OBTENCIN DE CEPAS DEL GNERO PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PLAGUICIDAS, A PARTIR DE SUELOS EN PLANTOS DE PAPAYA MARADOL

6 SEMESTRE

QUMICA INDUSTRIAL

MARIANA AZUCENA OSORIO TUZ DALIA SELENE MUOZ GONZLEZ REINA GUADALUPE CHIN LIZAMA ILSE VICTORIA SOLS UICAB

MICROBIOLOGA GENERAL

M. EN C. DIANA YAMILY ESCALANTE RENDZ

27 DE ABRIL DE 2012

OBTENCIN DE CEPAS DEL GNERO PSEUDOMONAS DEGRADADORAS DE PLAGUICIDAS, A PARTIR DE SUELOS EN PLANTOS DE PAPAYA MARADOL
Introduccin
El incremento en la produccin y uso de compuestos qumicos en los ltimos cien aos ha dado origen a una preocupacin creciente sobre el efecto que dichos compuestos pueden tener sobre los ecosistemas terrestres y acuticos (Albert, 1998). Los plaguicidas (herbicidas, fungicidas, insecticidas) son ampliamente utilizados en la agricultura y la industria en todo el mundo debido a su alta actividad (Mostafa, 2010). Los plaguicidas son biocidas y, por lo tanto son sustancias txicas y peligrosas. Esta peligrosidad afecta al medio ambiente y al consumidor, ya que pueden estar presentes en el agua, en el aire, en la tierra y en los alimentos que ingerimos (Escriche, 2006). Algunos cultivos, como los de la papaya Maradol, son cultivos de alta actividad fisiolgica durante la mayor parte de su vida, pues en ella coinciden el rpido crecimiento, la emisin de hojas, flores y frutos, por lo que es evidente que se requiere de altos niveles de fertilizacin y uso de plaguicidas en perodos cortos, dada la produccin temprana y abundante. El uso indiscriminado de plaguicidas ha producido que en la actualidad se detecten residuos de estos en el ambiente, por lo que es urgente el desarrollo de tecnologas simples, de bajo costo y eficientes para la eliminacin in situ de estos contaminantes en el ambiente (OMS, 1998). Existen diversas tecnologas para la destruccin de plaguicidas, que van desde tratamientos fsicos hasta tratamientos biolgicos y procesos avanzados de oxidacin. Las tcnicas de bioremedacin consisten principalmente en el uso de diferentes organismos del medio para neutralizar sustancias txicas, bien transformndolas en sustancias de carcter menos txico o bien convirtindolas en inocuas para el medio ambiente y la salud humana. Una de las medidas biocorrectoras ms empleada es la utilizacin de microorganismos para la descontaminacin de suelos (Marivela, et al., 2002). Las pseudomonas sintetizan una cantidad de enzimas inusualmente grande y pueden metabolizar una amplia variedad de sustratos. Por consiguiente, es probable que contribuyan de manera significativa a la descomposicin de sustancias qumicas poco frecuentes, como plaguicidas, que se agregan al suelo (Tortora, et al, 2007). El gnero de pseudomonas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza. Habitan en el agua dulce, el suelo, las plantas, materia orgnica en descomposicin y aguas negras (Fontanillas, et al, 2005). Son bacilos gram negativos, aerobios, que se mueven por medio de flagelos polares (Tortora, et al, 2007). Son capaces de procesar, integrar y reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio ambiente, y muestran una alta capacidad de reaccin a seales fsico-qumicas y biolgicas (Cornelis, 2008). En este estudio, se buscar obtener estos microorganismos a partir de suelos en plantos de papaya, los cul sean capaces de degradar los plaguicidas utilizados en dicho cultivo.

Objetivos: General:
Obtener microorganismos del gnero pseudomona degradadores de plaguicida a partir de una muestra de suelo de un planto de papaya Maradol.

Especfico: Identificar al gnero pseudomona. Comprobar que las pseudomonas aisladas son capaces de degradar el plaguicida dimetoato. Justificacin Los plaguicidas son compuestos organofosforados que combaten diversas plagas y enfermedades en el mbito agropecuario aunque, como consecuencia, producen graves enfermedades en los seres humanos y ocasionan una excesiva contaminacin al medio ambiente. Un mtodo para atacar esta problemtica que est teniendo una gran importancia en el sector industrial es la implementacin la biorremediacin por medio de unos microorganismos del gnero Pseudomonas. Estas bacterias son ampliamente utilizadas en la degradacin de compuestos txicos entre ellos los plaguicidas. (Golovleva et al, 1990). Hiptesis Se encontrarn microorganismos del gnero pseudomonas en el suelo de planto de papaya Maradol que poseen la capacidad de degradar plaguicidas. Diagrama de flujo Recoleccin de muestra Colocar el cultivo de enriquecimiento

