazos, picos ovulatorios y amenorreas posmenopusicas, fueron erradicados con la aplicacin, en este campo, de los anticuerpos monoclonales (AcM) frente a la fraccin .

La mayor parte de las pruebas emplean un anticuerpo monoclonal (MAb) especfico de la subunidad de la hCG (hCG). Este procedimiento se emplea para asegurar que las pruebas no dan falsos positivos por confusin de la hCG con la LH y la FSH. Estas dos ltimas estn siempre presentes en diferentes niveles en el cuerpo, mientras que la presencia de hCG casi siempre indica el embarazo. Estos test detectan la presencia de la hormona gonadotropina corinica humana (HCG) en la orina de la mujer en fase temprana a partir de 10 mIU/ml. HCG aparece en la orina, despus de que el vulo ha sido fecundado y se implanta en el tero, esto suele ocurrir aproximadamente 6-8 das despus de la fecundacin. La hormona HCG mantiene la produccin de progesterona despus de la concepcin. El nivel de concentracin de la hormona se duplica cada dos das. Material y Reactivos: - Kit comercial. - Envase Anaorin. Muestras: Orina femenina de la maana.

Procedimientos:
DETERMINACIN DEL EMBARAZO.

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DETERMINACIN DEL EMBARAZO: 1. Las muestras refrigeradas y otros materiales de test incluyendo el dispositivo deben adaptarse a temperaturas ambiente antes de testear. 2. Retira una tira del sobre. 3. Rotular el test y el recipiente de conformidad. 4. Sostn la tira verticalmente del extremo del agarre. 5. Sumerge la almohadilla en la muestra por aproximadamente 10 segundos. 6. Mantn la superficie de la muestra al nivel que indica la flecha en el test. 7. Retira el test de la muestra y colquelo sobre una superficie plana y seca. 8. Los resultados positivos fuertes se observan a los 2-3 minutos. Los resultados positivos dbiles pueden tardar ms tiempo, hasta 5 47 minutos, en aparecer .

No vlido

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Importante: No interpretar el resultado despus de los 10 minutos.

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P13. DETERMINACIN DE ALBUMINURIA.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicacin de las tcnicas inmunolgicas para diferentes determinaciones de aplicacin sanitaria a partir de muestras humanas. Fundamento: Las protenas contenidas en el suero, forma con anticuerpos especficos, por medio de una reaccin inmunoqumica, inmunocomplejos que pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada es proporcional a la concentracin de la correspondiente protena en la muestra. La valoracin se hace comparando con un estndar de concentracin conocida.

Se denomina microalbuminuria al aumento en la excrecin urinaria de albmina, sobre el rango normal, pero bajo el umbral de deteccin de los tests usualmente empleados para la determinacin de proteinuria. Estos rangos son 30 y 300 mg/da respectivamente; toda cifra superior a 300 mg/da es considerada albuminuria clnica (o macroalbuminuria). Originalmente el concepto de microalbuminuria surgi en relacin a la deteccin del dao renal precoz en diabetes, denominada nefropata incipiente; actualmente la microalbuminuria es considerada tambin un marcador de dao cardiovascular en general, tanto en diabticos como en no-diabticos. Como agente precipitante se utilizan los N antisueros. Son sueros animales, lquidos, producidos mediante inmunizacin de conejos con albmina, prealbmina y PFR humanas, de alta pureza. Los ttulos de los anticuerpos (T) indican, cuantos mg de antgeno van a ser precipitados en un gel de agarosa por 1 mL de antisuero correspondiente. Material: Vasos de precipitados. Pipetas. Matraz aforado. Centrfuga. Nefelmetro. Cubetas de nefelometra. Recipiente anaorin.

Reactivos: Muestras: -

Cloruro de sodio. Tween 20. Albmina humana. Suero de conejo anti-albmina humana.

Recoleccin de orina de 24 horas.

Procedimientos:
RECOLECCIN DE LA MUESTRA. PREPARACIN DE SUERO SALINO AL TWEEN. CURVA DE CALIBRACIN. MEDIDA.

