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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE HEMATOLOGIA

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CARLOS ARMANDO ESQUECHE ANGELES Biologo Microbiologo C.B.P. 3913 2011

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TOMA DE MUESTRA Se elige la vena que favorece la toma de la muestra, preferiblemente de la regin venosa antecubital, porque a este nivel la piel es fina y mvil y las venas son de grueso calibre y relativamente superficiales. Cuando este lugar no favorece para la puncin, se observan otras venas como de la mano o de la cara anterior del antebrazo. El personal encargado de la toma de muestras se colocara los guantes de ltex, previo lavado de las manos. Si las venas no son muy superficiales se coloca un torniquete 5cc arriba del sitio elegido para puncionar, se le pide al paciente que empue la mano y si es necesario se frota suavemente con la mano de quien va a puncionar el lugar de la vena elegida. Si la vena es superficial solo se le pide al paciente que empue la mano. Una vez elegida el rea de puncin se esteriliza con algodn empapado con alcohol antisptico, se emplea jeringa desechable y se procede a la puncin. La cinta elstica debe retirarse despus de introducida la aguja en la vena, se aspira la sangre con la jeringa y una vez retirada, se presionar la zona puncionada con un algodn empapado en alcohol antisptico. Cuando se va a tomar nicamente para exmenes de hematologa, se toman 2cc de sangre, cuando adems el paciente tiene orden para exmenes de qumica clnica y/o inmunologa se toman 5cc. La muestra para CH se almacena en los tubos tapa lila que son previamente organizados y deben contener 2 gotas de EDTA.

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FROTIS SANGUINEO Y COLORACION Para el frotis sanguneo se emplea el mtodo de los dos portaobjetos: Identificar la lmina. Colocar una pequea gota de sangre no ms de 3 mm de dimetro de un portaobjetos a 2 cm de uno de los extremos. Colocar el canto de otro portaobjetos, por la parte anterior a la gota de sangre, sobre la superficie del primer portaobjetos, formando un ngulo de 45 grados y desplazarlo suavemente hacia atrs, hasta que alcance la gota de sangre. Esperar que por capilaridad toda la sangre se distribuya uniformemente, es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos, sobre el que se realiza la extensin. Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida, sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del frotis sanguneo puede variar de acuerdo al ngulo empleado durante la extensin, si es superior a 45 ser gruesa y corta y si es inferior ser larga y fina. Se deja secar a temperatura ambiente y en posicin horizontal.

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Para la coloracin, una vez seco el extendido no se deja pasar ms de una hora: Se aplica 1 cm colorante de Wright por 1 minuto. Se aplica buffer Giordano (que debe mantenerse en la nevera, pero a temperatura ambiente en el momento de emplearlo) por 6 minutos. Se lava la lmina con agua de chorro, se seca por la parte posterior y se deja secar a temperatura ambiente en posicin vertical.

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HEMOGLOBINA Servir en un tubo de ensayo 2,5 ml de Drabkin y tomar 10 ul de sangre con anticoagulante, limpiar muy bien la punta y llevar al fondo del tubo y aplicar, enjuagar la punta con el reactivo en la parte superior. Homogeneizar el tubo por inversin con movimientos suaves. Dejar en reposo de 5 a 10 minutos. Leer a 540 nm, llevando a cero con el blanco del reactivo y calibrando con el patrn de hemoglobina.

HEMOGLOBINA: ESPECTROFOTOMETRICA ICSH

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FUNDAMENTO El in ferroso de la HB se oxida a in frrico por accin del ferricianuro potsico formndose hemiglobina (metahemoglobina). La hemiglobina reacciona con el cianuro para formar cianhemiglobina (cianmetahemoglobina) que se puede medir por espectrofotometra.

REACTIVOS Reactivo concentrado y patrn de Hb, deben guardarse en refrigeracin, bien cerrados, protegidos de la luz y evitar su contaminacin durante su uso para que se conserve hasta la fecha indicada en la etiqueta. Presencia de turbidez, partculas en el reactivo y el blanco son indicaciones de deterioro, adems de lecturas superiores de 0,010 a 540 nm del blanco. Reactivo de trabajo: Diluir el contenido del frasco de reactivo concentrado hasta 1000 ml con agua destilada, agitar. Para preparar otros volmenes mezclar en proporcin 1 ml de reactivo concentrado + 49 ml de agua destilada. Conservar en frasco oscuro siendo estable 6 meses a 15-30C: No congelar. MUESTRAS Sangre capilar o venosa recogida con EDTA o heparina. La Hb en sangre es estable 6 das de 2-8C.

