REVISTA INSTITUCIONAL DEL GRUPO EMPRESARIAL DE PRODUCCIONES BIOFARMACETICAS Y QUMICAS, LABIOFAM No.

1 / 2010

CITOTOXICIDAD DEL VENENO DEL ESCORPIN CUBANO RHOPALURUS JUNCEUS SUPLEMENTO NUTRICIONAL

EFECTIVIDAD COMPARATIVA DEL BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS Y TEMEPHOS

SUMARIO
4 camino, evidentes resultados Largo 7 de la produccin nacional de Importancia
productos biolgicos para la sostenibilidad de los programas de control, en la prevencin de epizootias.

No. 1 /2010

Revista del Grupo Empresarial de Producciones Biofarmaceticas y Qumicas, LABIOFAM

PRODUCTOSNATURALES
Rhopalurus 12 Citotoxicidad del veneno del escorpin cubanohumanas. junceus y sus fracciones sobre lneas celulares tumorales polvo de 20 Evaluacin de la seguridad toxicolgica delACITAN .pseudotallo de Musa paradisiaca: Suplemento nutricional

del extracto 30 Genotoxicidadratn. acuoso del Solanum torvum Sw en clulas germinales de 36 VIMANG

SALUDANIMAL
como 40 Evaluacin del uso de los liposomas contra la adyuvantes de una vacuna de ADN enfermedad de gumboro.

CONTROLDEVECTORES
operacional de biolarvicidas 68 Usoculcidos en Mariel y Bejucal. en el control de la productividad 74 Incremento dedel Bactivec . en el proceso de obtencin 80 Uso operacional del rodenticida biolgico BIORAT en Malabo, Bata y Annobn. Guinea

48

Obtencin y evaluacin de un candidato vacunal contra la Paramixovirosis de las palomas empleando la cepa La Sota del virus de Newcastle inactivado. Evaluacin de una cepa vacunal contra la Peste Porcina Clsica.

56 de 62 Evaluacin toxicolgicapara la Gentamicina infusin intramamaria uso veterinario.

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Ecuatorial, 2008.

84 Utilizacin de larvicidas biolgicos enycontrol integral de los vectores de la malaria otras

enfermedades en Accra metropolitana, Ghana

90 Efectividad comparativa del Bacillus thuringiensis var. israelensis y Temephos contra larvas de
Aedes aegypti en el municipio de Uberlndia

REPORTEDECASO

97 Bacterias que brindan salud 100 Efecto teraputico del veneno del escorpin Rhopalurus
junceus en pacientes con cncer de pncreas

104 Recomendaciones a los autores.

DIRECTOR GENERAL: DR. JOS ANTONIO FRAGA CASTRO. DIRECTORES EJECUTIVOS:ING. ISBEL GONZLEZ MARRERO, LIC. JUANA NAVARRETE MENDOZA. COMIT DE REDACCIN: DR. DORA RODRGUEZ SNCHEZ, PROF. MERCEDES RODRGUEZ EDREIRA, DR. DIGNA CONTRERAS GONZLEZ. CORRECCIN DE ESTILO: LIC. LEYDA LAGUARDIA ESQUIVEL, ING. YANELIS RIQUENES GARLOBO. ASISTENTE: LIC. YAITEL GONZLEZ IGLESIAS. DISEO GRFICO: MIGUEL GUERRERO ESCALONA, MAURICIO ZAYAS LIMA. TRADUCCIN: LIC. YENISE LONGO OLIVA. : CONSEJO CIENTFICO ASESOR: MSC. TATIANA MOLIER LEMUS, MSC. RAISELYS TOIRAC PROENZA, DR. GRISEL MONTERO LAGO, LIC. REINALDO GONZLEZ BERGARA, LIC. ROSARIO CARRERO SUREZ, DR. MARIELA GUEVARA GARCA, LIC. LILIAM LEE HERNNDEZ, MSC. VALIA VZQUEZ PITA, LIC. ARAMIS MARTNEZ ARIAS, LIC. ARAMIS RIVERO GUERRERO, LIC. CARIDAD RODRGUEZ TORRES, MSC. IRANIA GUEVARA ORELLANES, DR. M.V. HENRY A. TAIT HERNNDEZ. GRUPO EMPRESARIAL DE PRODUCCIONES BIOFARMACETICAS Y QUMICAS, LABIOFAM AVE. INDEPENDENCIA KM 16 . BOYEROS, CIUDAD DE LA HABANA, CUBA. TELF.: +537 683 0326 / 683 0391. FAX: +537 683 0326. LABIOFAM@CENIAI.INF.CU IMPRESIN: INVERPRINT Ltda.

www.labiofam.cu

EDITORIAL

omienza hoy, 28 de septiembre, el Primer Congreso Internacional LABIOFAM 2010, evento que marca la consolidacin de casi medio siglo de trabajo a favor de la salud animal en Cuba. La seriedad y constancia en el cumplimiento de esta tarea primigenia nos permite mostrar, entre los grandes logros del Grupo Empresarial LABIOFAM, la erradicacin de epidemias y enfermedades dentro del sector veterinario de nuestro pas. La historia de la institucin cientfica que auspicia el evento converge con algunos de esos grandes retos que vivi esta pequea isla del Caribe. Enfrentar una guerra biolgica bajo difciles circunstancias ilustra la abnegacin de un grupo de profesionales para neutralizar las agresiones enemigas. Mas, los nuevos tiempos marcan el camino hacia otros derroteros, esos que han motivado la investigacin y desarrollo de vacunas y mtodos diagnsticos, suplementos alimenticios para consumo humano, productos biolgicos vinculados al control vectorial, todas una amplia gama de productos y servicios que responden a los requerimientos de calidad que la industria de medicamentos exige. Cada una de las reas de estudio, con sus resultados y aplicacin prctica ser mostrada al mundo en las sesiones de dilogo y sana confrontacin que organiza esta cita cientfica de carcter internacional. Y en esta jornada en la que se inicia tan significativo Congreso, nace tambin esta Revista institucional. En sus pginas podr encontrar varias de las temticas que sern analizadas durante el encuentro con un enfoque cientfico, sin embargo, otras propuestas le permitirn, desde una perspectiva diferente, ampliar su visin acerca del Grupo Empresarial LABIOFAM. Es sana ambicin de todos los funcionarios, investigadores, especialistas, tcnicos y obreros de nuestros centros de investigaciones que las prximas jornadas, con sus debates y anlisis, propicien las condiciones para fortalecer la misin del Grupo Empresarial LABIOFAM: ofrecer salud al hombre y a la masa animal.

Dr. Jos Antonio FrAgA CAstro DireCtor generAl

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EVIDENTES RESULTADOS

LARGO CAMINO,

Feliberto MohAr hernnDez

Dr. rAFAel PolAnCo Prez

liliAn lee hernnDez

rduo y sostenido trabajo signa el largo camino recorrido por una institucin cientfica cubana que hoy muestra, entre sus muchos logros, el proveer de medicamentos y vacunas al 100 % de nuestra masa animal. El Grupo Empresarial LABIOFAM ha hecho posible la erradicacin de numerosas enfermedades y plagas en el campo de la veterinaria, lo cual repercute favorablemente en el sector econmico. La obligada evolucin de aquella idea primigenia que por decreto presi-

dencial del entonces mandatario cubano Gerardo Machado, dej constituido el 30 de junio de 1927 los Laboratorios Biolgicos de Santiago de las Vegas, permiti que productos como el Biorat, Bactivec y Griselesf motiven hoy la presencia de colaboradores cubanos en varias naciones del mundo con el solidario y humano propsito de salvar vidas. Los bioplaguicidas cubanos, cuya calidad es reconocida ya a nivel internacional, contribuyen al control de vectores trasmisores de enfermedades como la malaria, el dengue y la leptospira.

A slo 8 aos de creado, el Laboratorio cambi su nombre por Estacin Biopatolgica. A partir de ese momento varios Departamentos asumieron la elaboracin de suero anticolrico porcino, vacunas contra el ntrax y el Carbunco Sintomtico, la investigacin y diagnstico de animales enfermos o fallecidos y uno dedicado a la administracin y la contadura. Caracterizada por un pobre equipamiento de procedencia espaola, norteamericana y nacional, la Estacin elabor hasta 10 productos, alcanzando

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Portada de los Laboratorios Bio-Patolgicos de la Seccin de Industria Animal de la Secretara de Agricultura, Comercio y Trabajo.

su mxima produccin en el ao 1938. En esa poca a pesar de existir 9 mdicos veterinarios, el nivel cultural y tcnico de sus aproximadamente 46 trabajadores era bajo, propias de las condiciones socio-econmicas del pas. Con posterioridad al ao 1938 la produccin de biopreparados sufri seDecreto en el que se dispona la creacin de los Laboratorios Biolgicos de Santiago de las Vegas para la produccin del suero contra el Clera Porcino y el Laboratorio de Epizootias.

rias afectaciones, dada la creacin de laboratorios privados y a la importacin de medicamentos de uso veterinario fundamentalmente de los Estados Unidos, que cubra el 70% de la demanda nacional. Tal situacin no solo provoc la casi desaparicin de la exigua produccin estatal y privada del pas, sino que se mantuvo esta situacin hasta 1959. Al triunfar la Revolucin se nacionalizaron y fusionaron los laboratorios privados, que tenan su sede en las instalaciones de la Estacin Biopatolgica, nace as la Empresa de Laboratorios de Produccin Veterinaria, el 15 de julio de 1962. Con escasos recursos materiales y humanos comenz la produccin de medicamentos biolgicos y farmacuticos desde una perspectiva estatal, y en 1963 se inici la produccin del suero contra el Clera y Erisipela porcina. La adquisicin de nuevas instalaciones y equipamiento hicieron visible una mejora tecnolgica en 1966, desde ese instante fue posible envasar medicamentos en mpulas

y bulbos inyectables. Manteniendo su sede originaria, el 3 de enero de 1977 la Empresa de Laboratorios de Produccin Veterinaria, adquiere el nombre de Empresa Cubana de Productos Veterinarios, representada por CUBAVET. En ese momento aproximadamente 100 profesionales de las ms variadas especialidades conformaban un equipo de trabajo que lleg a estar integrado por tan slo 9 personas. Este crecimiento en la fuerza de trabajo, la mayora universitaria, represent un significativo incremento en el nmero de productos veterinarios. (figura 1) Pero tambin, desde el punto de vista estructural, existieron trascendentes modificaciones. La nueva empresa extendi su alcance a toda la nacin y ampli su visin empresarial ms all de la produccin de medicamentos al incorporar su distribucin y comercializacin a travs de las 14 delegaciones provinciales y una red de 117 farmacias. Los muchos aos de trabajo en el campo de la veterinaria, las habilidades para desarrollar y producir medicamentos, unido a la introduccin de nuevas tecnologas permitieron que CUBAVET elaborara productos de alta calidad que cumplan las exigencias del mercado internacional. (figura 2) Sin embargo, las complejas condiciones socio-econmicas y las fluctuaciones de la economa mundial en los 90, impusieron la necesidad de diversificar an ms las producciones. Este redimensionamiento gradual en cada una de las plantas productoras repercuti tambin en el nombre de la hasta entonces CUBAVET. Dado el

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Dr. Medicina Veterinaria Lic. Microbiologa Lic. Biologa Lic.Economa Lic. Control Econmico Lic. Derecho Ing. Industrial Ing. Sistema Autmatico Ing. Pecuario

Lic. Ciencias Farmacuticas Lic. Bioqumica Lic. Qumica Lic. Planificacin y Economa Nacional Lic. Contabilidad Lic. Finanzas y Precios Ing. Elctrico Ing. Qumica Arquitecto

Figura 1. Perfil profesional de la Empresa Cubana de Productos Veterinarios, CUBAVET (1977).

