Microbiología General

Microbiologia General
Antonio G. Pisabarro Catedrtico de Microbiologa
Estructura de los microorganismos

Clulas procariotas y eucariotas. Tamao y morfologa de las bacterias. Observacin microscpica de los microorganismos. Tinciones. Membrana bacteriana y peptidoglicano. Bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Ribosomas bacterianos. Elementos facultativos de la clula procariota. Cpsula y capas mucosa. Apndices bacterianos: flagelos y fmbrias. Endosporas. Estructura de los virus.

rbol filogentico universal
Eucariontes
Patgenas
Procariontes
Microorganismos Prescott
Clulas procariticas y eucariticas
3.000x106 aos
Woese, Carl R. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8392-8396
Copyright 2000 by the National Academy of Sciences
Biologa de los Microorganismos de Brock
Estructura de las clulas eucariticas
Estructura interna de una clula eucariota
1- Ncleo con varios cromosomas 2.- Organismos diploides 3.- Citoplasma con orgnulos celulares (mitocondrias, retculo endoplsmico, Golgi, vacuolas, etc). 4.- Ribosomas eucariticos 80S Los microorganismos eucariticos ms relevantes en clnica incluyen ciertos animales de pequeo tamao productores de enfermedades parasitarias, protozoos y hongos unicelulares o pluricelulares.
Levaduras
Saccharomyces cerevisiae
Cryptococcus neoformans
Estructura de la hifa de un hongo

Vacuola Retculo endoplsmico de vesculas de sntesis de pared celular
Spitzenkorpen conjunto
Pared celular formada por quitina y polisacridos. Diferente de las de plantas y bacterias
Ncleo eucaritico
Mitocondrias
Estructura de las clulas procariticas Formas y tinciones
Morfologa de bacterias (G+)

Mesosoma Ncleo Ribosoma Cuerpos de Inclusin Cpsula
Protenas Superficiales
Pared Celular
Espacio Periplsmico
Membrana Plasmtica
Flagelo
No existe la separacin entre ncleo y citoplasma Haploides

Tamao y morfologa de las bacterias.

La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias poseen una de las tres formas fundamentales: esfrica, cilndrica o hlice.
Formas L: estado de una bacteria que carece de peptidoglicano (pared celular) Las formas L son conocidas desde 1930 Las formas L son similares a los micoplasmas Las formas L son resistentes a los antibiticos -lactmicos No se sabe si en la naturaleza las formas L son un accidente o una adaptacin que permite a algunas bacterias escapar del sistema inmune y emigrar a otras localizaciones en el cuerpo
Tamao y morfologa de las bacterias. Formas L

A B
Clulas normales de Bacillus subtilis (A) y formas L de esta bacteria (B)
Ryuji Shingaki et al. 2003. Induction of L-form-like cell shape change of Bacillus subtilis under microculture conditions. Microbiology (2003), 149, 25012511
Formas L
Micrografas electrnicas de formas L de B. subtilis
Ryuji Shingaki et al. 2003. Induction of L-form-like cell shape change of Bacillus subtilis under microculture conditions. Microbiology (2003), 149, 25012511

Las clulas esfricas se denominan cocos y suelen ser redondeadas aunque pueden ser ovoides o elpticas.
Estafilococo
Estreptococo Diplococo

A las de forma cilndrica se las denomina bacilos. Los extremos de estas clulas suelen ser redondeados, rectos, en forma de huso o cuerno.
Bacillus anthracis
Escherichia coli

A las de forma espiral o helicoidal se las denomina espirilos y se caracterizan por su forma de sacacorchos.
Treponema pallidum

Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen constante su forma, algunas especies pueden variar la forma por lo que se les llama pleomrficas. Arthrobacter es un ejemplo de pleomorfismo debido a que su forma cambia en funcin de la edad del cultivo.
Arthrobacter spp.