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PROCEDIMIENTO

PATRON MUESTRA REACTIVO TRABAJO Agitar y dejar por 3 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540 nm frente al blanco. El color es estable por varias horas. Clculos: Con patrn: A muestra ------------ X C patrn = C muestra A patrn Sin patrn: A muestra X 37,5 = C muestra VALORES NORMALES: HOMBRES 12,0-16,0 g/dl 11,7-16,6 g/dl 13,5-17,5 g/dl

BLANCO --2.5 ml

PATRON 10 ul -2.5 ml

MUESTRA -10 ul 2.5 ml

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12-14 aos 15-17 aos 18-74 aos

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MUJERES 11,5-15,0 g/dl 11,7/15,3 g/dl 12,0-16,0 g/dl

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CARACETERISTICAS METROLOGICAS Lmite de deteccin: 0,2 g/dl de Hb. Lmite de linealidad: 20 g/dl. Para valores superiores diluir la muestra con agua destilada y repetir. Interferencias: La bilirrubina no interfiere. La lipemia puede elevar falsamente los resultados debido a la turbidez. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.

HEMATOCRITO Se llena el capilar de la muestra tomada con anticoagulante, hasta las 3/4 partes y sellar por este extremo con plastilina, colocarla en la microcentrifuga de 5 a 10 minutos entre 10.000 y 5.000 r.p.m. Cuando la centrifuga pare, leer el valor en la tabla de hemotocrito. Tomando el punto cero donde la plastilina se une con la muestra hasta la lnea superior que marque con sangre en el capilar. Solamente se lee si no han quedado espacios, ni burbujas. RECUENTO DE LEUCOCITOS

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Aspirar mediante la pipeta de Thoma sangre total hasta el enrose de 0.5 y limpiar la punta de la pipeta. Aspirar lquido de turk hasta el enrose de 11. Con el dedo ndice tapar la parte superior de la pipeta y con el dedo pulgar la parte inferior y mezclar suavemente. Desechar las tres primeras gotas. Llenar la cmara. Realizar la observacin y conteo en 10X. Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes (los de las 4 esquinas), se cuentan las clulas contenidas en el interior del rea de recuento y las que sean tangente o secantes a las lneas de demarcacin superior y derecha. El total de leucocitos en los 4 cuadrados se multiplica por 50 y este ser el valor del recuento de leucocitos. RECUENTO DIFERENCIAL

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En la lmina una vez coloreada se lee con objetivo de 100X las clulas vistas hasta llegar a 100 clulas contadas. La lectura se realiza en sentido vertical y de derecha a izquierda buscndose con anterioridad en 10X la zona ideal, en la parte media del frotis. Cada valor se dar en porcentaje de clulas vistas. Es importante diferenciar los tres tipos de clulas que podemos observar: Clulas nucleadas (leucocitos) con funcin defensiva.

 Clulas anucleadas (hemates) con funcin respiratoria. Seudofragmentos citoplasmticos (plaquetas) con hemosttica.

funcin

Los leucocitos tienen la caracterstica de tener ncleo y organlos citoplasmticos lo que permite su diferenciacin morfolgica con los hemates y las plaquetas. Estos pueden ser: Polinucleares: de ncleo lobulado de apariencia mltiple como los neutrofilos, eosinfilos y basofilos. Mononucleares: ncleo nico y redondo como los linfocitos y monocitos.

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Neutrofilos: Es el ms predominante, su citoplasma es ligeramente acidfilo (rosa plido) y contiene abundantes granulaciones distribuidas en todo el citoplasma; el ncleo es de color violeta oscuro y de cromatina densa y esta divido en lbulos unidos por puentes de cromatina, dando la apariencia de tener varios ncleos, cuando el puente es muy ancho adquiere forma de C siendo propio de los cayados o clulas inmaduras de esta lnea granuloctica. Eosinofilos: Su citoplasma esta lleno de granulaciones de color naranja que se observan de gran tamao, bien individualizados y redondos, casi nunca cubren el ncleo, el que se observa de un violeta ms tenue que el neutrofilo y por lo general de dos masas. Basofilos: Es el menos abundante. su citoplasma se observa de grnulos irregulares que cubren completamente el ncleo y se observan de color muy oscuro entre azul y morado. Linfocitos: El citoplasma puede ser escaso o abundante y de color azul claro, se observan pequeas y escasas ganulaciones de color rosado a rojo. Su ncleo es redondo y abarca gran parte de la clulas, se pueden observar espacios en el ncleo que estn compuestos por cromatina laxa. Monocitos: De citoplasma abundante y color gris azulado. Aveces posee vacuolas. Posee granulaciones finas azurofilas por todo el citoplasma , el ncleo es central por lo general redondo aunque con una o ms escotaduras ocupa gran parte del citoplasma, su cromatina es laxa, filamentosa e irregular.