200 180 160

Nmero de productos

169 142

182

140 120 100 80 60 40 20 0 10 1938 1968 82

amplio perfil de las proyecciones, la institucin cientfica comenz a llamarse Laboratorios Biolgicos Farmacuticos (LABIOFAM), que en el ao 2000 adquirira el nombre por el cual responde actualmente: Grupo Empresarial LABIOFAM. A partir de este momento las plantas se transformaron en empresas y ellas a su vez se integraron para potencializar las actividades de investigacin, desarrollo, produccin y comercializacin. De esta forma se crearon las bases para nuevas producciones como: plaguicidas biolgicos, vacunas, productos qumicos para higiene, suplementos dietticos de origen natural, alimentos y envases plsticos. En este proceso de perfeccionamiento se hizo necesaria la creacin de la Empresa Comercializadora LABIOFAM S.A., con la cual se adquiri poder legal y jurdico para extender el campo de accin del Grupo Empresarial ms all de nuestras fronteras. Somero recuento vivido an entre personas que se incorporaron en algn momento de este largo camino y que continan creyendo en esta institucin cientfica. Palpables son sus muchos logros que se hacen evidentes en un Primer Congreso Internacional nacido del esfuerzo y el sacrificio de varias generaciones.

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Figura 2. Incremento productivo desde 1938 hasta 1989 .

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Importancia de la produccin nacional de productos biolgicos para la sostenibilidad de los programas de control, en la prevencin de epizootias
DrA. tAniA CAMPos Dr. PeDro ACostA liC. sAnDrA Moreno liC. XioMArA PeA DrA. rAiDA CAlDern liC. siDuet gonzlez lAbioFAM

l Grupo Empresarial LABIOFAM, se encarga de garantizar la salud animal mediante la elaboracin de preparados vacunales y medios diagnsticos de produccin nacional, los cuales permiten la sustitucin de importaciones y completar el espectro de vacunacin de nuestra ganadera y avicultura. Se ocupa adems, de investigar y desarrollar nuevos biolgicos de mejor calidad y ms econmicos, para lograr as insertarnos en el mercado internacional.

VACUNAS Vacuna contra la enfermedad de Newcastle La enfermedad de Newcastle (EN) fue inicialmente conocida en Inglaterra y Java en 1926-1927, casi simultneamente, desde entonces hasta el presente ha sido considerado como uno de los ms importantes impactos econmicos en la industria avcola mundial. En los ltimos tres aos, 88 de los 105 pases que reportan a la Organizacin Internacional de Epizootias (OIE) han descrito la presencia de virus velognicos de la Enfermedad de Newcastle. Segn el reporte de enfermedades en el tiempo de la OIE los siguientes pases del rea como Belice, Bolivia, Brasil, Canad, Chile, Colombia, Repblica Dominicana, Hait, Honduras, Mxico, Per y Venezuela, han presentado alguna de estas informaciones: - Sospecha de la enfermedad pero no ha sido confirmada. - Presencia de la infeccin pero sin signos clnicos. - Presencia de la infeccin con la presencia de signos clnicos. - Presencia de la infeccin limitada a ciertas zonas en algn perodo de los ltimos cinco aos.

En nuestro pas el ltimo reporte de la enfermedad de Newcastle se realiz en el ao 1982 sin embargo, en Mxico, a comienzos del ao 2000 se inform un brote de Newcastle producido por una cepa muy virulenta que provoc una mortalidad del 60%; en los dos siguientes meses se afectaron un total de 93 granjas de pollos de engorde y fue necesario enterrar ms de 13.6 millones de aves; las prdidas se estimaron en 50 millones de USD para los avicultores y otros 25 millones de USD al gobierno. En Cuba, a finales de la dcada del 70 fue llevada a la prctica una nueva estrategia de inmunizacin contra la EN con la utilizacin de una vacuna viva, cepa La Sota, liofilizada, producida por LABIOFAM. Esta enfermedad se ha mantenido bajo control durante casi tres dcadas, con un programa de vacunacin y medidas de bioseguridad junto a una vigilancia ininterrumpida, mediante monitoreos que permiten conocer el comportamiento de las aves cuando son vacunadas con virus vivo o inactivado como dosis de reforzamiento, para asegurar niveles satisfactorios de inmunidad materna en la progenie. Se puede afirmar, que la estrategia de inmunizacin ha sido exitosa; no obstante, la misma se revisa y perfecciona constantemente de acuerdo con la situacin

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primera vez en 1975, comenzando a difundirse a la mayora 60000000 de las provincias. Desde 1979 se comenzaron los primeros expe40000000 rimentos para lograr una vacuna que controlara las epizootias, 20000000 concluyendo todos los estudios en 1993, comenzndose su pro0 duccin industrial en LABIOFAM AOS DOSIS UTILIZADAS DOSIS PRODUCIDA a partir de 1995. En la actualidad Serie 1 2006 32880000 27736000 se producen ms de dos millones Serie 2 2007 32880000 43800000 de dosis aplicadas a la especie 2008 68864000 50892000 Serie 3 porcina segn los programas de inmunizacin del Instituto de MeGrfico 1. Cantidad de dosis de vacuna contra la EN, producidas por LABIOFAM y usadas en la Avicultura Nacional en los aos 2006, 2007 y 2008. dicina Veterinaria (IMV) con buenos resultados, mantenindose y internacional de la enfermedad. Se mantiene adems la produccontrolndose con una incidencia muy baja y sin provocar prdicin de vacunas contra la EN, segn programa de inmunizacin das econmicas significativas. Esta vacuna es una patente cubana. que tiene establecido la avicultura cubana. (grfico 1) Vacuna contra la enfermedad de Aujeszky Vacuna contra la Encefalomielitis Equina del Este (EEE) La enfermedad de Aujeszky es provocada por un herpes virus, es La EEE es clasificada epidemiolgicamente como una virosis (arinfectocontagiosa y afecta a la mayora de los animales domsticos bovirus) transmitida por artrpodos. Este virus es naturalmente y salvajes provocando alta mortalidad, sobre todo a los animales transmitido a los roedores, aves, equinos, al hombre y otros jvenes, adems de los abortos, que tienen una alta incidencia en vertebrados por varias especies de mosquito. La infeccin puede cerdas gestantes. La enfermedad est difundida a la mayora de ser inaparente en las aves y roedores salvajes; la muerte puede las provincias del pas, fue reportada por primera vez en Cuba en observarse en los equinos, el hombre y las aves domsticas. En 1965 provocando una rpida diseminacin. En 1986, un colectivo 1873 se report en Cuba los primeros antecedentes clnicos de de especialistas de LABIOFAM obtuvo la vacuna contra esta enferla enfermedad, y el virus fue confirmado en 1944. Desde 1967 medad, comenzndose a aplicar en los esquemas de inmunizacin se comenz en nuestro pas la produccin de la vacuna contra nacional para la especie porcina. De una alta incidencia que existi la EEE en embrin de pollo (Polanco y col) y a partir de 1972 en las dcada del 80 y 90, actualmente est controlada la enfermese comenzaron los trabajos experimentales en cultivos celulares. dad sin provocar grandes prdidas econmicas por estas causas. En 1993 se comenzaron los estudios con la lnea celular BHK-21 Clon 13, obtenindose la vacuna inactivada y adyuvada con gel de hidrxido de aluminio de superior calidad a la tradicional en Tabla 1. Produccin de la vacuna contra la EEE desde el ao 2002 embrin de pollo. En 2002 se concluyen todos los estudios de hasta el 2008. documentacin tecnolgica de produccin y control, as como CANTIDAD el registro del medicamento y su generalizacin en todo el pas al AOS DOSIS DE FRASCOS 100% de la masa equina. 2002 14 000 140 000 Hasta la actualidad se han producido ms de tres millones de dosis de esta nueva vacuna con buenos resultados (tabla 1). 2003 56 800 568 000 Hace ms de 40 aos que no se reportan casos clnicos de la 2004 37 400 374 000 enfermedad en el pas. 2005 32 500 325 000 Vacuna contra la Encefalomiocarditis del cerdo (EMC) La EMC es una enfermedad infectocontagiosa provocada por un 2006 64 400 644 000 cardiovirus que afecta a la mayora de los animales domsticos y 2007 62 000 620 000 salvajes, ocasionando grandes prdidas econmicas fundamental2008 40 000 400 000 mente en la especie porcina, por la alta mortalidad y los abortos que puede producir. Esta enfermedad fue reportada en Cuba por Total 307 900 3 079 000 80000000

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Vacunas polivalentes En LABIOFAM se comenzaron desde el ao 1993 los primeros experimentos para obtener las vacunas polivalentes, teniendo en cuenta la tendencia en los ltimos tiempos a la aplicacin de vacunas polivalentes para la inmunizacin de la masa animal, resultando de esta forma ms econmico y prctico los planes de ayuda y control de las enfermedades, adems del ahorro que ocasionan en materias primas y mano de obra, entre otras ventajas. En el ao 1998 se obtuvo la vacuna Bivalente contra la EMC- Aujeszky y en 2001 se concluyeron las vacunas Bivalente Aujeszky Leptospira y la Trivalente EMC Aujeszky Leptospira comenzndose a generalizar a todo el pas segn los planes de lucha y control del IMV con buenos resultados. Actualmente, ya se han producido ms de dos millones de dosis en las diferentes combinaciones polivalentes aplicadas a la especie porcina. Vacuna contra la Brucelosis. La Brucelosis es considerada una de las enfermedades que ms dao ocasiona a la economa pecuaria a nivel mundial. Es una enfermedad infecto contagiosa de evolucin lenta, causada por

los microorganismos del gnero Brucella. Sus consecuencias sanitarias son muy graves debido a que se desarrolla en especies en estrecho contacto con el hombre, de ah que los afecta tambin, por esto su caracterstica de zoonosis, demostrada por primera vez en 1905. A nivel mundial existen grandes prdidas econmicas por esta enfermedad, siendo el continente americano uno de los ms afectados, reportando prdidas de ms de 270 millones de dlares anualmente. En nuestro pas a raz del triunfo revolucionario se desarroll un amplio programa de control y erradicacin que permiti declararnos libre de Brucelosis. Dentro de este programa se destaca la introduccin a nivel nacional de la produccin de la vacuna contra la Brucelosis bovina en el ao 1996, por LABIOFAM, lo que ha permitido mantener el control de la enfermedad ante la aparicin de brotes. Conjuntamente con la vacunacin, el diagnstico de la presencia de la enfermedad ha sido de vital importancia, para el mismo se han empleado medios de produccin nacional (Rosa Bengala, Fijacin de Complemento, Prueba Lenta, entre otros) igualmente producidos en LABIOFAM, que han garantizado el pesquizaje de todo el ganado bovino a nivel nacional.