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RECOLECCIN DE LA MUESTRA: 1. El da 1 hay que orinar en el vter hasta levantarse por la maana. 2. A partir de ese momento, hay que orinar todas las veces en el contenedor durante las siguientes 24 horas. 3. El da 2 hay que orinar en el contenedor hasta la primera miccin despus de levantarse. 4. Hay que guardar el contenedor en lugar fresco durante todo el periodo de recogida de la orina 5. Una vez lleno, taparlo y llevarlo al laboratorio de anlisis lo antes posible. 6. Anota el volumen de orina en 24 h.

8. Interpola el valor de la orina en la curva de calibrado. 9. Calcula la concentracin en la muestra original. 10. Calcula el valor de la albmina por da y compralo con la bibliografa.

PREPARACIN DEL DILUYENTE: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Pesa exactamente 9 g de cloruro de sodio. Disuelve en medio litro de agua. Aade 0,15 ml de Tween 20. Trasvasa a un matraz aforado de 1litro. Afora. Conserva a temperatura de refrigeracin.

CURVA DE CALIBRADO: 1. Prepara las siguientes concentraciones de albmina humana en diluyente: 0,000, 0,50, 1,25, 2,50 5,00 mg en 100 ml c/u de cada concentracin. 2. Deposita 1 ml de cada disolucin en las cubetas de nefelometra. 3. Aade a cada cubeta 2 ml de antisuero antialbmina humana diluido 1:10 utilizando el mismo diluyente en caso necesario. 4. Agita y se deja a temperatura ambiente por una hora. 5. Mide la luz dispersada con el nefelmetro. MEDIDA: 1. Homogeneiza la muestra de orina. 2. Toma 10 ml en un tubo de centrfuga. 3. Centrifugan a 2.000 r.p.m. por 10 minutos a 4 C. 4. Decanta y del sobrenadante se toman 2 ml, que se deposita directamente en la celdilla para nefelometra. 5. Se complementa el volumen con 8 ml de solucin salina Tween 20. 6. Procede igual que en la curva de calibracin (puntos 2-5). 7. Representa la curva de calibrado.
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P14. DETECCIN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. PAGE.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicacin de las tcnicas electroforticas de protenas para anlisis de aplicacin alimentaria a partir de muestras naturales. Fundamento: La composicin de las protenas del suero lcteo de distintas especies es diferente y equivale a una huella dactilar de la misma. En anlisis alimentario a veces es necesario conocer si en un alimento la leche utilizada es de una nica especie o mezcla de varias para evitar fraudes. As una denominacin de origen, como el queso manchego, slo puede contener protenas de leche de ovejas manchegas. La fraccin srica de la muestra se extrae por adicin de solucin tampn a pH 4,6 y posterior centrifugacin. Las protenas se suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. El mtodo es aplicable a leche cruda o pasteurizada a una temperatura mxima de 90C, durante 30 segundos. Leche conservada mediante congelacin o por adicin de dicromato de potasio. El mismo mtodo es aplicable a quesos. Material: Material general de laboratorio. Micropipetas. Cubeta vertical de electroforesis y accesorios. Fuente de alimentacin. pH-metro. Centrfuga. Papel de filtro de alta calidad.

Reactivos: Muestras: -

Tris base (Tris(hidroximetil)aminometano). cido clorhdrico. Glicina. Azul de Coomassie G-250. cido sulfrico. Hidrxido potsico. cido tricloroactico. Acrilamida-bisacrilamida. TEMED (N,N,N,N,-tetrametilendiamina). Persulfato amnico. Acetato de sodio. Azul de bromofenol. Glicerina. Etanol.

Sueros de leches (o quesos) de distinta procedencia animal.

Procedimientos:
PREPARACIN DE DISOLUCIONES. PREPARACIN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. PREPARACIN DE LA MUESTRA. ELECTROFORESIS. REVELADO.

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PREPARACIN DE DISOLUCIONES: Tampn Tris pH 8,9 (Gel): Pesa 46 g de Tris(hidroximetil)aminometano, medir 4 mL de HCl cc. (35%) y disolver en agua a un litro. Tampn Tris pH 8,3 (electrodos): Pesa 1,2 g de Tris(hidroximetil)aminometano, 5,8 g de glicina y disolver en agua hasta 2.000 mL. Disolucin fijadora-reveladora 1. Disuelve 1 g de azul de Coomassie G-250 en 500 mL de agua. 2. Aade a la solucin 500 mL de cido sulfrico 1M. 3. Mezcla bien agitando durante una hora y filtrar con papel Whatman nmero 1. 4. Medir el volumen de filtrado y aadir 1/9 de este volumen de solucin de hidrxido de potasio 10N. 5. Aade cido tricloroactico a esta disolucin hasta que la concentracin final sea de 12% 48 . PREPARACIN DEL POLIACRILAMIDA: GEL DE