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Se debe informar la presencia de neutrfilos con granulacin txica, restos nucleares o normoblastos, cayados, linfocitos atpicos (cuando es superior a el 10% del total de linfocitos), reaccin leucoeritoblstica que sern contados dentro de las 100 clulas del recuento diferencial. Ante la presencia de normoblastos realizar la correccin de leucocitos. RECUENTO DE PLAQUETAS

Se busca entre el cuerpo y la cola del frotis sanguneo una zona de distribucin uniforme de hemates (que no estn amontonados y no se observen grandes espacios en blanco entre ellos), se cuenta la presencia de 100 de estos por campo. As, se contara en cada campo, siendo 10 en total, el nmero de plaquetas observadas, se suman, se divide por 10 y se multiplica por 21.000, siendo este el valor del nmero total de plaquetas por milmetro cbico. ANALISIS DE FROTIS DE SANGRE PEIFERICA

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Seleccionamos la zona ideal de lectura en 10X, hacia la parte de la pluma y el cuerpo del frotis, donde las clulas se endosan unas con otras observndose bien delimitados sus contornos. Para valorar el recuento total de blancos, miramos 3 campos en forma vertical en 10X, homgenos en cuento a nmero de hemates, contar la cantidad de clulas blancas en cada uno de ellos. Promediar y multiplicar este valor por la constante 250, dndonos el valor de leucocitos en mm3. (a+b+c) / 3 X 250 = leuc / mm3 Estos datos son confiables cuando la cantidad de blancos no sobrepasa los 20.000 mm3. Cifras mayores se pueden considerar fuentes de error y es necesario realizar el recuento total por lquido de turk confirmando el valor repitiendo la prueba.

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Observar la morfologa de los leucocitos en 100X e informar: Cuantitativamente: la cantidad por mm3 como normales, leucocitosis, leucopenia.

Cualitativamente: el diferencial, si hay disminucin o aumento en alguna de las lneas, morfologa normal o las alteraciones observadas en las diferentes lneas. Anotar la presencia de neutrfilos con granulacin txica, cuerpos de Dohle, degranulados, macropolicitos (hipersegmentados), hipolobulacin (sndrome de Pelger Huet) vacuolas; linfocitos atpicos, vacuolados; monocitos vacuolados; eosinfilos y basfilos hiperlobulados, con alteraciones en los grnulos; restos nucleares; ncleos picnticos; presencia de clulas inmaduras.

Para linfocitos atpicos se debe informar: si son mas del 10% (es decir, sumndolos al total de los linfocitos) se deben informar en el diferencial de los 100 leucocitos. Si es menor del 10% del total de linfocitos solo se anotan como: se observan linfocitos atpicos escasos. En caso de reaccin leucoeritoblstica se incluyen por aparte dentro del recuento diferencial. Adems la presencia de normoblastos debern incluirse como se menciono. En caso de reaccin leucoblstica o desviacin a la izquierda tambin se deber incluir en el recuento diferencial). Observar en 100X los eritrocitos para determinar y valorar: el tamao o anisocitosis, el color, la variacin de formas o poiquilocitosis y, la inmadurez globular o policromatofilia que es la presencia de hematies con tonalidad gris azulada y de mayor tamao. La anisocitosis se puede cuantificar as: Se determina al compararlos con los linfocitos pequeos, un glbulo rojo normal debe tener el mismo tamao de un linfocito. Se cuantifica en 10 campos: Normal Ligera Moderada Marcada 05 6 15 16 30 mayor 30 El tamao se relaciona con el VCM 76 96 fl. Puede ser normoctico, microctico o macroctico, para estos dos ltimos se informa ligera, moderada o marcada. De acuerdo al VCM: Macrocitosis:

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Ligera H 95 108, M101 108; moderada 109 120; marcada mayor de 120. Microcitosis: Ligera 76 80, moderada 66 75, marcada menor de 65. El color dado normocrmico como: Normal 0- 5 por la cantidad de hemoglobina presente puede ser o hipocroma. Esta ltima se determina en 10 campos Ligera 6 15

Para la poiquilocitosis se debe informar la forma prevalente y cuantificar as: Normal Ligera Moderada Marcada 0 15 6 15 mayor de 15 Pueden ser: esferocitos, ovalocitos, estomatocitos, codocitos, dacriocitos, esquitocitos, queratocitos, acantocitos, knizocitos, clula falciforme. La policromatofilia y los reticulositos (se valoran con coloracin de azul de cresil brillante) son proporcionales en 10 campos, pero solo determinaremos la policromatofilia como: Normal Ligera Moderada Marcada 02 23 34 mayor 4