Aislamiento

Inoculacin

Identificacin

Metodologa
La muestra se tomar del suelo de un planto de papaya Maradol del municipio de Dzidzantn, Yucatn, tomando la parte del suelo localizada entre 4-10 cm de profundidad, y se almacenar en una bolsa de plstico Ziploc hasta su anlisis en el laboratorio (La muestra debe analizarse con un mximo de 12 h. despus de haber sido tomada del suelo).

Cultivo de Enriquecimiento
Se tomarn 250g de la muestra de suelo y se le aadirn 250mL de agua mineralno carbonatada esterilizada (Anexo I). A la mezcla homogeneizada se le agregar el siguiente plaguicida: Dimetoato (Ditiofusfato de O,O-dimetilo, S-(N-metilcarbanol) metilo). Se dejar el cultivo durante 3 das con agitacin en una incubadora a 37 + 2 C.

Aislamiento
Se tomar 10mL de sobrenadante del cultivo de enriquecimiento y se mezclaran con 90mL de agua mineral no carbonatada esterilizada, se agitar por 10 minutos y se dejar reposar unos minutos. Se tomar 1 mL de esa solucin y se mezclar con 9mL de agua mineral no carbonatada esterilizada, se agitar y se dejar reposar unos minutos. Se realizar este mismo procedimiento hasta obtener la dilucin 10-5.De cada una de las diluciones se tomara 0.1mL y se sembrar por la tcnica de extensin en placa sobre el agar King A y King B (Anexo I). Hacer por triplicado. Para la purificacin, se tomar una colonia y se sembrar por la tcnica de estras en el agar King A y King B (Anexo I) segn corresponda.

Identificacin Para la identificacin de cada colonia se realizaran las siguientes pruebas (Anexo II): Tincin Gram Prueba de oxidasa Prueba de catalasa Prueba de descarboxilacin de lisina Prueba TSI Prueba de Motilidad

ANEXO I. Preparacin de soluciones y medios de cultivo

A) Solucin de agua mineral
Se prepara una solucin de sales minerales con la composicin mostrada en la tabla. Est solucin de sales minerales se esteriliza a 121C por 15 minutos.

B) Agar King A
Ajustar el pH con cido actico e NaOH con ayuda del potencimetro. Disolver los ingredientes en agua destilada. Agregar los 10 mL de glicerina. Calentar con agitacin constante hasta homogeneizar. Llevar a ebullicin y esterilizar por 15 minutos 121C.

Principio de accin: La peptona de gelatina es fuente de

nitrgeno, vitaminas y aminocidos. El sulfato de potasio y el cloruro de magnesio estimulan la produccin de pigmentos piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de fluorescena. La Glicerina es la fuente de carbono.

Las colonias se observan por la produccin de pigmentos piocianina y/o piorrubina. La produccin de piocianina se observa como una zona color azul, azul-verdoso que rodea la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento. La produccin de piorrubina se observa como una zona de color rojo alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento. Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante la sospecha de su presencia, se recomienda agregar al medio unas gotas de cloroformo, para exaltar la visualizacin del pigmento.

C) Agar King B
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Agregar los 10 mL de glicerina. Calentar con agitacin constantes hasta homogeneizar. Llevar a ebullicin y esterilizar por 15 minutos 121C. Ajustar el pH con cido actico e NaOH con ayuda del potencimetro.

Principio de accin: La Triptena

vitaminas. La peptona de

minerales y fuente de nitrgeno, carbono, aminocidos y protenas. La Glicerina es la fuente de carbono y favorece la produccin de pigmentos. El fosfato dipotsico estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina. Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm. Las colonias presentan fluorescena, pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenmenos de difusin. Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluorescena a temperatura ambiente, por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37 C, se recomienda dejar los tubos conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente.

aporta carne es

ANEXO II. Pruebas bioqumicas

A) Tincin Gram 1. Fijar la colonia a la superficie del portaobjetos con calor. 2. Aplique una gota del colorante cristal violeta sobre la muestra, espere 1min y enjuague. 3. Aplique una gota de Lugol, espere 1min y enjuague. 4. Enjuague con Alcohol-Acetona y seguidamente con agua. 5. Aplique colorante Safranina y enjuague. Las Pseudomonas son gram-negativos. B) Prueba oxidasa 1. En un trozo de papel de filtro aadir una gota de reactivo de Kobacs. 2. Depositar sobre el reactivo una colonina .
No usar asas de Nicromo (slo si son nuevas) por riesgos de obtener resultados falsos positivos provenientes del metal reducido. Se recomienda utilizar una varilla de vidrio, plstico o madera.