LABIOFAM SE ENCARGA DE GARANTIZAR LA SALUD ANIMAL E INVESTIGAR

Y DESARROLLAR NUEVOS BIOLGICOS

REACTIVOS PARA DIAGNSTICOS Tuberculina PPD El PPD (Derivado Proteico Purificado), es la Tuberculina que actualmente se emplea en el diagnstico alrgico de la Tuberculosis en bovinos a nivel mundial. Constituye la piedra angular en el desarrollo exitoso de un programa de lucha contra esta enfermedad, en funcin de su elevada especificidad y sensibilidad, siendo el nico mtodo confiable para la deteccin de los bovinos tuberculosos. En el ao 2008 en el III Congreso Latinoamericano de Zoonosis, se report que la infeccin tuberculosa en bovinos existe en la mayor parte de los pases de la Regin de Amrica Latina y el Caribe con importancia variable, especialmente concentrada en el ganado lechero. En todos los pases se realizan actividades de control y de vigilancia y algunos se encuentran ya en la etapa de erradicacin (Cuba, Costa Rica, Panam, Uruguay). El programa de control de la Tuberculosis bovina en Cuba se inici en el ao 1964, con cobertura nacional a todo el rebao bovino y se ha mantenido hasta la fecha de forma sistemtica. En 2002, se logr la introduccin del Patrn Internacional de Tuber-

culina PPD bovina acorde a las exigencias internacionales (1mg/ mL 32 500 UI/ mL) en la red diagnstica del pas, despus de ser analizado y avalado por el Laboratorio de Control Estatal del Instituto de Medicina Veterinaria de Cuba (LCE) y el Servicio Nacional de Sanidad Agroalimentaria de Argentina (SENASA), con la finalidad de obtener un producto armonizado y que no solo tuviera utilidad en Cuba, sino en el resto de los pases del rea. Ha permitido contar con un producto de mejor calidad en la red diagnstica nacional y est incluido en los programas de lucha y control de la enfermedad en otros pases como Venezuela, Bolivia y Repblica Dominicana. Anualmente se entregan aproximadamente 7000 frascos, que da lugar a la investigacin de 70 000 animales. Juego Diagnstico de Anemia Infecciosa Equina La Anemia Infecciosa Equina (AIE) es una enfermedad transmisible de origen viral, que slo afecta a los quidos (asnos, mulas y caballos), la cual se desarrolla con un curso crnico, generalmente presentndose de manera insidiosa luego de un ataque agudo inicial. En los animales afectados se caracteriza por fiebre intermiten-

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te, depresin, emaciacin y edema en las porciones ventrales del cuerpo. La enfermedad se ha reportado en todos los continentes. El porcentaje de animales positivos al virus es mayor en Centro y Suramrica. El virus causante de la enfermedad es un lentivirus (virus lento) de la familia Retroviridae. El diagnstico clnico de la enfermedad es difcil, independientemente que se trate de fases agudas o crnicas de la enfermedad. Se requiere generalmente de observaciones continuas del animal debido a las crisis febriles recurrentes. Existen pruebas de laboratorio satisfactorias para la confirmacin de esta enfermedad, como la prueba de agar gel difusin, la cual an es utilizada en la mayora de los pases del mundo como la prueba estndar para AIE, que ha demostrado su gran utilidad como herramienta para el control de esta enfermedad.

En Cuba, existe un programa de examen serolgico a todos los animales a travs de campaas nacionales anualmente y los animales positivos son segregados. Estos animales se alejan del resto de la masa, para evitar la infeccin a otros equinos, pues la enfermedad se transmite a travs de la picada de mosquitos, de yegua a potrillo, a travs de cuchillos y jeringas que no estn esterilizadas y agujas que se utilizan para marcar, tatuar o para sacar sangre, que han sido previamente usadas en animales infectados. El diagnstico se hace por campaa y no se autoriza el traslado de un animal de un lugar a otro sin hacer la prueba de AIE. En tal sentido LABIOFAM anualmente entrega a la red diagnstica alrededor de 5000 a 6000 juegos diagnsticos, lo cual representa la investigacin de 390 000 a 468 000 animales.

Bibliografa
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[ [N P R O D U CD EO S E N A T U R A L E S O M B R E T CCIN]

Citotoxicidad del veneno del escorpin cubano

Rhopalurus junceus
y sus fracciones sobre lneas celulares tumorales humanas
AleXis DAz gArCA1* luis Morier DAz2 herMis roDrguez snChez2 YAMirA CAbAllero lorenzo

Rhopalurus junceus

Citotoxicity of venom from Cuban scorpion

against human tumor cell lines

12
2

Departamento de Investigaciones, Laboratorios de Producciones Biofarmacuticas y Qumicas (LABIOFAM). Departamento de Microbiologa, Laboratorio de cultivos celulares, Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri.

* E-mail: alexisdg@infomed.sld.cu

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El EmplEo dEl vEnEno dEl Escorpin RhopaluRus junceus, ha cobrado gran intErs En los ltimos aos, dEbido al conocimiEnto popular dE quE alivia o cura divErsas dolEncias, incluida El cncEr. En EstE Estudio sE dEtErmin la citotoxicidad dEl vEnEno y sus fraccionEs protEicas, En los cultivos dE lnEas cElularEs tumoralEs hEla, (carcinoma dE crvix humano); hEp-2, (carcinoma EpidErmoidE dE laringE humano); nci-h292, (carcinoma dE pulmn) y En la lnEa diploidE mrc-5, (fibroblastos humano dE pulmn). El vEnEno sE fraccion mEdiantE cromatografa lquida dE baja prEsin EmplEando una columna dE Exclusin molEcular. El EfEcto dE las fraccionEs obtEnidas y dEl vEnEno, sobrE las lnEas cElularEs, sE dEtErmin a travs dE un Ensayo colorimtrico EmplEando El bromuro dE 3-(4,5-dimEtil-tiazol-2-yl)-2,5-difEnil tEtrazolio y sE calcul la concEntracin citotxica mEdia para cada uno mEdiantE rEgrEsin linEal. sE Estudi la apoptosis como mEcanismo dE muErtE cElular. El vEnEno y las fraccionEs con masas molEcularEs infEriorEs a 4 kda inhibiEron significativamEntE El crEcimiEnto dE las clulas tumoralEs con rEspEcto a la lnEa cElular diploidE. El vEnEno provoc la muErtE cElular En las clulas tumoralEs a travs dEl EvEnto dE apoptosis. las protEnas dE masa molEcular infErior a 4 kda son las rEsponsablEs dE la significativa y difErEncial toxicidad dEl vEnEno dEl Escorpin RhopaluRus junceus, sobrE las clulas tumoralEs.
palabras clavE: vEnEno dE Escorpin, RhopaluRus junceus, citotoxicidad, clulas tumoralEs.

thE trEatmEnt with vEnom from scorpion RhopaluRus junceus has raisEd grEat intErEst in thE last yEars, duE to thE popular knowlEdgE that it curE somE illnEss, includEd thE cancEr. thE main goal
of this study was to dEtErminE thE cytotoxic EffEct of scorpion vEnom and fractions against

hEla, (human cErvix carcinoma); hEp-2, (human larynx carcinoma); nci-h292, (lung carcinoma) and normal cEll linE mrc-5, (human lung fibroblast). thE EffEct
thE human tumor cEll linEs of scorpion vEnom and fractions on cEll linEs was dEtErminEd by a colorimEtric assay using thE

(3-(4,5-dimEthylthiazol-2-yl)-2,5-diphEnyltEtrazolium bromidE and thE 50% cytotoxic concEntration was calculatEd by linEar rEgrEssion analysis. thE scorpion vEnom was fractionatEd by liquid chromatography with a molEcular Exclusion column. thE mEchanism of cEllular dEath was studiEd. thE vEnom and thEir fractions with low molEcular bElow 4 kda significantly inhibitEd thE growth of tumor cElls and thE normal cElls showEd lEssEr sEnsibility. thE vEnom causEd thE cEllular dEath through thE apoptosis in tumor cElls. thE protEins of low molEcular wEight prEsEnt in vEnom of RhopaluRus junceus arE thE rEsponsiblE for thE significant and diffErEntial toxicity against tumor cEll.
kEywords: RhopaluRus junceus vEnom, low molEcular wEight protEins, citotoxicity, tumor cElls.

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l veneno de escorpin se ha empleado en la medicina tradicional en algunos pases como China e India, para el tratamiento de diversas dolencias. Los usos ms amplios comprenden el tratamiento de convulsiones, dolor y cncer [1,2]. En sus condiciones naturales, el veneno de los escorpiones, es un fluido opalescente, lechoso, con un pH 7.12, que contiene sales inorgnicas, mucopolisacridos, enzimas y una gran variedad de protenas que incluyen pptidos con masas moleculares inferiores a los 8 kDa [3]. Publicaciones cientficas recientes reconocen las potencialidades de los venenos de escorpin en el tratamiento del cncer en los que se ha observado en estudios in vitro la inhibicin del crecimiento celular y la existencia de la apoptosis como evento de muerte celular [4,5]. En Cuba el

veneno del escorpin Rhopalurus junceus, especie endmica de Cuba, ha sido empleado con fines teraputicos desde principios del siglo XlX, en que se expenda el llamado "aceite de alacrn" que se deca era til para contrarrestar la retencin de la orina [6]. Sin embargo, no es hasta comienzos de la dcada del 80 del siglo XX, en Guantnamo, que se vislumbran las potencialidades del veneno de este escorpin, como agente antitumoral a partir de estudios empricos [7]. Hasta hoy no se conoce la composicin del veneno de este escorpin y su efecto sobre clulas tumorales, por lo que en este trabajo nos propusimos determinar la citotoxicidad del veneno del escorpin Rhopalurus junceus y sus fracciones proteicas sobre cultivos de lneas celulares tumorales y normales humanas.

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RHOPALURUS escorpin cubano JUNCEUS

MATERIALES Y MTODOS Escorpiones: los escorpiones de la especie Rhopalurus junceus utilizados en los experimentos se encuentran en el escorpionario perteneciente a los Laboratorios Biolgico-Farmacuticos (LABIOFAM). Se emplearon escorpiones adultos y los mismos se mantuvieron a temperatura ambiente y la alimentacin consisti en insectos fundamentalmente Grillos sp (grillos) y Periplaneta americana (cucarachas) proporcionados una vez por semana. Veneno: el veneno se obtuvo por estimulacin elctrica del telson de escorpiones, con perodos de al menos 21 das sin extrarseles veneno. El veneno obtenido se diluy en agua destilada convenientemente, se centrifug a 15 000 rpm durante 20 min para la eliminacin de constituyentes como mucus y restos celulares. Finalmente el sobrenadante, se almacen en viales de 1.5 mL y se guard a -20C hasta su utilizacin. Estudios previos han demostrado que el almacenamiento a esta temperatura no afecta significativamente las caractersticas del extracto obtenido. La concentracin de protenas se calcul en todos los casos por el mtodo de Lowry modificado [8]. Cromatografa lquida de baja presin (CLBP): el veneno se disolvi en acetato de amonio 0.1 M (NH4Ac) con vrtex y se centrifug a 15 000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se inyect sobre una columna de gel filtracin Superdex 75 HR 10/30, con dimensiones 10 x 300 mm implementado sobre un sistema AKTA FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). La columna se equilibr con 0.1 M de NH4Ac y el material eluy en el mismo disolvente a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. La elusin del material se monitore a una longitud de onda de 280 nm durante 72 min. Se realizaron varias corridas cromatogrficas y las fracciones con tiempos de retencin similares se colectaron y se unieron, se dializaron y se calcul la concentracin como se describe previamente. La separacin y obtencin de las fracciones de veneno se realizaron a temperatura ambiente. Determinacin de las masas moleculares relativas: para la determinacin de las masas moleculares relativas se emple un estuche comercial (Amersham Pharmacia Biotech) conteniendo: ribonucleasa A (13.7 kDa), quimotripsingeno (25 kDa), ovoalbmina (43 kDa), albmina (67 kDa) y azul dextrana 2000 y se corrieron en las mismas condiciones que el veneno. A partir de los tiempos de retencin y las masa moleculares conocidas se construy una curva patrn para determinar las masas moleculares relativas de las diferentes fracciones de protenas obtenidas durante la cromatografa. Electroforesis en geles de poliacrilamida: las muestras del veneno y las fracciones se analizaron en electroforesis de protenas en condiciones no reductoras, a un 16% de gel separador y 4% del gel concentrador y se corrieron en una cmara de electroforesis (Biorad, Mini-PROTEANR ll) [9]. En cada pocillo se adicion una cantidad equivalente a 50 g de veneno y 10 g de cada fraccin. El peso molecular se estim por marcadores de peso molecular intermedio, corridos en paralelo con las muestras. La corrida se realiz a 120 V; 400 mA durante 2 h. El gel se colore con Coomasie Blue G-250 (Sigma) y se emple una solucin de destincin para visualizar las bandas de protenas. Lneas celulares: en el estudio se emplearon tres lneas celulares tumorales: Hela, (ATCC CCL-2; carcinoma de crvix humano); Hep-2, (ATCC CCL-23; carcinoma epidermoide de laringe humano); NCI-H292, (ATCC CRL-1848; carcinoma de pulmn) y la lnea diploide MRC-5, (ATCC CCL-171; fibroblastos humano de pulmn). Las lneas celulares Hela, Hep-2 y MRC-5 se crecieron en frascos de cultivo en medio mnimo esencial (MEM, Sigma), suplementados con 2 mM de glutamina y aminocidos no esenciales y 10% de suero fetal bovino (SFB). La lnea NCI-H292 se creci en medio RPMI-1640 (Sigma) suplementado con 2 mM de glutamina y 10% SFB. Cada una se incub en atmsfera hmeda a 37C a 5% de CO2 hasta formacin de monocapa. Cada lnea celular se desprendi por tratamiento con una solucin al 0.25% tripsina y se prepararon a concentracin de 2 x 105 clulas/mL. Ensayo de citotoxicidad: el efecto del veneno se detect por el mtodo de Mosmann [10]. El ensayo se realiz en placas de poliestireno de fondo plano de 96 pozos, para cultivos celulares (Corning Inc. costarR). En cada pozo se adicion 50 L de cada lnea celular y se incubaron en atmsfera de 5% CO2 a 37C durante 24 h. Al cabo de este tiempo se adicionaron 50 L de medio de cultivo correspondiente a cada lnea celular, con el veneno previamente disuelto, para quedar a concentracin final