Moderada 16 30

Marcada mayor 30

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Adems se debe informar la presencia de inclusiones como punteado basfilo, cuerpos de Howell Jolly, cuerpos de Heinz, anillos de Cabot, restos nucleares, parsitos y normoblastos si los hay. Para las plaquetas se debe informar si son normales en nmero y morfologa. Si no se solicito antes un recuento de plaquetas que nos de un valoracin de la cantidad se observa 100X, 10 campos en proporcin cada uno de 100 hemates y se debe encontrar de 7 a 21 plaquetas por campo para considerarlas normal, , en casos contrarios se informa trombocitosis o trombocitopenia y la morfologa cuando se encuentran mas de 3 macroplaquetas lo que se debe informar o por el contrario microplaquetas.

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NORMOBLASTOS Ante la presencia de normoblastos se debe realizar la correccin de leucocitos. En este recuento interfiere los normoblastos y los restos nucleares. Se corrigen siempre que se encuentren mas del 10% al realizar el recuento diferencial.

Debern ser anotados a medida que se realice el recuento diferencial anotndolos apearte y se informa la cantidad de normoblastos en100 clulas blancas contadas. FORMA DE CORRECCION: 1. Hacer el recuento diferencial. 2. Saber cuntos normoblastos o cuantos restos nucleares se obtuvieron en este recuento. 3. Conocer el recuento total de blancos.

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Leucocitos corregidos: nmero de leucocitos contados X 100 / nmero de normoblastos + 100

Recuento total de leucocitos por mm3 por cualquier mtodo, es decir, automatizado o manual por lquido de Turk. X 100 % que es le nmero de leucocitos contados para el diferencial / (100 % que es el nmero de leucocitos contados para el diferencial + el % de restos nucleares o normoblastos contados en el diferencial). Ejemplo: 7.500 mm3 de leucocitos por lquido de turk 100 % de clulas contadas para el diferencial 20% de restos nucleares o normoblastos hallados en el diferencial 7.500 mm3 de leucocitos X 100% total de clulas contadas en el diferencial / 120% = 6.250 mm3 de leucocitos corregidos.

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LINEA MEGACARIOCITICA MEGACARIOBLASTO: De tamao grande, ncleo con cromatina laxa, presencia de nucleolo, citoplasma intensamente azul, sin grnulos, presenta prolongaciones a modo de seudpodos tiles para su identificacin morfolgica.

PROMEGACARIOCITO: De mayor tamao que la anterior, ncleo multilobulado, citoplasma basfilo con abundantes granulaciones y desflecado. MEGACAROCITO: Es el de mayor tamao. Gran citoplasma de color grisceo y repleto totalmente de grnulos azurfilos, gran nmero de los cuales se agrupan y rodean lo que se denomina una membrana de demarcacin. La fragmentacin final del citoplasma dar origen a las plaquetas. PLAQUETAS: Se observan de pequeo tamao, de color rosado y con grnulos en su interior. LINEA ERITROIDE

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La maduracin eritropoytica se caracteriza por: 1. El aumento progresivo de la acidofilia celular, ms que la lnea mieoloide. 2. Desaparicin de todos los organelos citoplasmticos. 3. Su ncleo es ms central y pequeo que la lnea granuloctica. PROERITOBLASTO: Gran tamao, intensa basofilia citoplasmtica, ncleo grande con cromatina laxa, alrededor del ncleo se observa como encaje, en el que pueden apreciarse dos o ms ncleolos, aunque son muy difusos.

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ERITOBLASTO BASOFILO: Es de menor tamao que la anterior, la cromatina es ms burda como grumos y los nucleolos poco distinguibles o completamente ausentes. El citoplasma conserva su intensa basofilia, ncleo ms central.
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 ERITOBLASTO POLICROMATICO: Es de menor tamao que la anterior, su citoplasma es de color gris azulado, cromatina gruesa e irregularmente condensada se nota como un tablero de ajedrez. ERITOBLASTO ORTOCROMATICO: Su tamao es un poco menor a la anterior sin ser muy notoria la diferencia, ncleo picntico, ms pequeo y ms condensado, citoplasma gris rosado. RETICULOCITO: Tiene un tamao un poco mayor que el hematie, no tiene ncleo, citoplasma de tono azulado, con coloracin supravital revela un retculo granulofilamentoso. LINEA GRANULOPOYETICA Es caracterstico que el ncleo disminuya de tamao en relacin al citoplasma.