4. A continuacin introducir el peine previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden burbujas entre el peine y el gel. 5. Se deja polimerizar el gel a temperatura ambiente durante 30 minutos. 6. Una vez polimerizado el gel, se retira el peine con mucho cuidado de no romper los pocillos reservados a las muestras. PREPARACIN DE LA MUESTRA: 11. En vasos de precipitados de 50 mL pon 20 mL de cada una de las leches (o 15 g de queso previamente triturado). 12. Aade a cada una de las muestra 10 mL de cido actico al 10 % v/v y 10 mL de acetato de sodio 1 M. 13. Centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos. 14. Filtra el lquido sobrenadante a travs de papel de filtro de velocidad media. 15. Guardar los filtrados en viales debidamente etiquetados. ELECTROFORESIS: 1. Coloca el soporte del gel en la cubeta de electroforesis y llenar las cmaras de los electrodos con tampn de los electrodos (hasta la marca de la cubeta y comprobar que los pocillos del gel quedan llenos de tampn). 2. Inmediatamente antes de su aplicacin en los pocillos del gel mezclar para cada muestra: 1 volumen de la fraccin soluble de muestra obtenida anteriormente, 1 volumen de glicerina al 40 % v/v y volumen de azul de bromofenol al 0,1 %. 3. Sobre cada uno de los pocillos, aplica con micropipeta (o microjeringa) provista de una punta adecuada (introducir la punta de la pipeta hasta el fondo del pocillo) un volumen de 10 a 20 L de las disoluciones de muestras obtenidas en el apartado anterior. 4. Anota el orden de las muestras que se pone en cada uno de los pocillos. 5. Conecta correctamente los cables de la cubeta a la fuente de alimentacin y realiza la electroforesis a un mximo de 120 V. 6. Deja correr el frente del disolvente hasta que la lnea del azul de bromofenol est a 5 mm del extremo inferior del gel. 7. Desconecta la corriente y se saca el soporte de las placas de la cubeta depositndolo sobre una bandeja.

1. Una vez limpias las placas de vidrio con agua y jabn se dejan escurrir en posicin vertical. Se vuelven a limpiar con un papel humedecido en acetona. Se montan los separadores entre las placas de vidrio y se colocan en el soporte. 2. Toma dos tubos de ensayo de poliestireno de 10 mL los pones en una gradilla y aade a cada uno de ellos y por riguroso orden los siguientes reactivos:
Acrilamida-Bisacrilamida Agua Tampn de los geles, pH 8,9 TEMED Persulfato amnico 10% 2,5 mL 4,0 mL 1,0 mL 8 L 75 L

3. Inmediatamente despus de preparar el gel, se vierte ste con la ayuda de una pipeta Pasteur teniendo mucho cuidado de no formar burbujas sobre las placas hasta el nivel que ser ocupado por el peine formador de pocillos.
Esta solucin de teido es estable durante varios meses si el pH <1. Se puede utilizar varias veces pero es conveniente filtrarla antes de cada uso. Salvador Camacho Garrido
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REVELADO: 1. Separa con mucho cuidado los cristales, retira el gel y colcalo en una cubeta conteniendo la solucin de fijacin y tincin. 2. Deja que el gel se fije y tia durante el tiempo necesario (una o ms horas), agitando de vez en cuando la cubeta. 3. Pasar el gel a una cubeta con agua destilada para decolorarlo. 4. Renovar con frecuencia el agua de la cubeta agitando de vez en cuando sta, hasta eliminar el color de fondo del gel. 5. Fotografa el gel e identifica las bandas obtenidas. 6. Saca las conclusiones oportunas. Diagrama electrofortico de las protenas de suero de: A leche de vaca B leche de cabra C leche de oveja. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Seroalbmina lactoglobulina de cabra. lactoalbmina de cabra y oveja. lactoalbmina de vaca y lactoglobulina de oveja. lactoglobulina B de vaca. lactoglobulina A de vaca.