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de 0.25, 0.5, 0.75 y 1 mg/mL en cada pocillo. El efecto de las fracciones se evalu en las clulas Hela, NCI-H292 y MRC-5. La concentracin final de las fracciones se determin a partir del por ciento que representa cada una en el veneno. Todas las lneas celulares quedaron a concentracin final de 104 clulas/pozo y el SFB se emple en el medio al 10%. Las placas se incubaron nuevamente en atmsfera de 5% CO2 a 37C durante tres das. Al cabo de este tiempo se adicionaron 10 L de una solucin estril de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-25difenil tetrazolio (MTT) (Sigma) a 5 mg/mL en solucin tampn fosfato estril, en cada pozo y se incubaron bajo las mismas condiciones durante 3 h. Finalmente se adicion 100 L/ pozo de dimetilsulfxido (DMSO, Sigma) y se incubaron durante 10 min. La absorbancia se determin en un lector de microplacas de ELISA MRX Revelation Dynex Technologies a una longitud de onda de 560 nm con 630 nm como referencia. Cada concentracin se realiz por triplicado y el ensayo se repiti tres veces. Las curvas de concentracin-respuesta se obtuvieron graficando la absorbancia versus las diferentes concentraciones de veneno. La citotoxicidad se expres como la CC50, la concentracin del veneno que causa el decrecimiento del 50% en el nmero de clulas viables (absorbancia del MTT) comparada con

controles no tratados. Los valores de CC50 del veneno y las fracciones se determinaron a partir de las curvas de concentracinefecto (% proliferacin celular) a travs del anlisis de regresin lineal, empleando el paquete estadstico GraphPad Prism versin 4.03 (GraphPad Software, Inc.). Apoptosis: para anlisis de la fragmentacin del ADN, las lneas celulares Hela, Hep-2, NCI-H292 se cultivaron en placas de 12 pozos y se incubaron a 37C, 5% CO2 durante 24 h en atmsfera hmeda. Al cabo de este tiempo se aplicaron 0.5 mg/ mL en cada lnea celular y se incub en las mismas condiciones durante 48 h y se utilizaron como controles, pozos cultivados con las lneas celulares, sin veneno. El ADN se extrajo a las 24 h y 48 h, utilizando el sistema de purificacin WisardR Genomic DNA Purification Kit (Promega)11. El ADN extrado se corri en una electroforesis submarina a 70 V, 30 mA durante 1-2 h empleando la agarosa a 1.2 %. Anlisis estadstico: todos los datos se analizaron para distribucin normal. Se realiz el anlisis de varianzas (ANOVA) seguido de un test de Rangos Mltiples de Duncan empleando el paquete estadstico GraphPad Prism versin 4.03 (GraphPad Software, Inc.). En todos los casos se consider la diferencia significativa para p< 0.05.

EL VENENO DE ESCORPIN SE HA EMPLEADO, EN LA MEDICINA TRADICIONAL, PARA EL TRATAMIENTO

RESULTADOS Cromatografa de exclusin molecular: en la figura 1 se muestra el cromatograma del veneno y las fracciones obtenidas. El veneno eluy durante 72 min a una velocidad de flujo constante de 0.5 mL/min monitoreado a 280 nm. El perfil cromatogrfico mostr un rango de elusin desde los 19 min hasta los 72 min. La fraccin FI representa la unin de protenas desde 14 kDa hasta 70 kDa. Los perfiles cromatogrficos tuvieron como promedio ocho picos. Las fracciones FII, FIII y FIV mostraron masas moleculares relativas de 8 kDa, 4 kDa y <3 kDa respectivamente. Electroforesis en geles de poliacrilamida: la figura 2 muestra el patrn electrofortico del veneno y las fracciones obtenidas en cromatografa de gel filtracin. La electroforesis mostr la presencia de dos bandas definidas a los 45 kDa, 66 kDa y 29 kDa. La banda mayoritaria se localiz debajo de los 14 kDa, mostrando que el contenido mayoritario del veneno es de protenas de bajo peso molecular. La fraccin F-I mostr un patrn electrofortico similar al del veneno completo. Las fracciones F-II, F-III y F-IV mostraron una nica banda por debajo de los 14 kDa, lo que evidencia que se corresponden con protenas de bajo peso molecular.

DEL CNCER

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Figura 1. Perfil cromatogrfico del veneno del escorpin Rhopalurus junceus separado mediante CLBP El fraccionamiento se realiz em. pleando una columna de exclusin molecular superdex 75 HR 10/30.

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M 94 kDa 67 kDa 43 kDa 30 kDa 20 kDa

FI

FII

FIII

FIV

10

23.130pb 9.416pb 6.557pb 4.361pb

14 kDa
2.322pb 2.0.27pb
Figura 2. Electroforesis de protenas del contenido total del veneno del escorpin Rhopalurus junceus y de las fracciones. La corrida se realiz a un 16% de gel separador. M) marcador de masas moleculares (14 kDa-97 kDa). V) veneno total. FI, FII, FIII, FIV) Fracciones obtenidas en CLBP . Figura 3. Electroforesis en geles de agarosa (1.2 %), del ADN extrado de las lneas celulares tumorales. 1) Marcador de peso molecular Lambda DNA /Hind III. 2-4) ADN lnea celular Hela; 2: ADN control sin veneno, 3: ADN extrado a las 24h, ADN extrado a las 48h. 5-7) ADN lnea celular NCI-H292; 2: ADN control sin veneno, 3: ADN extrado a las 24h, ADN extrado a las 48h. 8-10) ADN lnea celular HEp-2; 2: ADN control sin veneno, 3: ADN extrado a las 24h, ADN extrado a las 48h.

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inferiores (p<0.05) a la de la clula normal para las clulas NCIH292 (tabla 1). En todos los casos (veneno, FIII, FIV) la lnea celular NCI-H292 result la ms sensible. Apoptosis: la induccin de apoptosis, debido al efecto del veneno, se observ por el patrn de fragmentacin del ADN (figura 3). En las tres lneas celulares se observ el evento de apoptosis como mecanismo de muerte celular, incrementndose en la medida que aument el tiempo de incubacin con el veCC50 (mg/mL) neno. Esto indica que a mayores MUESTRAS Tr (min) Ap/At (%) MR (kDa) tiempos de incubacin un mayor Hela NCI-H292 MRC-5 Hep-2 nmero de clulas mueren por VENENO 1.05* 0.68* 2.2 0.78* este evento. FI 20.36-37.58 60 72-14 0.83 0.42 0.24 El cambio morfolgico ocurrido en la lnea celular tumoFII 49.52 16 8 0.20 0.25 0.27 ral Hela, debido a la toxicidad del FIII 54.64 9 4 0.14* 0.11* 0.44 veneno, se observa en la figura FIV 58.82 12 <3 0.82 0.28* 0.61 4. El cultivo form una monocapa homognea en el control sin Tabla 1. Valores de la CC50 del veneno y las fracciones para las lneas celulares evaluadas. Se presentan el veneno (figura 4A). La aplicacin rango de los tiempos de retencin, las proporciones de cada fraccin en el veneno y los pesos moleculares relativos. Tr: tiempo de retencin; Ap/At: rea de los picos/rea total; MR: masas moleculares relativas obdel veneno a bajas concentraciotenidas a partir de una curva de calibracin de Tr versus masa molecular de protenas de masa molecular nes provoc prdida de la morconocida.*p<0,05 diferencia estadsticamente significativa comparada con la lnea celular MRC-5.

Citotoxicidad: la evaluacin de la actividad citotxica del veneno se realiz en tres lneas celulares tumorales y una lnea diploide de pulmn humano. Los resultados evidenciaron que el veneno afect significativamente (p<0.05) el crecimiento de las clulas tumorales con respecto a la clula normal (tabla 1). Las fracciones obtenidas se agruparon en 4 grupos y se evaluaron en las lneas celulares Hela y NCI-H292 y MRC-5. F-I mostr mayor toxicidad para MRC-5 mientras F-II mostr similares niveles de sensibilidad para las tres lneas celulares. La fraccin F-III evidenci una inhibicin significativa del crecimiento de las clulas tumorales (p<0.05) con respecto a la clula normal, similar a lo observado para el veneno completo. La fraccin F-IV solo evidenci CC50 significativamente

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fologa celular tpica y ruptura de la monocapa. El aumento de las concentraciones de veneno provoc cambios celulares relacionados con el alargamiento de las clulas e irregularidad de los bordes celulares (figura 4B). Las mayores concentraciones provocaron destruccin total de la monocapa celular, fusin de las membranas celulares y formacin de grandes vacuolas por unin del contenido citoplasmtico de varias clulas y la formacin de cincitios. Tambin se observaron clulas con aumento del volumen as como clulas necrticas con picnosis y restos celulares en el medio de cultivo (figura 4C, 4D).

Figura 4. Efecto del veneno del escorpin Rhopalurus junceus, sobre la lnea celular Hela, a diferentes concentraciones. A) Lnea celular sin la aplicacin del veneno. Monocapa homognea morfologa caracterstica. B) 0.5 mg/mL de veneno. C) 0.75mg/mL de veneno. D) 1mg/mL de veneno.