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MIELOBLASTO: Citoplasma azulado y granulaciones primarias o azurfilas muy escasas o inexistentes. Cromatina muy laxa con dos o tres nucleolos definidos y oscuros, el ncleo ocupa la mayor parte de la clula quedando solo una pequea cantidad del citoplasma.

PROMIELOCITO: De mayor tamao que la anterior, con abundante granulacin azurfila (se observan rojos, toscos y grandes) citoplasmtica. Los grnulos son visibles en el ncleo como en el citoplasma. Ncleo redondo y relativamente grande, an se pueden distinguir los nucleolos. El citoplasma es azul con una zona relativamente clara alrededor del ncleo. MIELOCITO: De menor tamao que la anterior, la cual se caracteriza por la gran abundancia de granulaciones especficas citoplasmticas. Segn su naturaleza se clasifican en neutrfilo, eosinfilo y basfilo. El ncleo contiene una cromatina ms condensada que la del promielocito, es excntrico y no posee nucleolos. Es de forma redonda u ovalada.

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 METAMIELOCITO: De menor tamao que la anterior con ncleo excntrico, presenta una ligera invaginacin dando aspecto de frijol, citoplasma rosado. EN BANDA O CAYADO: La invaginacin es ms pronunciada arqueando la totalidad del ncleo, que se va a lobular generalmente a neutrfilo, eosinfilo o basfilo segn los grnulos que se observan cerca del ncleo. LINEA MONOCITICA

MONOBLASTO: Son similares a los mieloblastos y difcil de diferenciar entre s. El citoplasma es basfilo y tienen un halo plido alrededor del ncleo. El ncleo tiene una cromatina fina, suave y homognea que se ve interrumpida por los ncleolos, que pueden ser de 2 a 4 redondos y de color azul claro.

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PROMONOCITO: Tiene un ncleo regular e irregular, citoplasma azul grisceo ms abundante que en el monoblasto. Escasos grnulos azurfilos, el citoplasma presenta ligeras prolongaciones simulando pseudpodos. MONOCITO: Ncleo irregular en forma de frijol. Un pliegue en el ncleo es bastante caracterstico. La cromatina es fina e irregularmente distribuida. El citoplasma es de color azul grisceo. Casi siempre contiene grnulos azurfilos. HISTIOCITOS Son los monocitos que de sangre perifrica pasan a los diferentes tejidos, con actividad macrofgica. Sus caractersticas dependen del tejido al cual ha migrado: NOMBRE TEJIDO Histiocitos Conjuntivo Clulas de Kupfer Hgado Macrfagos alveolares Pulmn Macr. de cordones y senos esplnicos Bazo
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Clulas sinusoidales Macrfagos medulares Macrfagos de las serosas Osteoclastos Clulas de la microglia

Ganglio linftico Mdula sea Pleura y peritoneo Hueso Sistema nervioso

Los histiocitos son clulas grandes con abundante citoplasma que contiene vacuolas digestivas y/o partculas fagocitadas bien visibles, de ncleo excntrico. El citoplasma es azul claro o gris azulado, con o sin grnulos. Algunos pueden presentar seudpodos obtusos, sin grnulos. Otros bordes citoplasmticos dilacerados, caractersticos de clulas tisulares fijas que han sido arrancadas de su sitio normal.

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LINEA LINFOIDE LINFOBLASTO: Tiene la cromatina homgena y delicada pero es un poco ms burda que la de los mieloblastos y monoblastos. Tiene uno o dos nucleolos, escaso citoplasma azul, sin grnulos y un halo claro perinuclear. PROLINFOCITO: Ms basfilos que los linfocitos, ms grandes, de ncleo ligeramente excntrico, con un nucleolo, cromatina menos densa que el linfocito, el citoplasma a veces parece rugoso y granular. LINEA PLASMOCITICA

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PLASMOBLASTO: Clula de tamao intermedio. Por lo general es redonda pero no necesariamente, de ncleo grande con cromatina fina y presencia de nucleolo bien definido, citoplasma de color azul oscuro y algunas veces se puede observar una zona clara perinuclear. PROPLASMOCITO: forma ovalada, ncleo excntrico grande que contiene el nucleolo, mayor cantidad de citoplasma que presenta color azul intenso y la zona clara perinuclear se observa mejor. PLASMOCITO: el ncleo es muy excntrico con una cromatina muy condensada da el aspecto de radios de rueda, el citoplasma ha tomado
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forma ovalada. El citoplasma no es granuloso pero s de gran tamao contrario al linfocito, se tie de azul oscuro y presenta una brillante translucidez o zona clara. HEMOCLASIFICACION

Si el paciente llega nicamente con orden de hemoclasificacin, se toma la muestra del pulpejo de su dedo ndice. Se limpia la zona con algodn impregnado con alcohol antisptico, se deja secar a temperatura ambiente toma una lanceta y se punciona por la zona del lado del pulpejo del dedo, se descarta la primera gota y se toma tres gotas en una lmina portaobjetos, separadas entre s, se colocara una torunda de algodn en la zona puncionada y se le dir al paciente que la sostenga por un minuto.