Tamao: Invisibles al ojo humano las bacterias se miden en m que equivale a 10-3 mm. El tamao de las bacterias vara dependiendo de las especies entre menos de 1 m y 250 m; siendo lo ms habitual entre 1 y 10 m. En las clulas bacterianas la relacin superficie y volumen de la clula es muy alta lo que permite la entrada de muchos nutrientes para alimentar a un pequeo volumen y una alta actividad metablica
1 mm
10 m Lmite de resolucin ocular

Antonie van Leeuvenhoek

Delft, Holanda 1632-1723 Fue el primero en ver espermatozoides, clulas de la sangre y bacterias
Antonie van Leeuvenhoek
Bacterias de la placa dental
Microscopio ptico
Debido a su pequeo tamao, la observacin de los microorganismos ha de realizarse mediante el uso de microscopios. En el caso de la mayora de los microorganismos procariticos, la observacin microscpica se limita a determinar la forma, el modo de agrupamiento, el movimiento y la presencia de algunos elementos extracelulares tales como las cpsulas. En el caso de microorganismos eucariticos, la informacin que se obtiene de la observacin microscpica es mucho mayor porque tambin lo es su diversidad morfolgica y anatmica.
Resolucin de microscopios
La resolucin indica el tamao mnimo distinguible La resolucin del mejor microscopio ptico est limitado unas 0,2 m con un de 540 nm (luz verde) La resolucin de un microscopio electrnico de transmisin (MET) es de cerca de 2 nm La resolucin del microscopio electrnico de barrido (MEB) es de 1 - 10 nm

Tinciones
TINCIN SIMPLE Permite observar la forma, tamao y agrupamiento de las bacterias usando un nico colorante (normalmente bsico).
Escherichia coli
Bacillus coagulans
Tincin de Gram
Bacterilogo dans graduado en medicina en Copenhague en 1878, viaj por varios pases de Europa entre 1878 y 1885 estudiando farmacologa y bacteriologa. Mientras se encontraba en Berln en 1884, descubri el mtodo para teir las bacterias que lleva su nombre y que se usa ampliamente para clasificar las bacterias. Gram sigui el mtodo de Paul Ehrlich, utilizando una solucin de anilina y violeta de genciana. Despus un tratamiento con lugol (iodo en yoduro potsico acuoso) y etanol observ que algunas bacterias retenan el colorante (por ejemplo los neumococos) mientras que otras no lo hacian. Esto permiti dividir las bacterias en Grampositivas y en Gram negativas, clasificacin que es de gran utilidad hoy da para elegir un tratamiento antibitico. En 1891 Gram fu nombrado profesor de farmacologa de la Universidad de Copenhague, donde mostr un gran inters en los aspectos clnicos de la farmacologa. Fu un mdico practicante durante toda su vida. Fu Presidente de la Comisin de la Pharmacopoeia entre 1901 y 1921 y directro del departamento de medicina interna del Hospital Frederick de Copenhague, hasta su retiro 1923.
Tomado de: http://www.iqb.es/historiamedicina/lista.htm
Hans Christian Joachim GRAM (1853 - 1938)
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Gram Es un sistema de dos tinciones simples sucesivas, separadas por una fase de decoloracin selectiva. Permite diferenciar las bacterias que retienen el primer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen (Gram-negativas). Esta diferencia en comportamiento refleja diferencias estructurales y fisiolgicas entre ambos grupos de bacterias.
Staphylococcus aureus
Neisseria meningitidis
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Gram
Bacillus cereus
Klebsiella pneumoniae
Tincin de Gram: Staphylococcus aureus
Es una bacteria gram-positiva (tincin azul) con forma de coco (coccus), que forma racimos (staphylo-) caractersticos
Tincin de Gram: Enterococos
Son bacterias del grupo de los estreptococos (forman cadenas) Gram positivos (coloracin azul) que se ven teidos sobre un fondo que contiene clulas eucariticas (que se ven aqu en color rojo)
Tincin de Gram: Acinetobacter baumanii
Es una bacteria negativa (tincin roja) con forma de bacilo pequeo aislado
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Gram
Tincin de Gram de una muestra de lquido cerebroespinal infectado con B. anthracis
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL Tincin de esporas
Bacillus cereus
Clostridium botulinum
Tinciones
TINCIN DIFERENCIALTincin de Ziehl-Neelsen (cido-alcohol resistencia) Es un tipo especial de tincin que permite la identificacin de microorganismos de los grupos Mycobacterium y Nocardia de gran relevancia clnica
Mycobacterium leprae
Mycobacterium tuberculosis
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL Tincin de cpsulas Se trata de una tincin negativa usando tinta china que permite determinar la presencia de cpsulas polisacardicas.
Cryptococcus neoformans
Tinciones
TINCIN DIFERENCIAL Tincin de flagelos Permite teir flagelos usando un mordiente para incrementar su grosor y hacerlos visibles al microscopio ptico.
Vibrio cholerae
Proteus sp.