6 5 4 3 2 1

A B C

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P15. DETECCIN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. ELISA.

Objetivo: Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicacin de los inmunoenzimticos en anlisis de aplicacin alimentaria a partir de muestras naturales. ensayos

Fundamento: Tanto antgenos como anticuerpos pueden ser detectados y cuantificados de forma rpida y especfica por el procedimiento ELISA. Entre la diversidad de mtodos de ELISA desarrollados, una de las aplicaciones ms extendidas es el mtodo sandwich (o de doble anticuerpo) en placa microtiter. Un primer anticuerpo se inmoviliza en la superficie de los pocillos la placa microtiter. A continuacin, se aaden las muestras que contienen el antgeno que quedar atrapado por el este primer anticuerpo. Las muestras se retiran y se aade el segundo anticuerpo que tambin se une al antgeno formando un sandwich. Este segundo anticuerpo tiene una enzima unida que al aadir su sustrato producir un producto de color.

La intensidad de color del producto se mide espectrofotomtricamente ( o visualmente) y ser proporcional a la cantidad de antgeno detectado. De esta forma se puede calcular la concentracin exacta de antgeno en cada muestra. Material:

Reactivos:

Material general de laboratorio. Pipetas Pasteur. Kit E.L.I.S.A.-RC-didac. -Espectrofotmetro ELISA (para determinaciones cuantitativas).

Muestras:

Kit E.L.I.S.A.-RC-didac.

Kit E.L.I.S.A.-RC-didac.

Procedimientos:
VISUALIZACIN DEL KIT. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS. PREPARACIN DEL CONJUGADO. DESARROLLO DEL ENSAYO. DETERMINACIN SEMICUENTITATIVA. DETERMINACIN CUANTITATIVA. (OPCIONAL).

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VISUALIUZACIN DEL KIT: El Kit E.L.I.S.A.- RC-didac 49 debe contener: Tiras de 8 pocillos con el primer anticuerpo fijado (6 o 12 unidades). 4 x Patrones de lactosuero de vaca (0%, 1%, 5%, 10%, 15%) en lactosuero de oveja. 3 x Muestras problema de lactosuero (muestra 1, muestra 2 y muestra 3). 1 x Patrn de lactosuero de oveja pura (100%). 1 x Anticuerpo anti-protena bovina marcado con peroxidasa (Conjugado x 20) (Tubo 1). 1 x Sustrato/Cromgeno (TMB) (Tubo 2). 1 x Solucin stop (Acido sulfrico 1M) (Tubo 3). Corrosivo! 1 x Solucin de dilucin del conjugado (Tubo 4).

3. Atemperar todos los reactivos, patrones, muestras y tiras que van a ser utilizados en el ensayo 53 .

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS: Las muestras y patrones incluidos en el kit estn listos para usar. Es decir, no necesitan predilucin 50 .

PREPARACIN DEL CONJUGADO: Preparar solo el volumen de solucin necesario para el ensayo 51 . Para ello, mezclar 1 volumen de la Solucin stock de conjugado (Tubo 1) con 19 volmenes de la Solucin de dilucin del Conjugado (Tubo 4) 52 . DESARROLLO DE LA PRUBEBA: 1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a ser utilizadas. 2. Guardar en la bolsa el resto de tiras.
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4. Aplicar en cada pocillo de la placa 50 l de muestra (0%, 1%, 5%, 10%, 15%) o patrn diluido e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5. Eliminar el lquido de los pocillos volcando la placa sobre un recipiente 54 . 6. Lavar cada pocillo con 0,3 ml de agua destilada (o sea, llenndolo hasta arriba el pocillo) y eliminar el agua como en el paso 5. 7. Repetir este lavado una vez ms 55 . 8. Aplicar en cada pocillo 50 l de Solucin de conjugado. 9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos 10. Repetir 3 veces la secuencia de lavados como en los pasos 6 y 7. 11. Aplicar en cada pocillo 50 l de la Solucin de sustrato/cromgeno (Tubo 2) y dejar desarrollar el color azul 30 minutos a temperatura ambiente 56 .