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La lmina portaobjetos en su posicin horizontal se divide en 3 partes, en cada una en la parte superior se marca como A, B y D. Cada gota se coloca debajo de cada letra y se aplican los reactivos del juego de hemoclasificadores, en la zona A, se aplica una gota de Anti A, en la zona B una gota de Anti B y en la zona d una gota de Anti D. Para los dos primeros espacios se determina el grupo sanguneo y para el ltimo el Rho. Si solo se observa aglutinacin en la zona A, el paciente es grupo A; si solo se observa aglutinacin el la zona B, el paciente es grupo B; si la aglutinacin es para las dos zonas, el paciente es grupo AB y si no se observa aglutinacin para ninguna de las dos zonas, el paciente es grupo sanguneo O. En la zona D la presencia de aglutinacin nos indica rho positivo y la no aglutinacin un rho negativo. Si la orden adems indica otro examen que implique la toma de tubo con EDTA, la muestra ser tomada del mismo tubo y no se puncionara al paciente en su dedo ndice. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO PRINCIPIO BOLOGICO DE LA PRUEBA Se basa en la hemaglutinacin directa. La incubacin de los hemates muestra con el reactivo Anti A, Anti B, Anti D produce una reaccin especfica de antgeno - anticuerpo, si el correspondiente antgeno esta

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presente en los hemates muestra. La reaccin es demostrada por la aglutinacin visible. La no aglutinacin indica ausencia del antgeno para cada uno de los reactivos siempre que se hayan cumplido correctamente la indicaciones del procedimiento. DESCRIPCION DEL PRODUCTO Los reactivos son preparados de pool de suero humano obtenidos de donantes inmunizados. Deben almacenarse de 2-8C, no congelar. Si se observa turbidez no emplearlo, puede presentar contaminacin bacteriana o deterioro del producto, tampoco usarlo despus de la fecha de vencimiento. El material biolgico con los que se prepar el reactivo fue sometido a pruebas de HBsAg y Anti VIH dando negativo, sin embargo, se deben manipular como si fueran material sospechosos de infeccin.

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MUESTRA No se requiere preparacin especial del paciente para obtener la muestra. Se puede tomar muestra venosa (usando anticoagulante) o por puncin capilar en este caso si la prueba se realiza de una vez sin retrasos para evitar que la muestra se seque. Lavado de glbulos rojos de pueden almacenar en solucin preservante de 2-8c por no ms de 35 das. GOTA GRUESA

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Puede hacerse con sangre con anticoagulante o de gotas obtenidas por puncin, que se obtienen de la parte lateral de la yema del dedo medio de la mano y en nios pequeos del dedo gordo del pie. Se debe limpiar la piel con alcohol, se deja secar, se punciona con lanceta desechable y se limpia la primera gota con algodn seco. Se presiona para obtener una gota pequea. Se coloca dos gotas en una lmina portaobjetos sin tocar la piel, la cual se ha divido imaginariamente en 3 partes, una para marcarla en el extremo derecho y los otros dos espacios para colocar cada gota. Se extiende la sangre de cada gota utilizando el ngulo y los primeros 5 mm del borde longitudinal de otro portaobjetos se extiende la gota amanera de N para