Membrana bacteriana
ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA INTERNA La membrana interna est formada por una bicapa lipdica. En las bacterias los lpidos que forman esta membrana son generalmente fosfolpidos y no se encuentran esteroles (salvo en el caso de los micoplasmas). Esto diferencia claramente las membranas bacterianas de las de clulas eucariticas que s tienen esteroles en sus membranas FUNCIONES DE LA MEMBRANA INTERNA 1.- Barrera de permeabilidad selectiva 2.- Soporte ordenado de sistemas enzimticos
Membrana plasmtica
Fosfolpidos Grupos Hidroflicos
Grupo Hidro fbicos
Fosfolpido Protenas de Membrana

Acciones de las Protenas de Transporte

Exterio r
Uniporte Molcula Transportada Molcula Cotransportada
Simporte
Antiporte
Interio r
Comparacin del Transporte Activo con la Difusin Simple
Transporte activo Concentracin Interna de solutos
Difusin Simple
Concentracin Externa de solutos
ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO

Macromolcula que rodea a bacterias proporcionando resistencia mecnica y confiriendo la forma. Est formada por un polmero complejo (murena) que forma una macromolcula que recubre completamente la clula. Estructuralmente est formado por cadenas glucosdicas en que se repite una unidad elemental de N-acetil-glucosamina unida por un enlace glicosdico 14 a cido N-acetil-murmico. Las unidades elementales estn entre s mediante enlaces glicosdicos 14.

Las cadenas glucosdicas estn orientadas de forma paralela y estn unidas entre s mediante puentes peptdicos formados por cadenas de aminocidos que estn unidos al resto de cido N-acetilmurmico.
En las cadenas peptdicas se alternan aminocidos con configuracin L y con configuracin D.
Subunidades del Peptidoglicano
Sntesis del peptidoglicano

Exterior Peptidoglicano Peptidoglicano
-lactmicos
Punto de crecimiento de la pared celular
Pentapptido Membrana citoplasmtica Interior Bactoprenol


La capa de peptidoglicano de las bacterias Grampositivas es ms gruesa que la de las Gram-negativas
Gram Positiva
PG MI ME MI PG
PG MI ME
Gram Negativa
PG MI
Capa externa de Lipopolisacridos y Protenas (LPS)
O-Polisacrido
Ncleo Polisacrido Capa Externa de Gram Negativa
Protena
Lpido Porina A
LPS
8 nm Fosfolpido Espacio Periplsmico Lipoproten a Peptidoglicano Membrana Citoplasmtica