DISCUSIN En este trabajo se realiz la caracterizacin parcial del veneno del escorpin cubano Rhopalurus junceus. Los resultados de la electroforesis de protenas evidenciaron la presencia de bandas de protenas entre los 29 kDa y los 67 kDa fundamentalmente y una banda por debajo de los 14 kDa lo que se corresponde con otros trabajos sobre venenos de escorpin en los que el contenido mayoritario es de protenas de bajo peso molecular [12,13] El veneno total y las fracciones F-III y F-IV evidenciaron una citotoxicidad significativa y diferencial hacia las clulas tumorales. La fraccin FIV solo evidenci toxicidad significativa hacia NCI-H292. Los principios activos presentes en la fraccin FIII que provocan reduccin significativa de la viabilidad celular en Hela podran estar en menor concentracin o no estar presente en la fraccin FIV. Por otro lado, la elevada sensibilidad de la lnea celular NCI-H292 en todos los casos (veneno, FIII, FIV) podra deberse a que ms de un componente presente en el veneno de escorpin es capaz de actuar sobre estas clulas. Las fracciones FIII y FIV mostraron masas moleculares relativas menores de 4 kDa. Los venenos de escorpin contienen protenas con masas moleculares por debajo de los 8 kDa y son consideradas toxinas [13]. La accin fisiolgica de estas toxinas se ejerce fundamentalmente sobre canales inicos, presentes en las membranas celulares de mamferos e insectos y algunas son especficas para cada especie [14,15]. En el cncer, en algunos tipos de tumores la proliferacin, migracin y la invasividad estn relacionadas con la sobreexpresin en las membranas celulares de canales ini-

cos [16] y receptores celulares [17]. El bloqueo de la actividad fisiolgica de estos canales inicos y receptores, inhibe la proliferacin y la migracin de estas clulas [18]. La elevada afinidad del veneno de algunos escorpiones por estos canales inicos y el aumento en la densidad de estos canales en las membranas de las clulas tumorales, posibilitan que exista una mayor selectividad y por tanto mayor toxicidad, hacia estas clulas [19]. Esta caracterstica podra estar relacionada con la toxicidad diferencial del veneno y las fracciones F-III y F-IV, sobre las lneas celulares analizadas. El evento de apoptosis se detect en las lneas celulares tumorales. La ocurrencia de la degradacin de ADN, a partir de las 24 h de incubacin, en Hela indic que esta lnea celular es ms susceptible de desarrollar apoptosis. Las mayores concentraciones del veneno provocaron aumento del volumen celular y elevada picnosis lo que podra indicar presencia de necrosis. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Omran M.A.A. [20] quien utilizando el veneno del escorpin L. quinquestriatus, sobre las lneas celulares eucariticas 293T y C2C12, en diferentes concentraciones, observ que slo en una subpoblacin del total de clulas ocurri el evento de apoptosis y en la poblacin restante estuvieron implicados otros eventos entre ellos la necrosis. Otros autores coinciden en sealar que existe una doble va que conduce a la muerte celular. Una caracterizada por el evento de apoptosis y la otra por la necrosis, la cual en condiciones normales es enmascarada por la primera [21,22].

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CONCLUSIN En este trabajo el veneno del escorpin Rhopalurus junceus, evidenci una significativa toxicidad sobre clulas tumorales de origen epitelial. Adicionalmente sus fracciones de masa molecular inferior a 4 kDa, demostraron similar citotoxicidad sobre este tipo celular. Aunque este trabajo no estuvo dirigido a la identificacin de dianas celulares, el hecho de que exista una estrecha relacin entre los canales inicos y la proliferacin tumoral, metstasis, migracin e invasividad y que los pptidos presentes en los venenos de escorpin podran sugerir que los principios activos del veneno de Rhopalurus junceus acten de igual forma. Posteriores estudios deben ser dirigidos a la determinacin de los principios activos y su relacin con los canales inicos.

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Evaluacin de la seguridad toxicolgica del polvo de pseudotallo de Musa paradisiaca:

Suplemento nutricional

MArA r. Prez1* gregorio MArtnez2 olgA s. len2 Jos A. FrAgA1 leYAnis Durn2 DAYn hortA2

Toxicological security of pseudostem powder Musa paradisiaca: Nutritional Supplement

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ACITAN

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Grupo Empresarial de producciones Biofarmaceticas y Qumicas, LABIOFAM. Universidad de La Habana, Instituto de Farmacia y Alimentos, Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biolgicas.

* Mara Regla Prez Capote, E-mail: mreglap@infomed.sld.cu labiofam@ceniai.inf.cu

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El psEudotallo Musa paRadisiaca posEE una variada y rica composicin En oligoElEmEntos, nutriEntEs, compuEstos fEnlicos, as como fibra diEttica como su componEntE mayoritario. a partir dEl mismo sE ha dEsarrollado un suplEmEnto nutricional dEnominado acitan. El prEsEntE trabajo tuvo como objEtivo Evaluar la toxicidad aguda oral y El potEncial irritantE En la mucosa oral. sE rEaliz un Estudio dE dosis lmitE por va oral (5000 mg/kg) y un Estudio sobrE irritabilidad dE la mucosa oral a dosis rEpEtidas. al concluir El pErodo dE obsErvacin, sE tomaron muEstras para Estudio hEmatolgico E histopatolgico. la administracin oral dEl acitan no provoc altEracionEs En la ganancia normal dE pEso corporal, as como tampoco En las variablEs hEmatolgicas ni En El Estudio histopatolgico a los rganos Examinados, no producE lEtalidad ni signos dE toxicidad por lo quE sE ubica En la catEgora toxicolgica sin clasificar. sE obtuvo un ndicE dE irritacin dE la mucosa oral igual a 1, quE lo clasifica como irritantE mnimo.
palabras clavE. acitan, irritacin, toxicidad

Musa paRadisiaca psEudostEm is composEd by rich and variEd tracE ElEmEnts, nutriEnts, phEnolic compounds and, mostly, diEtEtic fibEr. thErEforE, acitan has bEEn dEvElopEd as a nutritional supplEmEnt using this ElEmEnt. this rEsEarch is aimEd at thE Evaluation of oral sharp toxicity and thus, studiEs on oral dosE limits (5000 mg/kg) and oral mucuos irritability with rEpEatEd dosagE wErE carriEd out. samplEs of hEmatological and histopathological studiEs wErE takEn oncE thE obsErvation pEriod was ovEr. thE oral administration of acitan producEd no disordErs on normal wEight gaining, hEmatological variablEs or histopathological studiEs in organs undEr considEration. it is concludEd that thE oral administration of acitan with a 5000 mg/kg dosE doEs not prEsEnt lEthal EffEcts or toxicity signs. thErEforE, toxicologically, it is unclassifiEd. as to irritability on oral mucuos, ratE valuE was 1, classifying as a minimum dEgrEE.
kEywords: acitan, irritability, toxicity.
irritability potEntial on oral mucuos.

n la alimentacin humana hay nutrientes esenciales que son el motor bsico de nuestro metabolismo, sin los cuales no es posible una mnima nutricin. Sin embargo, es necesario adicionar, otros muchos ingredientes que permiten un mejor estado de salud, y para ello se han diseado diversas formulaciones o incorporado fuentes de origen natural en diferentes presentaciones, para suplir el dficit de algunos nutrientes deviniendo estos en suplementos nutricionales. El empleo de suplementos nutricionales ha experimentado un incremento considerable en aos recientes [1-4]. Han comenzado a ser importantes y comnmente utilizados por consumidores bajo propia decisin para lograr regmenes de salud adecuados. Un gran nmero de suplementos dietticos destinados a diferentes beneficios han sido ilegalmente adulterados con

ingredientes farmacuticos descontinuados, y potencialmente podran ser perjudiciales para los consumidores que los ingieran [5-7]. Para garantizar el uso seguro y la calidad de los mismos, la FDA, recientemente ha dictado regulaciones de buenas prcticas de manufactura para los suplementos nutricionales [8]. Desde el punto de vista investigativo las plantas son una fuente importante de productos biolgicamente activos, muchos de los cuales han servido de modelos para la sntesis de un gran nmero de frmacos, de ah que la investigacin de las mismas haya propiciado importantes avances en la teraputica de variadas enfermedades [9]. Por otra parte, las fibras dietarias son partes de frutas, vegetales, granos, nueces y legumbres que no pueden ser digeridos por los seres humanos. Mejoran la absorcin de nutrientes,

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[ [N P R O D U CD EO S E N A T U R A L E S O M B R E T CCIN]

suplemento nutricional

ACITAN
EL POLVO DE PSEUDOTALLO DE MUSA PARADISIACA CONSTITUYE UN SUPLEMENTO NUTRICIONAL
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favorecen el trnsito gastrointestinal y pueden ayudar a reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares, colesterol, prevenir el cncer, entre otros [10]. La Musa paradisiaca (Muscea) conocida comnmente como pltano est ampliamente distribuida en diversas regiones. Tradicionalmente sus frutos han sido utilizados como alimento. El pseudotallo de la planta posee una variada y rica composicin en oligoelementos, compuestos polifenlicos, fibra diettica (50%) siendo este su mayor aporte con valor nutricional [11], los cuales le adjudican al mismo una marcada actividad antioxidante [12]. Han sido reportados una gran variedad de efectos biolgicos a los polifenoles de la dieta, entre los que se incluyen anticancergenos, antioxidantes y antinflamatorios. Existen evidencias que apoyan la hiptesis de que los

polifenoles de la dieta pueden tener efecto protector y un potencial teraputico en el dao oxidativo relacionado a las patogenias [13]. El polvo de pseudotallo de Musa paradisiaca, en lo adelante ACITAN, constituye un suplemento nutricional [14]. Para introducir un nuevo agente en la prctica mdica es de obligatorio cumplimiento la realizacin de ensayos toxicolgicos que garanticen la inocuidad del producto desde el punto de vista txico, as como el establecer un margen de seguridad para su empleo. Evaluar la toxicidad aguda por va oral, as como el potencial irritante sobre la mucosa oral y la aparicin de signos de toxicidad tras la administracin del ACITAN, teniendo en cuenta que sta es la va de eleccin por la cual se administra este producto, constituyeron los objetivos de este trabajo.

MATERIALES Y MTODOS Datos de la muestra en ensayo La muestra en ensayo fue producida y facilitada por los laboratorios LABIOFAM (C. Habana, Cuba) y empleada en todos los estudios reportados en este documento. Reuna los requisitos de calidad qumica y microbiolgicos establecidos por el fabricante. Animales de experimentacin Se emplearon ratones OF1 (202g) de ambos sexos y Hmster Sirio dorados machos (602g) suministrados por el Centro Nacional para la Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana, Cuba). Se mantuvieron siete das antes del ensayo y durante el mismo bajo las mismas condiciones experimentales, a una temperatura de 202C, humedad relativa de 705%, con libre acceso al agua y los alimentos. Ciclo de luz-oscuridad 12 x 12 h. Toxicidad Aguda Inicialmente se realiz un estudio exploratorio para determinar la dosis del ensayo, donde se valoraron las dosis propuestas por metodologa de la Organizacin para la cooperacin econmica y el desarrollo (OECD) [15] (50, 300 y 2000 mg/kg), no se observaron muertes en las primeras 24 h por lo que se decidi realizar el ensayo a una dosis lmite de 5000 mg/kg, a la cual tampoco se

observaron muertes y estos animales fueron monitoreados durante 14 das El procedimiento empleado estuvo en correspondencia con los principios de buenas prcticas de laboratorio como se plantea en el procedimiento por pasos descrito en el ensayo alternativo de la Clase Txica Aguda de la OECD No 423 [15]. El ACITAN fue preparado previo a la administracin para lo cual se suspendi en CMC 0.5% en agua para obtener una concentracin final de 500 mg/mL. A los animales se les retir el alimento (slo acceso al agua) 18 h antes de la administracin de la sustancia de ensayo y se suministr pasadas 3 h de la inoculacin. Se emplearon ratones OF1 de ambos sexos distribuidos en dos grupos experimentales de seis ratones cada uno: control negativo (CMC 0.5%) y tratado con ACITAN a una dosis de 5000 mg/kg. El ACITAN se administr, por va oral, y se administr un volumen constante a razn de 2 mL/100 g de peso corporal mediante canulacin intragstrica al igual que la CMC del grupo control. Observaciones Los animales fueron observados diariamente dos veces al da durante los 14 das posteriores a la administracin con especial