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formar un rectngulo de 1,5 a 0.5 cm; se hacen 2 laminas que se dejan secar a temperatura ambiente en posicin horizontal, se deben colorear antes de 2 horas de tomadas empleando la coloracin de Field. Limpiar con alcohol la lmina que se utiliz para las gotas gruesas con el fin de evitar la contaminacin de las siguientes muestras. Es importante tener en cuenta que el exceso en el tiempo de secado, el alcohol o el calor pueden fijar la hemoglobina, haciendo inadecuada la muestra para el diagnstico de malaria. Primero se hace una precoloracin: Se sumerge durante 1 segundo la lmina en azul de metileno fosfatado, se deja escurrir sobre una toalla de papel en posicin vertical. Enjuagar con solucin amortiguadora rpidamente La coloracin se realiza colocando la lmina boca abajo en una superficie cncava, all se adiciona el colorante de Field evitando la formacin de burbujas que se ha preparado previamente adicionando 3 ml de solucin amortiguadora, una gota de solucin A y una gota de solucin B; se deja actuar por 9 minutos, luego se escurren sobre el papel absorbente y se deja secar. La observacin se realiza en 100X, examinando la gota a partir de uno de sus bordes, y mover la lmina en breves trazados horizontales y verticales (zig zag) en la que se identifica la presencia del parsito, su especie en caso de observarse y el recuento del plasmodium. Tambin se puede hacer extendido coloreando la lmina con 2 ml Wright por 1 minuto y luego 0.5 de buffer Giordano por 6 minutos, se lava con agua de chorro, se escurre y se deja secar a temperatura ambiente en posicin vertical. Para hacer el diagnstico por la lectura de extendido se debe realizar hematocrito al paciente. LECTURA: Con base en el nmero de leucocitos. En gota gruesa se cuentan los trofozoitos, esquizontes y gametocitos para P. vivax; y/o trofozoitos y/o gametocitos, aunque ocasionalmente esquizontes para P. falciparum, presentes en los campos microscpicos determinados con

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10X y 40X donde se encuentre mayor nmero de leucocitos. Un buen campo microscpico es aquel en donde se encuentran de 10 a 20 leucocitos, mirando los campos hasta que estos sumen 100 leucocitos. Conociendo el nmero de leucocitos por mm3 se puede calcular la cantidad de parsitos en este volumen de sangre. De no visualizar el parsito, se deben observar 200 campos para calificar la muestra como negativa. Ejemplo: paciente con malaria con un recuento de 8.000 leuc/ul de sangre. Se establece la proporcin de parsitos en 100 leucocitos encontrados: # de parsitos X 8.000 luec/ul de sangre / 100 leucocitos = # de parsitos/ul de sangre.

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Con base en el nmero de sangre de la gota gruesa. Se calcula que en una preparacin bien hecha, 100 campos microscpicos en 100X, equivalen a 0.2 mm3 de sangre. Puede determinarse la parasitemia contando en los 100 campos, los trofozoitos y esquizontes presentes.

Con base en el nmero de eritrocitos. En un extendido de sangre perifrica se busca el porcentaje de eritrocitos parasitados por trofozoitos y esquizontes presentes en 10.000 eritrocitos, lo que equivale a 100 campos microscpicos, asumiendo que cada campo tiene igual cantidad de eritrocitos. Se busca campos en donde la distribucin de los eritrocitos sea homognea y no se encuentren superpuestos, hacia el segundo tercio del extendido. Ejemplo: seran necesarios 33 campos microscpicos, si hay 300 eritrocitos por campo. INFORME DE RESULTADOS: Con base en el nmero de leucocitos: Para los casos de P. vivax no se debe hacer recuento ni diferenciacin entre las formas sexuadas y asexuadas. En los casos de P. falciparum se debe informar por separado las formas sexuadas y asexuadas. En las infecciones mixtas se debe registrar primero el parsito prevalente y luego la especie subordinada. Ejemplos: Hemoparsitos: Negativo.
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Hemoparsitos: Positivo para P. vivax. Hemoparsitos: Positivo para P. falciparum (50.000 trofozoitos/ul). Hemoparsitos: Positivo para P. falciparum (100 trofozoitos/ul y 5 gametocitos/ul). Hemoparsitos: Positivo para P. falciparum (200 gametocitos/ul). Hemoparsitos: Positivo para infeccin mixta: P. vivax (5.000 parsitos/ul) y P. falciparum ( 2.000 trofozoitos/ul). Hemoparsitos: Positivo aunque no se puede precisar la especie. Se sugiere nuevo examen. Con base en el nmero de sangre de la gota gruesa. El recuento semi cuantitativo consiste en informar la especie de Plasmodium que ocasiona la infeccin y el nmero aproximado de parsitos encontrados. As: 1 10 en 100 campos microscpicos + 11 100 en 100 campos microscpicos ++ 1 10 por campo microscpico +++ mayor de 10 por campo microscpico ++++

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En las infecciones por P. falciparum, por la facilidad en el reconocimiento de los gametocitos de los trofozoitos, es posible informar separadamente las forma sexuales de las asexuadas. Ejemplo: Hemoparsitos: Positivo para P. falciparum: trofozoitos ++ y gametocitos + Hemoparsitos Positivo para P. vivax ++. Con base en un extendido de sangre perifrica. Para determinar el nmero de parsitos en 10.000 eritrocitos serian necesarios 33 campos si hay 300 eritrocitos por campo microscpico. Para un hematocrito de 40% estimamos que el paciente tienen 4.000.000 eritrocitos/ul de sangre. Ejemplo: # parsitos X # de eritrocitos/ul de sangre / 10.000 eritrocitos = parsitos/ul de sangre