La reaccin positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos. Las Pseudomonas en su mayora son aerobias por lo que dan positivo a esta prueba. C) Prueba Catalasa 1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura y colocar sobre un portaobjetos. 2. Agregar una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

La mayor parte de las Pseudomonas son catalasa positivos. D) Prueba TSI (Triple Azcar Hierro) Medio TSI Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar con agitacin, hervir 1 o 2 minutos. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Ajustar el pH con cido actico e NaOH con ayuda del potencimetro. El extracto de carne y la polipeptona son fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. Siembra 1. Introducir la punta del aza hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. 2. Extender sobre la superficie del medio. 3. Incubar a 35 durante 24 horas. Las Pseudomonas son no fermentan ninguno de los 3 azcares, por lo que dan negativo a la prueba.

E) Prueba de descarboxilacin (Mtodo MOELLER) Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar con agitacin. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Llenar 2/3 del tubo y dejar enfriar de manera vertical. Ajustar el pH con cido actico e NaOH con ayuda del potencimetro. Siembra 1. Inocular en forma de estra la colonia. 2. Incubar por 24 horas a 37 C El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite la activacin de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin. Las Pseudomonas no presentan viraje de color, ya que son bacterias no fermentadoras.

F) Prueba de movilidad Medio Edward-Ewing Disolver los ingredientes en agua destilada. Calentar con suavidad la solucin. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Vaciar 5mL en cada tubo y dejar enfriar en posicin vertical. Siembra La inoculacin se hace con una aza, al introducirla y sacarla en lnea recta en 2/3 del medio, de manera que el fondo del tubo quede sin inocular y sirva como control de turbiedad. Si las bacterias no son mviles, crecern nicamente a lo largo de la lnea de inoculacin. En tanto que la las bacterias mviles lograrn desplazarse a partir de esta lnea, enturbiando el medio de cultivo, sin que sea muy aparente la lnea de inoculacin. Si las bacterias son mviles y no son fermentadoras, el crecimiento se concentrar en la superficie del medio.

Referencias
Cornelis Pierre (2008), Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology, Horizon Scientific Press, Inglaterra. Marivela C., Guerero C., Lpez L., Snchez V. y Toledo A. (2002), Metales pesados y medio ambiente. Grupo Seminario 1-26, Barcelona, Espaa. Lilia .A. Albert, Los plaguicidas persistentes y sus efectos a largo plazo. II Simposio Internacional Sobre Agricultura Sostenible. Mxico D.F., 1998. Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Investigacin en Salud y Ambiente XXXIII Reunin del Comit Asesor de Investigaciones en Salud de la Organizacin Panamericana de la Salud, OPS/CAIS/98.05, Caracas, Venezuela, 1998. Fontanillas Prez Juan Carlos, Garca-Cuenca Ariati (2005), El caracol y la helicicultura, 2 Ed., Mundi-Prensa Libros, Mxico, D.F. Escriche Roberto Isabel, Domnech Antich Eva M. (2006), Gestin Del Autocontrol en la Industria Agroalimentaria, Univ. Politc. Valencia, Valencia, Espaa. Mostafa Gamal, A.E. (2010); Electrochemical Biosensors for the Detection of Pesticides. The Open Electrochemistry Journal: 2, 22-42. Arias, Cifuentes E., Pieros Espinosa P. (2008). Aislamiento e identificacin de hongos filamentosos de muestras de suelo de los pramos de Guasca y Cruz Verde. Bogot, Colombia. MacFaddin. (2000). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, 3 edicin, editorial Mdica panamericana, Madrid, Espaa. Forbes, Sahm, Weissfeld. (2007). Diagnstico microbiolgico, 12 edicin, editorial Mdica panamericana, Madrid, Espaa, pp. 340 -345. Pseudomonas agar F. Consultada en lnea, el 21 de Abril de 2012 a las 10:30pm. URL: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/pseudoagarf.htm Pseudomonas agar P. Consultada en lnea, el 21 de Abril de 2012 a las 10:30pm. URL: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/pseudoagarp.htm Tortora, Funke y Case. (2007). Introduccin de microbiologa, 9 edicin, editorial Mdica panamericana, Madrid, Espaa.