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Entre etapa y etapa del procedimiento de anlisis, no se debe dejar secar completamente los pocillos.
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Todos los componentes del kit deben ser conservados en nevera (0- 4C). El kit tiene una estabilidad de 4-8 meses. 50 En el caso de utilizar otras muestras, diluirlas 1/100 con agua destilada. Por ejemplo: 0,01 ml de patrn ms 0,99 ml de agua destilada. 51 La solucin de conjugado, una vez preparada, es estable varios das por lo que se puede preparar la cantidad necesaria para toda la semana. 52 Por ejemplo: Para analizar 8 muestras, es necesario 0,4 ml (50 ml/pocillo) de la solucin de conjugado. 0,5 ml de esta solucin se prepara mezclando 25 l de la solucin del Tubo 1 con 475 l de la solucin del Tubo 4. Salvador Camacho Garrido

Para asegurarse que el lquido es completamente eliminado, se puede golpear la placa con los pocillos mirando hacia abajo sobre un papel absorbente/secamanos. 55 Un lavado incompleto de los pocillos puede originar falsos positivos. En este caso, se puede aumentar el nmero de lavados de la muestra y del conjugado para intensificar el proceso. 56 La solucin de sustrato/cromgeno es sensible a la luz por lo que se debe evitar la exposicin directa a sta. Cerrar el tubo despus de usarlo. Como es una solucin lista para usar, para evitar que se contamine con algn catalizador y vire a color azul, es conveniente no pipetear directamente del tubo con una punta de pipeta usada. Por tanto, se recomienda trasvasar a

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12. Aadir en cada pocillo 50 l de la Solucin stop (Tubo 3) para parar la reaccin. 13. Mezclar bien dando unos golpes suaves en el borde lateral del marco. 14. Efectuar la lectura antes de los 30 minutos desde la parada de la reaccin. DETERMINACIN SEMICUENTITATIVA: Como la intensidad del color que se obtiene en cada pocillo va ser directamente proporcional al porcentaje de leche de vaca en la muestra, por comparacin visual con el color de los patrones del 0%, 1%, 5%, 10%, 15% se puede identificar en que rango de concentracin se encuentra la muestra: menor del 1%, entre 1-5%, entre 510%, etc... DETERMINACIN CUANTITATIVA: 1. Leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm con un espectrofotmetro para placas microtiter 57 . 2. Utilizar como blanco aire. 3. Leer durante los 30 minutos siguientes a la parada de la reaccin. 4. Para calcular el porcentaje de mezcla de cada muestra problema se representa grficamente la absorbancia de los patrones (Eje Y) en funcin del porcentaje de mezcla de cada patrn (Eje X). 5. Con la curva obtenida (lineal a concentraciones bajas) se interpola el porcentaje de mezcla de las muestras problema a partir del valor de absorbancia obtenido de stas 58,59 .

otro tubo o envase la cantidad de solucin que se va a utilizar para el ensayo.

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En el caso de no poseerlo, puede realizarse con un espectrofotmetro para cubetas. Diluir los patrones y muestras 1/10 con agua destilada y medir a 450 nm. Hacer blanco frente a aire. 58 La absorbancia de la muestra de lactosuero de oveja (control negativo) se debe considerar concentracin cero a la hora de hacer los clculos. Las muestras problema que den una absorbancia inferior o igual a la de lactosuero de oveja no contienen leche de vaca. Valores superiores de absorbancia indicarn la presencia de leche de vaca en esas muestras. 59 Cuando se desea realizar un clculo exacto, es conveniente analizar por duplicado las muestras y patrones. Salvador Camacho Garrido

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NDICE DE CONTENIDOS P1. P2. P3. P4. P5. P6. P7. P8. P9. P10. P11. P12. P13. P14. P15. OBTENCIN DE PROTENAS. RECONOCIMIENTO DE AMINOCIDOS Y PROTENAS. DETERMINACIN DE ENZIMAS. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE UNA PROTENA. SEPARACIN CROMATOGRFICA DE AMINOCIDOS. SEPARACIN ELECTROFORTICA DE PROTENAS. CUANTIFICACIN DE PROTENAS. EXTRACCIN DE ADN. ELECTROFORESIS DE ADN. CUANTIFICACIN DE ADN. DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO Y COMPATIBILIDAD. DETERMINACIN DEL EMBARAZO. DETERMINACIN DE ALBUMINURIA. DETECCIN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. PAGE. DETECCIN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. ELISA. 1 3 5 7 9 13 15 17 19 21 23 27 29 31 35

Salvador Camacho Garrido

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