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3 eritrocitos/ul = hematocrito x 100.000 reemplazando y simplificando: # de parsitos en 10.000 eritrocitos parsitos/ul de sangre. X hematocrito X 10 = #

Se indica la presencia y la cantidad de formas presentes. COMPARACION DE LAS ESPECIES DE PLASMODIUM EN EXTENDIDO
G.R parasitados P. vivax Agrandados, plidos. Punteado fino (punteado de Schuffner, puntos pequeos de rosa a rojos que aumentan con intensidad con el crecimiento del parsito, numerosas). Inicialmente invade los reticulocitos, Marginales raras P. falciparum No agrandados. Color normal, Punteado grueso (hendiduras de Maurer, puntos rojos generalmente escasos.). Invade todos los eritrocitos. *

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Grande Anillos grandes (1/2 a 1/3 del dimetro de los eritrocitos) a veces con citoplasma ameboide o amorfo, vacuolados. Generalmente un grnulo de cromatina, ocasionalmente granulaciones de Shuffner. Pigmento en los trofozoitos Partculas finas de color en desarrollo pardo ligero carmelito, amarillento, diseminados, en el citoplasma del parsito, en los esquizontes se condensan en una masa nica. Trofozoitos viejos Muy pleomorfos, rico en

Forma especiales del parsito Tamao del parsito Fase de anillo de los trofozoitos (T. Jvenes)

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Pequeo Anillos muy pequeos (1/5 del dimetro de los hematies). Muchas veces dos grnulos o dos puntos de cromatina; infecciones mltiples; anillos delicados y regulares; pueden adherirse a los eritrocitos. Grumos burdos de color negro o carmelito oscuro, escasos, dispersos en el citoplasma del parsito. En los esquiozontes se condensa en una masa nica. Compactos y redondeados,

En i, , candelabro.

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Esquizontes maduros (segmentados)

Gametocitos

Distribucin en sangre perifrica Parasitemia habitual

citoplasma muy ameboide, vacuolado, aumenta el tamao del eritrocito. Ocupa generalmente todo el glbulo rojo. De 12 a 24 merozoitos. Posee una masa de pigmento malrico, granulaciones Shuffner. Redondos u ovales, grandes, ocupa por lo general todo el eritrocito, cromatina abundante laxa puede se claramente distinguible (macrogametocito femenino) o difusa (microgametocitomasculino) Todas las formas.

presencia de granulaciones de Maurer * De 2 a 4 merozoitos. Muy raros en sangre perifrica pero puede llegar a tener de 8 y 40merozoitos.. * Semilunares o salchicha. Masa de cromatina central rodeada por pigmento malrico en forma de bastones.

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Solamente anillos y semilunas (gametocitos). * Hasta 30.000 /ul de sangre. Hasta ms de 200.000 / ul. Comnmente 50.000 / ul

* Ordinariamente solo se observan etapas de anillo o gametocitos en sangre perifrica con P. falciparum; las etapas consecutivas a la fase de anillo hacen adherentes a los eritrocitos y tienden a ser retenidos en los lechos capilares profundos en infecciones masivas. CARACTERISTICAS DEL PLASMODIUM EN GOTA GRUESA
PARASITO Trofozoitos jvenes P. VIVAX Formas de anillo pequeo, aveces abierto mostrando un citoplasma regular o ameboide. Grande con variedad de formas ameboides. Vacuola presente. Pigmento malrico, color carmelito. Granulaciones de Shuffner

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P. FALCIPARUM Anillos muy pequeos, finos y delicados, regulares. A veces abierto formando figura de i, , candelabro. Compacto con aspecto slido, vacuola pequea, usualmente contiene pigmento. Raro de encontrar.

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Trofozoito maduro

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Esquizonte

Gametocitos

Grandes, redondos. Grnulos de pigmento marrn o negro esparcidos por el citoplasma. De 12 a 14 merozoitos distribuidos irregularmente. Granulaciones de Shuffner a manera de halo rosado. Redondos ovalados con una nica cromatina grande, pigmento malrico distribuido en el citoplasma, granulaciones de Shuffner como halo rosado.

Pequeos, redondos y compactos. Con 2 o ms merozoitos, una sola masa de pigmento malrico. En infecciones severas acompaado de un gran nmero de trofozoitos. Forma creciente de media luna o salchicha, tambin pueden demostrase redondeados. Cromatina central rodeada de pigmento malrico de color negro a manera de bastones. Se puede diferenciar el femenino del masculino.

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