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PRODUCTOS

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atencin durante las primeras 24 h, para evaluar mortalidad y morbilidad. Se examin el desarrollo de signos de toxicidad (cambios en el pelo, ojos, membranas mucosas, sistema respiratorio, circulatorio, SNA, SNC, la actividad somatomotora y el comportamiento de reflejos corneal, pineal y flexorhomolateral), control de la temperatura, as como el peso corporal de cada uno de los animales al inicio, siete y 14 das del ensayo. Al finalizar el perodo de observacin todos los animales se sacrificaron por dislocacin cervical, segn la metodologa descrita para la especie [16] fueron necropsiados y los rganos (estmago, corazn, pulmn, rin, hgado, bazo, timo, cerebro, glndulas suprarrenales, ovarios y testculos) evaluados macroscpicamente de acuerdo a coloracin, tamao y textura. Las muestras de sangre para la bioqumica sangunea fueron extradas por el plexo retro orbital bajo condiciones de anestesia. Se emple EDTA como anticoagulante. Los parmetros evaluados incluyeron: conteo de eritrocitos, conteo total de leucocitos, hemoglobina, hematocrito, conteo de plaquetas. Anatoma patolgica La necropsia incluy una examinacin macroscpica de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios, la cavidad craneal, cavidad nasal, cavidades plvicas y vscera; as como estudio histopatolgico de algunos rganos que fueron colectados de los animales despus de la necropsia y fijados en solucin de formaldehdo buferado y se procesaron segn la tcnica convencional de inclusin en parafina, para colorear con hematoxilina-eosina y evaluar por microscopa ptica (estmago, corazn, pulmn, rin, hgado, bazo, timo, cerebro, glndulas suprarrenales, ovarios y testculos). Irritabilidad de la mucosa oral. Estudio a dosis repetida Se emplearon Hmster sirios dorados distribuidos en dos grupos experimentales (control y tratado con ACITAN) de tres animales

cada uno, evaluados segn lo establecido por las normas ISO/DIS 10993-10:2002 [17]. Procedimiento experimental El pellet de algodn se embebi en la solucin de ACITAN (500 mg/mL, suspendido en CMC 0.5%) y CMC para el grupo control, se coloc en la bolsa gular, retenindose con un collar de gasa. El pellet estuvo expuesto durante 24 h, posteriormente se retir, se lav la bolsa con solucin salina fisiolgica (SSF), se observ macroscpicamente y se volvi a colocar un pellet nuevo. El procedimiento se repiti durante cinco das consecutivos. Se control el peso de los animales antes y al final del estudio. Evaluacin del dao La apariencia macroscpica de las bolsas se evalu determinando el grado de irritacin para eritema de acuerdo a la siguiente escala: no eritema: 0, muy ligero eritema: 1, moderado eritema: 2, eritema bien definido: 3 y severo eritema: 4 [18]. Al concluir la ltima exposicin los animales fueron sacrificados en atmsfera de ter, segn la metodologa descrita para la especie [16], las bolsas gulares extradas y fijadas en formol neutro, buffer al 10% y se procesaron segn la tcnica convencional de inclusin en parafina, para colorear con hematoxilinaeosina y evaluar por microscopa ptica teniendo en cuenta los parmetros: edemas, la reaccin al epitelio, congestin vascular e infiltracin leucocitaria como criterio de cambios estructurales y determinar as, el ndice de Irritacin Oral (IIO). Este resultado fue contrastado en la tabla de clasificacin para establecer as la aprobacin o rechazo de la sustancia de ensayo. (tabla 1) Anlisis estadstico Los resultados son expresados la media DS. Los datos del peso corporal, hematologa y peso de los rganos (peso absoluto y peso relativo) fueron chequeados por el test t Student. Valores de p<0.05 fueron considerados significativos.

Tabla 1. Clasificacin de las sustancias de acuerdo al ndice de irritacin oral.

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CLASIFICACIN No irritante Irritante mnimo Irritante medio Irritante moderado Irritante severo

ESCALA 0 1-4 5-8 9-11 12-16

ACEPTACIN Aprobar Aprobar Aprobar Rechazar Rechazar

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suplemento nutricional

ACITAN
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LAS PLANTAS SON UNA FUENTE IMPORTANTE DE PRODUCTOS BIOLGICAMENTE ACTIVOS

RESULTADOS Toxicidad aguda Oral No se observ mortalidad seguido de la administracin oral de 5000 mg/kg de ACITAN durante las dos semanas de observacin. Durante la observacin diaria de la ocurrencia de signos txicos sobre los diferentes sistemas (autonmicos, conductual, sensorial, neuromuscular, cardiovascular, respiratorio, ocular, gastrointestinal, genito-urinario, cutneo) no aparecieron signos txicos en los grupos tratados durante el perodo de ensayo. Comportamiento del peso corporal No se encontraron diferencias significativas (p0.05) entre el peso corporal inicial y final de los ratones tratados con ACITAN y los ratones controles (figura 1 y figura 2). El balance acumulativo en gramos del peso corporal con respecto al peso inicial de los animales se comport de modo similar en los grupos de igual sexo (hembras controles 4.20.8 g y tratadas 3.90.9 g; machos controles 7.60.6 g y tratados 8.67 0.7 g), lo cual es indicativo de la no ocurrencia de alteraciones en este parmetro.

Evaluacin de los reflejos, la temperatura y coordinacin motora No hubo modificaciones sobre el sistema sensorial en los animales tratados con respecto a los controles cuando se observa el comportamiento de las variables: estmulo pineal, corneal, flexorhomolateral. En la tabla 2 se muestran los resultados correspondientes a la temperatura rectal y coordinacin motora, donde se evidencia que no hubo diferencias estadsticas significativas respecto al grupo control, los resultados son similares para ambos sexos. Los valores representan la media DE (n= 5). Estudio hematolgico Los resultados se muestran en las tablas 3 y 4 respectivamente. A excepcin de los siguientes eventos: hemoglobina de las hembras tratadas fue significativamente menor respecto al control (p<0.001); conteo diferencial de leucocitos, incremento significativo en los neutrfilos en ambos sexos, machos (p<0.001), hembras (p<0.05); en machos aumentaron significativamente los

Control
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Control 35 30
Peso corporal (g)

35 30
Peso corporal (g)

ACITAN

ACITAN

25 20 15 10 5 0 T0 T7
Tiempo de ensayo (das)

25 20 15 10 5 0

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T14

T0

T7
Tiempo de ensayo (das)

T14

Figura 1. Curva ganancia de peso corporal de ratones machos tratados por va oral con ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg. Ratones OF 1. Los valores representan la media DE (n=5).

Figura 2. Curva ganancia de peso corporal de ratones hembras tratados por va oral con ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg. Ratones OF1. Los valores representan la media DE (n= 5).

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Tabla 2. Efecto de la administracin oral de ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg sobre la temperatura rectal y la coordinacin motora hasta los 14 das.

MACHOS VARIABLES Temperatura Rectal (oC) Coordinacin Motora (min) GRUPO ACITAN Control ACITAN Control VALOR MEDIO 36.1 1.0 36.2 0.9 > 3.0 0 > 3.0 0 GRUPO ACITAN Control ACITAN Control

HEMBRAS VALOR MEDIO 36.0 0.9 36.5 1.1 2.71 0.4 > 3.0 0

monocitos (p<0.001) y los basfilos (p<0.05), no ocurrieron alteraciones significativas en los parmetros hematolgicos. Estos valores se encuentran dentro de los lmites fisiolgicos establecidos para la especie [19, 20]. Estudio anatomopatolgico La necropsia y el estudio histopatolgico no reflejaron ningn dao en los rganos examinados. Los rganos (corazn, pulmones, timo, hgado, riones, bazo, rganos reproductores (ovarios/ testculos), adrenales) examinados macroscpicamente no evidenciaron alteraciones patolgicas en los animales administrados

oralmente con el ACITAN, comportndose en todos los casos igual al control. En la tabla 5 se pueden apreciar los cocientes de peso de los rganos (bazo, adrenales, riones, hgado, pulmones)/ peso corporal. Para estas variables no se evidenciaron diferencias significativas (p>0.05) entre los grupos tratados y controles a los 14 das. Basndonos en todos estos resultados y bajo las condiciones en las que se efectu el estudio no es posible estimar una DL50 tras la administracin en ratones OF1 por va oral, lo que presupone que sta es superior a la dosis lmite 5000 mg/kg de peso corporal.

Tabla 3. Efecto de la administracin oral de ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg sobre parmetros hematolgicos a los 14 das.

MACHOS PARMETROS Glbulos rojos (cel x103/mm3) Glbulos blancos (cel x103/mm3) Hemoglobina (mmol/L) Hematocrito (%) ACITAN 1073 170 18.71 4.07 47 5 CONTROL 1401 145 21.07 5.56 49 4 ACITAN 1198 359 3921 194

HEMBRAS CONTROL 1232 410 4109 201 16.54 5.80 38 2

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13.14 2.64** 55 5

Tabla 4. Efecto de la administracin oral de ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg sobre las poblaciones de leucocitos a los 14 das.

MACHOS PARMETROS Neutrfilos Eosinfilos Monocitos Basfilos Linfocitos ACITAN 4 2* 00 11 3 2** 91 6 CONTROL 32 00 11 10 94 3 ACITAN 3 2* 00 00 00 90 6

HEMBRAS CONTROL 00 00 00 00 94 3
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Los valores representan la media DE (n=5), * diferencia estadstica significativa respecto al control (p<0,05), ** p< 0,001.

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Tabla 5. Efecto de la administracin de ACITAN a una dosis nica de 5000 mg/kg en trminos relativos (g/peso corporal (g)) de peso de rganos los 14 das.

PESO DE LOS RGANOS/ PESO CORPORAL(X 10-3) SEXO RGANOS/ TRATAMIENTO Bazo Adrenales Riones Hgado Pulmones ACITAN 4.0 0.001 0.7 0 11.0 0 45.0 0.01 7.0 0 MACHOS CONTROL 3.0 0 0.4 0 12.0 0 44.0 0 6.9 0 ACITAN 3.8 0.001 0.6 0 16.0 0.001 55.0 0.01 7.6 0.002 HEMBRAS CONTROL 4.1 0.001 0.6 0 16.0 0.001 52.0 0.006 6.0 0.001

Los valores representan la media DE (n= 5).

Irritabilidad mucosa oral

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cador importante del estado general de los animales, fue normal Durante el estudio los animales no mostraron signos clnicos de y similar al grupo control. alteracin patolgica y mantuvieron un acceso normal al agua y Discusin general alimentos. Para velar por la seguridad de los preparados medicinales se esLa tabla 6 muestra el comportamiento del peso corporal tablecen regulaciones internacionales, que exigen amplias investide los animales al final del ensayo. La variacin de esta variable para gaciones frmaco-toxicolgicas en animales de experimentacin los animales tratados con ACITAN durante los cinco das de estudio antes de iniciar su aplicacin en seres humanos. En Cuba no se fue similar al grupo empleado como control (p0.05), no afectnha escapado al influjo de esta tendencia y dentro del Programa dose la ganancia normal del peso corporal en los animales tratados. Nacional de Medicina Natural y Tradicional del Ministerio de Salud La observacin macroscpica de la apariencia de la bolPblica (MINSAP), se establece la promocin del uso correcto de sa gular y el grado de reaccin de la superficie en sta, para erilas plantas medicinales cientficamente validadas [21]. temas, no mostr alteraciones despus de cada aplicacin con el En el presente trabajo se evaluaron en ensayos de priACITAN. Por otro lado, en el estudio histolgico no se observamera barrera los posibles efectos txicos que poda provocar la ron modificaciones de gran inters entre los grupos evaluados en administracin oral del ACITAN. el ensayo (control y ACITAN). En la tabla 7 se muestra el ndice de Un indicador importante en la determinacin de la irritabilidad de la mucosa oral tanto individual como comparado, toxicidad de cualquier sustancia lo constituye la determinacin determinados segn la clasificacin microscpica para la reaccin de manifestaciones clnicas, ya que es posible determinar daos del tejido de la mucosa oral. asociados a lesiones en sistemas de rganos, que traen por resulEl ndice de irritacin comparado(IIC) calculado para el tado alteraciones en sus funciones. Adems se plantea que toda ACITAN, al contrastarlo con el valor de la tabla de clasificacin essustancia txica produce alteraciones anatomofisiolgicas que se tablecida como patrn para la aprobacin o rechazo de las sustanmanifiestan en modificaciones en el cuadro clnico general, y estas cias permitieron clasificar a ese producto como irritante mnimo dependen de la severidad y extensin de la lesin, as como de de la mucosa oral(IIC=1) (Tabla 7). En la evaluacin macroscpica realizada durante los das de tratamiento no se evidencia- Tabla 6. Comportamiento del peso corporal. ron cambios relevantes a nivel de la mucosa. No COMPORTAMIENTO PESO CORPORAL (g) obstante, las ligeras alteraciones que dieron lugar al resultado del estudio histolgico de la mucosa, no interfirieron en el comportamiento normal de los animales tratados con el producto. Adems desde el punto de vista clnico no se apreciaron alteraciones patolgicas; la ganancia de peso corporal, indiGRUPO Control ACITAN PESO INICIAL 56.45 3.45 57.52 6.21 PESO FINAL 73.03 3.2 71.54 6.7

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Los valores representan la media DE (n= 3).

