Trabajo Practico Nro 2. ENZIMAS Determinacin de actividad - amilasa en Miel.

Bioqumica de los Alimentos Ceballos Sabatini, Vernica

OBJETIVOS GENERALES: Aplicacin de enzimas en el control de alimentos. Evaluar los efectos de la temperatura en la actividad enzimtica como control de calidad en productos alimenticios.

FUNDAMENTO TERICO La miel es un producto alimenticio lquido, espeso o cristalino, azucarado, producido por las abejas melferas mediante la recoleccin del nctar de las flores, de las secreciones procedentes de las partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos sobre ellas. Luego, la miel es enriquecida con secreciones propias de la abeja, transformada, almacenada y madurada en los panales de la colmena. La composicin de la miel depende de muchos factores, tales como especies cosechadas, naturaleza del suelo, raza de abejas, estado fisiolgico de la colonia, entre otros. Su composicin vara segn la fuente floral del nctar, y an para una misma especie botnica presenta fluctuaciones dentro de ciertos lmites. Como nctar se entiende por aquella solucin acuosa que contiene azcar y es secretada por las glndulas de las plantas llamadas nectarios, y que deriva bsicamente de la savia de las plantas por un proceso activo de secrecin. Las mieles pueden ser clasificadas segn su origen floral en: Miel monofloral: Se denomina a aquellas mieles en las que al menos el 45% del total de sus granos de polen corresponden a una misma especie vegetal. Miel bifloral: Se denomina a aquellas mieles que presentan plenes de dos especies, alcanzando un valor mnimo de 50% en su conjunto, y un porcentaje no mayor al 5% de diferencia entre ella. Mieles poliflorales: Se denomina a aquellas mieles que presenten en su composicin, en forma significativa, granos de polen de tres o ms especies vegetales, sin que ninguna de ellas alcance un porcentaje mayor o igual al 45%.

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Mieles mielada: no proceden de nctar de flores, sino de secreciones de otras partes vivas de las plantas o presentes sobre ellas por la accin de ciertos insectos.

La miel se compone principalmente de carbohidratos disueltos en agua, predominando glucosa y fructosa, encontrndose tambin en menor cantidad azcares tales como sacarosa, maltosa, etc.Las protenas, aminocidos, enzimas, cidos orgnicos, minerales, polen y otras sustancias como levaduras, algas, vestigios de hongos y partculas slidas se encuentran en menor cantidad en la miel. La miel contiene pequeas cantidades de diferentes enzimas, que son aportadas por las abejas cuando traspasan la miel desde el buche a las celdillas. Las enzimas se encuentran dentro de los componentes ms importantes de la miel, no porque sean significativas en la dieta humana, sino porque juegan un rol vital en la produccin de miel y en la calidad de sta. Las ms importantes son diastasa ( amilasa), invertasa ( glucosidasa), glucosa - oxidasa, catalasa y fosfatasa cida. La diastasa rompe las cadenas de almidn liberando dextrinas y maltosa. Los componentes enzimticos de la miel han sido investigados por aos; el principal inters ha sido distinguir entre las mieles naturales y artificiales, sin embargo, enzimas como la diastasa y la invertasa son tambin utilizadas como indicadores de la frescura y tratamientos trmicos de la miel, debido a que sus actividades disminuyen con los aos, almacenamiento inadecuado y calentamiento. La cantidad de enzima depende de la edad de la abeja, el estado de la colonia, el flujo de nctar, las condiciones del ambiente y las condiciones de prctica de la apicultura como indicador de calentamiento inapropiado de la miel. La miel debe ser autentica, no adulterada, no debe ser adicionada con azcar, masa y polen, debe haber madurado (dependiendo esta del contenido de agua y de la elaboracin de las abejas por medio de la secrecin), debe ser natural, debe estar limpia, no tener aditivos ni adulterantes, no debe haber fermentado, no debe contener contaminantes qumicos. METODOLOGIA UTILIZADA El principio de la tcnica no es un ensayo estandarizado se evala la actividad de la enzima a distintas temperaturas. El mtodo se basa en la unidad amilolitica, que es la cantidad de enzima contenida en 100 ml

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de muestra, que puede hidrolizar una solucin de 10 mg de almidn en 30 min. El rango establecido de diastasa en miel se encuentra entre 64 y 128 UD. Cantidades menores de 64 U.D. corresponden a una miel vieja, calentada, mal procesada. La determinacin se realiz utilizando una solucin estndar de almidn capaz de generar un complejo coloreado en presencia de yodo. Por la accin de la enzima presente en la muestra de miel bajo condiciones estndar, se produce una disminucin del color azul que es medido a intervalos de tiempo a una absorbancia de 640 nm. El almidn es hidrolizado por la diastasa, dando maltosa, dextrinas, etc. Por lo tanto, al agregarle la solucin de trabajo de yodo, no se observa ninguna coloracin azul debido a que el almidn ya no est disponible para reaccionar con la solucin de trabajo. Por lo contrario si aparece una coloracin azul, puede decirse que la enzima no est activa en la miel. PROCEDIMIENTO
1. Se utilizan dos tipos distintos de mieles. 2. Se mezcla 100 gr de miel en 100 ml de agua destilada.

3. Luego se distribuye 1 ml de cada muestra en 9 tubos para cada una. Es decir; Muestra 1: 4 tubos se incuban a 63 C, 4 tubos se incuban a 85 C y 1 tubo sin tratamiento trmico seria el blanco. Muestra 2: 4 tubos se incuban a 63 C, 4 tubos se incuban a 85 C y 1 tubo sin tratamiento trmico seria el blanco.
4. Se

procede al enfriamiento de las calentamiento de las muestras a temperaturas y tiempos.

muestras, luego del sus correspondientes de un de Se

5. Se incuba 1 ml de sustrato atemperado a 37 C con 400 l muestra en bao de agua a 37 C. Se realiza paralelamente control. A los 7,5 minutos se retiran del bao y se agrega 1 ml reactivo de IODO, luego se enrasa a 10 ml con agua destilada.

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mezcla por inversin. Este punto se repite para cada una de las muestras. 6. Se procede a la medicin de la longitud de onda a 640 nm, de las distintas muestras.

CALCULO DE RESULTADOS

RESULTADOS OBTENIDOS: Muestras someditas a 85C

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Conclusiones: Podemos observar que a partir de las tercera muestra es decir a tiempo 15, podemos ver que los resultados no fueron los esperados , debido a un desfasaje de tiempo producidos por la inexperiencias , ya que tardamos mas tiempo en inactivar las ensimas. Por lo cual podemos observar un aumento de la actividad de la enzima.

Muestra sometida a 65C

Conclusiones:

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En este grafico podemos ver cuando mayor es el tiempo que la ensima es sometida a calor la actividad de la ensima decae , en el grafico se puede observar , como las dos mieles en un principio tiene diferente pendiente ,sin embargo luego , las dos se comportan de la misma manera.