Ribosomas bacterianos.
Los ribosomas, procariticos o eucariticos, estn formados por protenas y ARN; sin embargo, ambos tipos de ribosmas son diferentes de suerte que puede disponerse de inhibidores (antibiticos) especficos de ribosomas procariticos que no afectan a los eucariticos y viceversa.
Elementos facultativos
Las cpsulas estn formadas por polisacridos o polipptidos Participan en la adhesin de las bacterias a superficies, retardan la desecacin de las bacterias en ambientes secos y proporcionan proteccin frente a la fagocitosis. No solo las bacterias presentan cpsulas sino que tambin han sido descritas en algunos hongos unicelulares (Cryptococcus neoformans). Una caracterstica macroscpica fcilmente observable de los microorganismos con cpsula es que forman colonias de aspecto mucoso y liso. Las diferentes variantes de cpsula de distintas cepas de una misma especie se pueden identificar mediante mtodos serolgicos. El antgeno capsular se conoce como antgeno K.
Elementos facultativos
La capa S formada por protenas y glicoprotenas Participa en la adhesin de las bacterias a superficies, la proteccin frente a la fagocitosis y acta como barrera frente a enzimas o substancias que pudieran daar a las bacterias que la poseen.

Apndices bacterianos: flagelos y fmbrias.

FLAGELOS
Bacterias mviles El antgeno flagelar se conoce como antgeno H. Las bacterias flageladas pueden tener entre uno y 20 flagelos por clula. Composicin proteica Tamao es de unos 20 nm de dimetro y de entre 5 y 20 m de longitud.
FIMBRIAS

PELO F
Pequeas fibras proteicas Su nmero vara entre 100 y 1000 por bacteria Tamao entre 2 a 9 nm de dimetro y 1 a 5 m de longitud. Gran importancia en la adhesin
PROLONGACIONES DE ADHESIN
Es un tipo especial de fimbria producido por bacterias capaces de transmitir su informacin gentica a otras mediante conjugacin bacteriana. Cuando est presente hay slo uno por clula. Su naturaleza es proteica. Su longitud llega a alcanzar las 10 m. Algunos tipos de microorganismos son portadores de prolongaciones con forma de ventosa que les permiten adherirse a las clulas animales que infectan. Esto ocurre, por ejemplo, en ciertos micoplasmas.
Apndices bacterianos: flagelos y fmbrias.

PELO F Es un tipo especial de fimbria producido por bacterias capaces de transmitir su informacin gentica a otras mediante conjugacin bacteriana. Cuando est presente hay slo uno por clula. Su naturaleza es proteica. Su longitud llega a alcanzar las 10 m.

Esporas
Ciclo Celular
Clula Vegetativa
Clula Espolulante
Espor a
Germinacin Espora
Clula Vegetativa
Fases de formacin de la Endoespora
cido dipicolnico
Grupos Carboxilo

Estructura de los virus.
Poliovirus
Rhinovirus Adenovirus
Virus hepatitis A
Poxvirus
Estructura de los virus.

Virus influenza
Estructura de un Bacterifago
Cabeza
Ncleo
Base
Priones
Concepto de prin
Depsitos amiloides en un paciente con CreutzfeldtJakob
Tema 2: Cultivo de microorganismos

Crecimiento microbiano. Cultivo de microorganismos. Medios de cultivo. Mtodos de aislamiento. Concepto de cultivo puro. Crecimiento microbiano en medio lquido. Crecimiento microbiano en medio slido. Concepto de muerte de un microorganismo. Medida del crecimiento y enumeracin de microorganismos. Crecimiento microbiano equilibrado. Cintica de crecimiento de un cultivo estanco. Factores fsicos y qumicos que influyen en el crecimiento. Rendimiento de los cultivos. Cintica de crecimiento en un cultivo continuo. Tipos de fermentadores.
Crecimiento microbiano
Ciclo celular Crecimiento
20-30 min E. coli a 37
Medios de cultivo
Soporte para el crecimiento de microorganismos Clasificacin
definidos y complejos lquidos y slidos En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser:
Generales Selectivos Diferenciales Selectivo-diferenciales Medios de enriquecimiento
Nutricin y cultivo de microorganismos