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Tabla 7. ndice de irritabilidad de la mucosa oral expuesta repetidamente con ACITAN durante cinco das.

los animales mantuvieron una apariencia normal corresponNDICE DE IRRITACIN diente a su especie. Por otra GRUPO CLASIFICACIN parte, en las mediciones de INDIVIDUAL COMPARADO los reflejos flexorhomolateControl 3 ral, pineal, corneal (indicativo ACITAN 4 1 Mnima de las funciones sensoriales y motoras), no se apreciaron modificaciones sobre el mislos sistemas de rganos involucrados, duracin de la exposicin, mo en los animales tratados con respecto a los controles. cantidad total de la sustancia en sangre, edad y salud general del El anlisis de los parmetros de la sangre constituye una animal [22]. evaluacin de riesgo relevante, algn cambio en el sistema heEn el ensayo y evaluacin de las caractersticas txicas matolgico tiene un elevado poder predictivo para la toxicidad de una sustancia, la determinacin de la Toxicidad Aguda, segn humana, cuando los datos son extrapolados desde los estudios en la va de administracin propuesta en humanos, constituye un animales. Las variaciones que tuvieron lugar tras la administracin paso inicial que provee de informacin sobre los posibles daos oral de ACITAN no tienen importancia desde el punto de vista a la salud que pueden surgir de una exposicin a corto plazo de biolgico, ya que los valores estn dentro de los intervalos noresa sustancia [23]. El peso corporal, parmetro ms sensible para males para la especie [19,26]. mostrar un efecto adverso, constituye un indicador importante de Los resultados del estudio de toxicidad aguda indican que las alteraciones fisiolgicas que puedan ocurrir en el organismo el ACITAN administrado por va oral a una dosis de 5000 mg/kg tras la exposicin a determinada sustancia [24]. La prdida aceno produce ningn signo de toxicidad o muerte en ratones, sugilerada del peso corporal (aproximadamente del 15 al 29% en riendo una DL50 por encima de 5000 mg/kg. De acuerdo a Kenun periodo de cinco a siete das) es un dato a considerar en los nedy et al. [27] y lo establecido en la OECD, las sustancias que estudios toxicolgicos [25]. presentan una DL50 superior a 5000 mg/kg por la va oral pueden El seguimiento del consumo de alimentos, as como las ser consideradas prcticamente no txicas o SIN CLASIFICAR, variaciones en el peso corporal constituyen indicadores de posibles respectivamente. Por lo tanto esto sugiere que la toxicidad aguda trastornos orgnicos causados por el agente que se ensaya. Segn los del ACITAN por la va oral es prcticamente nula. resultados del caso que nos ocupa el ACITAN no ocasiona ningn Unificando toda la informacin, los datos sugieren que la trastorno orgnico que se pueda apreciar a travs de estas variables. administracin oral del ACITAN no induce ningn efecto txico, Durante el perodo de ensayo no se evidenciaron signos lo cual puede constituir el inicio del empleo seguro para el uso de toxicidad en los animales tratados. Desde el punto de vista clnico mdico de este producto.

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suplemento nutricional

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Genotoxicidad del extracto acuoso del en clulas germinales de ratn

Solanum torvum Sw
AnbAl DoMnguez oDio1* eDgAr Puente zAPAtA2 lzAro ibrAhiM roMero gArCA3 irelA YolAine Prez AnDres2 hilArio sAlAs Perez2

Genotoxicity of

Solanum torvum Sw

aquous broth on germinal mouse cells

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Direccin de Investigacin y Desarrollo. Grupo Empresarial de Producciones Biofarmaceticas y Qumicas, LABIOFAM. Centro de Toxicologa y Biomedicina. Laboratorio de Gentica Toxicolgica. Departamento de Docencia. Hospital Clnico Quirurgico y Docente Saturnino Lora Torres.

* E-mail: anibalodio@yahoo.com, anibalodio@gmail.com

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sE rEaliz un Estudio para Evaluar la gEnotoxicidad dEl Extracto acuoso dE las hojas dE solanuM toRvuM En clulas gErminalEs dE ratn, mEdiantE El Ensayo dE morfologa dE la cabEza dEl EspErmatozoidE. sE administr Extracto acuoso a ratonEs cEnp:nmri por va oral En dosis 500, 1000 y 2000 mg/kg dE pEso corporal cada 24 h durantE los primEros cinco das dEl ExpErimEnto. los parmEtros toxicolgicos Evaluados fuEron pEso corporal (0, 6, 12, 18 y 35 das), dEnsidad y morfologa EspErmtica (35 das). al finalizar El ExpErimEnto sE dEmostr quE El s. torvum no indujo altEracionEs toxicolgicas En El 100% dE los animalEs tratados. sE concluyE quE El Extracto acuoso dE s. torvum no rEsult citotxico ni gEnotxico En las clulas EspErmticas dE ratn y bajo las condicionEs ExpErimEntalEs dEscritas.
palabras clavE: solanuM toRvuM, clulas gErminalEs, citotoxicidad, gEnotoxicidad.

a study was carriEd out to EvaluatE gEnotoxicity of aquEous broth of solanum torvum lEavEs on gErminal mousE cElls, through a morphological assay on spErmatozoon hEad. aquEous broth was administErEd to cEnp: nmri micE, orally, with a 500, 1000 y 2000 mg/kg wEight dosE, Each 24 h for thE first fivE tEst days. t oxicological pattErns EvaluatEd body wEights (0, 6, 12, 18 y 35 days) as dEnsity and spErmatic morphology (35 days). oncE tEst was finishEd, it was provEd that s. toRvuM prEsEntEd no toxicological EffEcts on 100% of trEatEd animals. it is concludEd that aquEous broth of s. toRvuM lEavEs is nEithEr cytotoxic nor gEnotoxic on mousE spErmic cElls within thE prEvious tEst conditions.
kEywords: solanuM toRvuM, gErminal cElls, cytotoxicity, gEnotoxicity.

lo largo de los siglos muchas plantas han sido utilizadas por sus propiedades curativas, tradicin transmitida por generaciones hasta la actualidad. Estos conocimientos heredados constituyen el fundamento de la fitoterapia actual y el punto de partida, de muchas investigaciones destinadas a otorgarle a esta prctica seguridad, efectividad y calidad. [1-3] La planta Solanum torvum Sw (familia Solanaceae, gnero Solanum), conocida popularmente en Cuba por el nombre Prendejera, es una de las especies que forma parte del arsenal teraputico de la flora de nuestro pas. Es un arbusto silvestre utilizado en la medicina tradicional por sus propiedades narcticas, diurticas, antiartrticas, antimicrobianas, anticonvulsivantes, entre otras [4]. De igual forma, se tiene confirmacin experimental de sus

propiedades antiparasitarias especficamente contra Rhipicephalus boophilus microplus, Haemaphysalis bispinosa y Paramphistomum cervi, [5]; antibacterianas incluyendo Helicobacter pylori [6, 7] y antimalarica [8]. Tambin sobresale por sus efectos favorables sobre la presin arterial y el metabolismo de la fructuosa en ratas hipertensas [9], y por sus efectos antiglicemiantes fundamentalmente por inhibir la enzima alfa-glucosidasa contenida en las clulas intestinales de ratas [10]. Sin embargo, a pesar de existir estos antecedentes y evidencias cientficas, su uso se ha evitado debido a la citotoxicidad de algunos de sus componentes [11]. En este contexto, resulta importante determinar el potencial genotxico de esta planta, como una va para determinar el riesgo de dao gentico en las personas que la consumen. De todos los ensayos disponibles, el ensayo de morfologa de la ca-

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beza del espermatozoide en roedores tiene especial relevancia, pues permite identificar compuestos que interactan con el cido nucleico de las clulas germinales masculinas y con ello, predecir las alteraciones negativas de su capacidad fertilizante y el riesgo de ocurrencia de ciertas enfermedades genticas en las futuras generaciones. Posee adems como atractivo adicional, la existencia de experiencias en evaluaciones de extractos vegetales [12-14],

solanum
PRENDEJERA, ES UNA DE LAS ESPECIES QUE FORMA PARTE DEL ARSENAL TERAPUTICO DE LA FLORA DE NUESTRO PAS
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componentes vacunales parenterales y mucosales [15], radiofrecuencias [16], metales pesados [17], preservantes alimentarios [18] y medicamentos [19]. Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo tuvo como propsito evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad del extracto acuoso de las hojas de S. torvum, en clulas germinales de ratn, mediante el ensayo de morfologa de la cabeza del espermatozoide.

MATERIALES Y MTODOS Colecta del material vegetal: el material vegetal elegido para este estudio consisti en hojas sanas de S. torvum. Su colecta siempre fue realizada en horario de la maana, y en lugares pertenecientes al macizo montaoso Nipe-Sagua-Baracoa a 475 m sobre el nivel del mar. Preparacin del material vegetal y extracto acuoso: las hojas se sometieron a un proceso de secado en una estufa con circulacin de aire caliente a una temperatura de 37C durante cuatro das continuos, para posteriormente triturarse. El extracto acuoso fue obtenido por decoccin a partir de 50 g de material vegetal en 100 mL de agua destilada estril. Para garantizar la mayor extraccin posible de los principios activos del tejido vegetal, el solvente fue renovado tres veces seguidas por otro fresco cada 30 minutos aproximadamente. Culminada esta fase, se filtr a presin reducida en condiciones de esterilidad y se concentr en un evaporador rotatorio, hasta obtener el sirope, el cual se liofiliz y almacen en recipientes color mbar con tapas hermticas a temperatura de 8C, hasta el momento de su utilizacin. Animales de experimentacin: se utilizaron ratones machos adultos jvenes de la lnea Cenp: NMRI, con edades entre 8-12 semanas de edad y peso corporal entre 27-30 g, suministrados por el Centro Nacional para la Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Todos se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura (223C), humedad (30-70%) y perodos de luz/oscuridad de 12/12 h. La alimentacin consisti en una dieta a base de pienso concentrado multipropsito convencional CMO 1000 procedente del CENPALAB y agua fresca ad libitum. Grupos experimentales: se conformaron cinco grupos experimentales con cinco ratones cada uno: un grupo control ne-

gativo (agua destilada estril), tres grupos tratados con diferentes dosis de extracto acuoso de S. torvum (500, 1000 y 2000 mg /kg de peso corporal (PC) y un grupo control positivo (ciclofosfamida) en dosis de 40 mg/kg PC. Administracin y dosificacin: todos los grupos se administraron por va oral con una cnula intragstrica, en el horario de 9:30-10:30 am, cada 24 h durante los primeros cinco das del experimento y con 16 h de ayuno. Las dosis de 500, 1000 y 2000 mg /kg PC, se diluyeron en agua destilada estril una hora antes de cada administracin. Observaciones: los animales fueron observados diariamente (dos veces al da), registrando la presencia de signos de toxicidad como: alopecia, disnea, inapetencia, diarreas, temblores, convulsiones, salivaciones, letargo, sueo y coma. Cada uno de los animales fue pesado al inicio y a los 6, 12, 18 y 35 das del experimento. Procedimiento experimental: a los 35 das despus de la ltima administracin, los animales se sacrificaron por dislocacin cervical y se les extrajo ambos epiddimos, los cuales fueron reducidos a pequeos fragmentos y depositados en placas Petri que contenan 2 mL de solucin isotnica de NaCl 0.9%. El contenido se homogeniz y se filtr para realizar el anlisis de las siguientes variables. Citotoxicidad: se tom un 1 mL de la suspensin espermtica anterior y se coloc en una cmara de Neubauer (DDR, Alemania), para determinar densidad espermtica. Genotoxicidad: a la suspensin espermtica restante se le aadi tres gotas de eosina al 1%, luego se homogeniz y se dej reposar por cinco minutos. Transcurrido ese tiempo, se realizaron dos frotis por cada animal en portaobjetos codificados. Se analiza-