Varios tipos de metabolismo
Foto- / Quimio - lito - / - organo
Concentracin de nutrientes: oligotrofa La mayora de las especies microbianas no son cultivables
Cultivos puros y recuento de microorganismos

Tiene slo un tipo de microorganismo En medio slido forma una colonia aislada Cada colonia procede de un nico individuo inicial El nmero de colonias nos indica el nmero de clulas iniciales
Medios de cultivo
Soporte para el crecimiento de microorganismos Clasificacin
definidos y complejos lquidos y slidos En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser:
Generales Selectivos Diferenciales Selectivo-diferenciales Medios de enriquecimiento
Esterilizacin de medios de cultivo

Eliminacin de todo tipo de microorganismo Concepto de esterilidad y asepsia Autoclaves
Programa de prcticas
Prctica 1: Preparacin de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios de cultivo. Esterilizacin. Prctica 2: Anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de manipuladores.
Prctica 3: Obtencin de cultivos puros. Prctica 4: Recuento del nmero de bacterias por mililitro de un cultivo lquido.
Prctica 5: Cultivo de bacterias anaerobias. Prctica 6: Observacin de bacterias teidas. Tincin Simple y Tincin de Gram. Prctica 7: Transformacin bacteriana por resistencia a ampicilina. Prctica 8: Antibiograma. Prctica 9: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano Prctica 10: Aislamiento y caracteristicas de un bacterifago (virus de bacterias). Prctica 11: Observacin de levaduras. Prctica 12: Tincin de esporas. Prctica 13: Tincin de cpsula.
Cultivos puros y recuento de microorganismos

Tiene slo un tipo de microorganismo En medio slido forma una colonia aislada Cada colonia procede de un nico individuo inicial El nmero de colonias nos indica el nmero de clulas iniciales
Medida del crecimiento

Nmero de clulas Masa celular Componentes celulares Pared celular DNA RNA protenas

Nmero de clulas

Masa celular
Cintica del crecimiento

N generaciones (g) 0 1 2 3 4 5 6 7 . g Nmero de clulas N 1 2 4 8 16 32 64 128 . 2g
N = N0 2g

N = N0
g 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
2g
N 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16384 32768 65536
140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0 5 10 15 20
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 5 10 15 20

140000 120000
N = N0 2g Log N = Log N0 + g Log 2

N puede ser Biomasa Densidad ptica Nmero de clulas Conc protena Conc. DNA Conc. RNA etc ..
100000 80000 60000 40000 20000 0 0 5 10 15 20
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 5 10 15 20

dN / dt = N dN / N = dt dN / N = dt Ln N Ln N0 = t LnN = Ln N0 + t N = N0et
El aumento del nmero de clulas es exponencial El logaritmo del nmero de clulas vara de forma lineal con el tiempo. La pendiente de la recta de proporcionalidad es la tasa de crecimiento La velocidad (tasa) de crecimiento es proporcional al nmero de clulas

N = N0et N = N0 2g LnN = Ln N0 + t Log N = Log N0 + g Log 2

N = N0et N = N0 2g 2g = et g Ln2 = t = g Ln2 / t = Ln2 / g=t/

LnN = Ln N0 + t
LnN Pendiente = Ln N0 Tiempo (t)

Log N = Log N0 + g Log 2 Log N = Log N0 + (t/) Log 2 Log N = Log N0 + t (Log 2 / )

Log N = Log N0 + t (Log 2 / )
LogN Pendiente = Log2/ Log N0 Tiempo (t)

Problema 1: Calcular la tasa de crecimiento y el tiempo de generacin de las bacterias de un cultivo que pasa de tener una DO550 de 0.1 a 0.78 en 120 min.
LnN = Ln N0 + t Ln0.78 = Ln 0.1 + 120 min = 1.03 h-1 = 0.67 h = 40.38 min