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torvum
RESULTADOS Y DISCUSIN Los animales tratados con las diferentes dosis de extracto acuoso del S. torvum no presentaron mortalidad, ni signos de toxicidad, concluyendo el estudio con un 100% de supervivencia. En la figura 1 se muestra el comportamiento del peso corporal en diferentes momentos del experimento, demostrndose que ninguno de los grupos administrados con 500, 1000 y 2000 mg/kg PC de extracto acuoso de la planta tuvieron afectacin significativa de la ganancia de peso corporal cuando se les compar con el control negativo (p<0.05). La densidad espermtica determinada para cada grupo experimental se muestra en la tabla 1. Los valores para este paPeso Corporal (G)

ron 1000 espermatozoides de forma consecutiva por animal y por un mismo observador, en un microscopio ptico con aumento de 100 x. El criterio de clasificacin morfolgica se bas en cabezas espermticas normales y anormales segn criterio de Wyrobeck y Bruce, 1975 [20] y Dobrzyriska y Gajewski, 2000[21]. Anlisis estadstico: se verific la distribucin de las variables tenidas en cuenta por medio de la prueba de Kolmogorov-

rmetro en los animales administrados con dosis de 500, 1000 y 2000 mg se comportaron de manera similar a los obtenidos en el grupo control negativo. Referente a las alteraciones morfolgicas en las cabezas de los espermatozoides, los resultados se muestran en la tabla 2. La administracin del extracto acuoso no produce incrementos significativos en la frecuencia de aparicin de espermatozoides anormales, en ninguno de los criterios de clasificacin tenidos en cuenta, con respecto al grupo control negativo. La no deteccin de efectos citotxicos y genotxicos en el grupo tratado con diferentes concentraciones de extracto acuoso de S. torvum, permite inferir que su administracin no afecta ninguna de las etapas que forman parte de la espermatognesis. Este comportamiento favorable podra relacionarse con la presencia de la barrera hematotesticular que protege a las clulas espermticas de efectos txicos [22], a las posibles ausencias o bajas concentraciones de las sustancias 45 responsables de dichos efectos en 40 el extracto acuoso de las hojas, y 35 quizs al recin descubierto efecto 30 antioxidante de la planta en tejidos Negativo 25 de roedores [23]. S. torvum 500 mg 20 A diferencia de lo obserS. torvum 1000 mg 15 S. torvum 2000 mg vado en los grupos administrados 10 Positivo con extracto acuoso de S. torvum, 5 los tratados con ciclofosfamida 0 (control positivo) mostraron afec0 6 12 18 35 Dias De Pesaje taciones significativas en todos los parmetros toxicolgicos tenidos Figura 1. Comportamiento del peso corporal en ratones NMRI (n=5) administrados con extracto acuoso de S. torvum, * diferencia significativa segn prueba de Kruskal Wallis (p<0.05). en cuenta, validndose la conduc-

SW
Smirnov, y una vez comprobado se procedi a identificar variaciones estadsticamente significativas del peso corporal, en los cinco grupos experimentales durante los das 0, 6, 12, 18 y 35 del estudio, utilizando una ANOVA no paramtrica de Kruskal Wallis (das de pesaje y grupo experimental). Para ambas pruebas estadsticas fue seleccionado un nivel de significacin = 0.05. En todos los casos se emple el programa estadstico SPSS 12.0.
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Tabla 1. Comportamiento de la densidad espermtica en ratones NMRI administrados con extracto acuoso de S. torvum.

GRUPOS EXPERIMENTALES Control negativo

DOSIS (mg/kg) 500

DENSIDAD ESPERMTICA* (106 x mL) 38 a 44 a 47.8 a 38 a 18.67 b

S. torvum

1000 2000

cin de este ensayo en nuestras condiciones experimentales. De igual manera se pudo conocer, que la dosis utilizada no es letal, y que adems permite una posterior recuperacin del peso corporal en los animales tratados al final del experimento. La citotoxicidad y genotoxicidad hallada en este grupo, estn en correspondencia con lo reportado por otros autores, para esta sustancia y tipo de ensayo [12, 24, 25]. Tal comportamiento es producto a que sus metabolitos logran interactuar con las clulas de Sertoli y directamente con las clulas germinales, disminuyendo su produccin y maduracin [26].

Control positivo

40

*valores expresados como medianas, letras diferentes difieren significativamente entre s para la prueba de Kruskal Wallis, (p<0.05).

Tabla 2. Comportamiento de la frecuencia de aparicin de espermatozoides anormales en ratones NMRI administrados con extracto acuoso de S. torvum.

GRUPOS EXPERIMENTALES Control negativo

DOSIS (mg/kg) 500

FRECUENCIA* /1000 CLULAS SIN GANCHO 4a 3a 4a 4a 15 b BANANA 4a 2a 6a 5a 50 b AMORFO 7a 6a 4a 6a 22 b

S. torvum

1000 2000

Control positivo

40

*valores expresados como medianas, letras diferentes difieren significativamente entre s para la prueba de Kruskal Wallis, (p<0.05)

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CONCLUSIONES El extracto acuoso de las hojas de S. torvum no result citotxico ni genotxico en las clulas espermticas de ratn, bajo las condiciones experimentales descritas.

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Solanum torvum

SW

Agradecimientos Esta investigacin ha sido financiada parcialmente por el proyecto 36-06/04 (CITMA-MINSAP), titulado Evaluacin toxicolgica de plantas medicinales con accin antimicrobiana, empleadas en la salud comunitaria. Se agradece igualmente el apoyo del MSc. Alfredo Alfonso Castillo, DMV. Dany Larramendi Grian, DMV. Pedro Surez Arias, DMV. Petra Aguilera Feria y Tc. Narvis Sedeo Soular, pertenecientes todos al Centro de Toxicologa y Biomedicina de Santiago de Cuba.

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FRMULA NATURAL QUE BRINDA SALUD

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Extracto acuoso, crema cosmtica y jarabe

VIMANG

egada por los abuelos de nuestros abuelos, nacida de la prctica cotidiana, de esa necesidad de tomar de la naturaleza la cura a las ms dismiles dolencias, la medicina natural y tradicional contina presentndose, todava hoy, como un recurso a tener en cuenta para el tratamiento y profilaxis en temas vinculados a la salud. Aunque no toda la comunidad cientfica apuesta por este tipo de terapia, la constancia y el empeo de muchos en no dejarla morir conceden el privilegio de poder aprovechar sus bondades. Eleuterio Pez, convencido de las propiedades de la corteza de la planta de mango, conocimiento que asumi por tradicin familiar, marc las pautas para esta investigacin en Cuba. Desde pequeo refiere Pezmi padre curaba todos los malestares de

la familia cocinando un poco de aquellos pedacitos de corteza que el mismo recolectaba en el campo. Siempre supe que no todos los rboles de esta extensa familia, la Mangifera indica L. eran apropiados para ese brebaje. Ms de 200 tipos de anacardiceas, originarias del continente asitico, estn distribuidas en todo el mundo, sin embargo, alrededor de 15 son las empleadas en acciones curativas de manera efectiva. Aos de investigacin emprica, con convincentes resultados, llamaron la atencin a un grupo de especialistas que se incorporaron a este estudio aportando valor cientfico con sus evaluaciones preclnicas y clnicas. Para el Master en Ciencias Reymundo Miranda Leyva, especialista en II grado en Medicina Tradicional y Natural, quien lleva ms de 15 aos vinculado al

proyecto, este compuesto natural es un poderoso antioxidante, incluso ms fuerte que la combinacin de vitamina A, C y E. Tambin se destaca como analgsico, antiinflamatorio e inmunorregulador. Recientemente se le descubrieron, en estudios pre clnicos, adems, valores antiangeognico lo cual abre un camino hacia el posible tratamiento de enfermedades oncolgicas. Este suplemento nutricional resulta beneficioso, adems, para desacelerar los procesos de envejecimiento de la piel, propiedad esta que se la otorgan los flavonoides polifenlicos, los oligoelementos, los cidos grasos polinsaturados y una rica variedad de minerales presentes en su composicin. En busca de satisfacer la demanda En el municipio de Arroyo Naranjo, donde se interceptan las avenidas 100 y Ojo

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de Agua, radican el laboratorio y la planta de produccin en la cual se elaboran los principales productos de la lnea Vimang crema cosmtica, jarabe y extracto acuoso que responden a la marca comercial Natura, perteneciente al Grupo Empresarial LABIOFAM. La alta demanda de cada uno de estos compuestos de origen natural ha dirigido la mirada hacia la necesidad de ampliar las capacidades de la industria. Osvaldo Martnez, director de este centro, anunci la puesta en prctica de nuevas vas para obtener mayores cantidades del extracto concentrado, sustancia base para la fabricacin de la crema, el extracto acuoso y el jarabe. Estamos utilizando en estos momentos, a manera de prueba, una planta de glucosa en la provincia de Cienfuegos, que tiene un sistema de maceracin, extraccin y concentracin por efecto muy similar al nuestro. Con esto asumimos un proceso a gran escala que nos permitir lograr miles de litros de este concentrado primario, lo cual redundar favorablemente en un incremento notorio de nuestras producciones finales. Una clnica para el Vimang Es inters de los directivos, especialistas, tcnicos y obreros que desarrollan los productos Vimang, que este compuesto sea empleado de manera profilctica y no slo como una opcin extrema para la solucin, o como paliativo, a determinados problemas de salud. Es evidente una mejora en la calidad de vida de la persona enferma, mas, su consumo habitual, a decir de Pez puede evitar padecer de un sinnmero de enfermedades.

Como parte de este proyecto de salud en 100 y Ojo de Agua tambin radica una clnica de atencin mdica terciaria a la que asisten todas las personas interesadas en este tipo de terapia. El doctor Reymundo, responsable del grupo mdico, reafirma que la profilaxis es lo ms importante del compuesto natural, sin embargo, para lograr presentarlo como un medicamento se tendra que hacer un estudio ms profundo, trabajar en la dosificacin, realizar muchos ms ensayos clnicos, ya que con ellos podremos demostrarle a los escpticos que el Vimang es muy bueno. All los pacientes pueden adquirir todos los productos prescritos por el facultativo en una farmacia que logra mantener una oferta estable. Una familia se reencuentra Cada agosto pacientes y especialistas se renen para exponer sus experiencias en el uso de los productos Vimang, un encuentro en el que se confirma cuanto de beneficioso puede resultar su consumo sistemtico. Acudir a esta cita representa una manera de mostrar agradecimiento.

Segn las evidencias puestas de manifiesto entre los presentes, los valores del reconstituyente van ms all de sus propiedades beneficiosas para la salud, a decir de muchos, a estas se le incorporan la calidad humana y la sensibilidad de todo el personal que labora en la clnica. Esta convergencia de cualidades provoca que el Vimang potencie su efecto curativo. Los estudios sobre el alcance del referido compuesto natural para la salud humana son an una pgina abierta. A pesar de las barreras que persisten para aceptar la medicina tradicional y natural como una terapia efectiva, los directivos y especialistas del centro de investigaciones Vimang trabajan por consolidar este noble proyecto de salud.

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