Equivalencias entre la tasa de crecimiento y el tiempo de generacin
= Ln2 /
Cuando = 1 h-1 , entonces = 0.69 h = 41 min (aporx.) Cuando = 0.5 h, entonces = 1.4 h-1 Cuando = 1 h, entonces = 0.69 h-1
Tiempo de generacin de algunas bacterias en condiciones ptimas de cultivo.
Bacteria
Medio Escherichia coli Glucosa sales Bacillus megaterium Sacarosa sales Streptococcus lactis Leche Streptococcus lactis Caldo de lactosa Staphylococcus aureus BHI Lactobacillus acidophilus Leche Rhizobium japonicum Extr. Manitol levadura M. tuberculosis Sinttico Treponema pallidum Testculo ratn
Tiempo gen (min) 17 25 26 48 27-30 66-87 344-461 792-932 1980
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento de los micoorganismos
Clasificacin de los microorganismos segn la temperatura
Efecto del ion Na+ sobre el crecimiento microbiano
Efecto del pH sobre el crecimiento de microorganismos
Efecto del oxgeno sobre el crecimiento de microorganismos
Rendimiento del cultivo
Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilizacin del substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede producirse por unidad de substrato consumido
Rendimiento del cultivo

Log Biomasa (N)
[S1] [S2] [S3]
[N1] [N2] [N3]
Tiempo (t)
m = Ys
[S]
Tasa especfica de consumo de substrato
Comparacin del Transporte Activo con la Difusin Simple
Transporte activo Concentracin Interna de solutos
Difusin Simple
Concentracin Externa de solutos
Ecuacin de Monod
Tasa de crecimiento ()
max
max / 2
Ks
[substrato]
Fermentador
Fermentador
Genentech, Corporate Communication New Brunswick Scientific Co., Inc.
Fermentador
ICI, Ltd. factory, Billingham, UK,
Fermentador
Novo Nordisk
Cultivo continuo
Tasa de dilucin D=/V
D=
Cultivo continuo
Cultivo continuo
Concentracin de substrato
Biomasa D max
Altas temperaturas
Tasa de crecimiento ()
Temperatura ptima mxima
mnima
Los microorganismos mueren rpidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su ptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminar microorganismos por termodestruccin. Los mtodos basados en el calor son quiz los ms utilizados para controlar el crecimiento microbiano. La sensibilidad de los diferentes tipos de microorganismos a los tratamientos trmicos es distinta. Las esporas son la formas ms termorresistentes y las clulas vegetativas las ms sensibles. Los microorganismos Gram-positivos tienden a ser ms resistentes que los Gram-negativos. Por consiguiente, desde un punto de vista prctico, la esterilizacin por calor est destinada a matar las esporas bacterianas.
Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposicin a 160 C.
Hornos de esterilizacin y despirogenacin La esterilizacin por calor seco se utiliza generalmente para materiales que toleran altas temperaturas, generalmente de metal o vidrio. Es el mtodo de eleccin siempre que sea posible, pues la superficie del material de vidrio, al ser la que est en mayor contacto con el producto, puede ser origen de contaminacin pirognica, siendo el calor seco un buen agente de destruccin de pirgenos. Adems tiene la ventaja de que, al finalizar el ciclo, el material sale seco.
Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agente ms prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la presin atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento.
Autoclaves
Autoclaves
Altas temperaturas
supervivientes
Log supervivientes
DT =
tiempo LogN0 - LogNt
tiempo
tiempo
Altas temperaturas
Altas temperaturas
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el nmero de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del nmero de supervivientes se reduzca en una unidad)
Las unidades del D son minutos. El tiempo de termodestruccin (D) vara para cada temperatura (de ah el subndice t), es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiolgicas.
Altas temperaturas
D
Altas temperaturas
El valor z indica el incremento en la temperatura (medida en nmero de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la dcima parte del inicial.
El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Por lo general, los microorganismos son ms sensibles a las altas temperaturas cuando se encuentran a pHs cidos, mientras que las concentraciones altas de protenas o azcares en el medio disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias. Las altas concentraciones de sal tienen efectos variables segn el tipo de microorganismo La esterilizacin por calor se puede hacer en medio hmedo usando un autoclave o en medios secos mediante el horno Pasteur.
Los conceptos de valores D y z son tambin aplicables a otros parmetros de calidad de alimentos tales como actividades enzimticas. Por ejemplo, para la actividad de la peroxidasa D120 = 0.83x10-3 s y z = 27.8 C actividad biolgica de vitaminas (vitamina A) D122 = 2.4x10-3 s, z = 23 C), textura de alimentos (alubias) D100 = 84.9x10-3 s, z = 21.3 C color (guisantes) D121.1 = 1.5x10-3 s, z = 39.4C
Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un tratamiento 12D de los productos susceptibles de ser portadores de grmenes patgenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 rdenes de magnitud el nmero de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10-12 la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial, despus de un tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta 10-12 .
Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse por encima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin. Las esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas.
John Tyndall (1820 1893)
Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura seleccionada para la pasteurizacin se basa en el tiempo de termodestruccin de microorganismos patgenos (es el tiempo ms corto necesario para matar una suspensin de bacterias a una temperatura determinada).
patgenos ms resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60 C. Posteriormente se ha observado que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms resistente al calor que M. tuberculosis por lo que se utiliza para el diseo del los tratamientos para la leche. 1. Tratamiento LTLT pasteurizacin a 62,8 C durante 30 minutos 2. Tratamiento HTST pasteurizacin a 71,7 C durante 15 segundos. 3. Tratamiento UHT proceso en flujo en el que el producto alcanza 140-150 C durante unos pocos segundos y permite una conservacin mucho ms larga (hasta 8 semanas).
Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos
El autoclave esteriliza usando el calor hmero transmitido por vapor de agua sobrecalentado debido al uso de altas presiones. el efecto del vapor de agua es facilitar la transmisin del calor al objeto en esterilizacin. El procedimiento usual es usar 121C para lo que es necesaria una presin de 1.1 kg/cm2. En estas condiciones un tratamiento de 15 min es suficiente para eliminar las esporas de Grampositivos.
Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose en estos casos otros mtodos de esterilizacin.
ESTERILIZACIN POR FILTRACIN: La esterilizacin por filtracin se utiliza para eliminar bacterias de los medios lquidos que sean susceptibles al calor. Por ejemplo, las disoluciones enzimticas o de vitaminas. La esterilizacin se efecta pasando la muestra lquida a travs de un filtro con un tamao de poro de 0.42 m (o menor). Las bacterias normales quedan retenidas en el filtro y el lquido se esteriliza. Hay que tener presente que este sistema no elimina los virus ya que son de menor tamao que el poro (virus filtrables).
Filtros de membrana son discos de steres de celulosa con poros tan pequeos que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volmenes de agua. Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.
AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS Oxido de etileno: es un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H). Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.
RADIACIN ULTRAVIOLETA: La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por tanto se pueden calcular los valores D para la irradiacin. Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas pueden tener una resistencia distinta. El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. Se encuentra en el saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos.
Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la luz UV son susceptibles de ser destrudos.
RADIACIN IONIZANTE: La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto lo consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN. La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una misma especie son generalmente lo suficientemente pequeas para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos. Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistente. En general la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son an ms resistentes que las bacterias a la radiacin.
Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas por ciertos istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y despus esterilizar. Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizar material quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar despus de empaquetado (ya que stas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.
Principios generales de metabolismo, respiracin y fermentacin

Esquema general de metabolismo. Catabolismo y anabolismo. Metabolismo primario y secundario. Categoras de microorganismos segn su metabolismo. Mecanismos de generacin de energa:
fotosntesis fosforilacin oxidativa fosforilacin a nivel de substrato
Conceptos de respiracin y fermentacin. Respiracin aerobia y anaerobia. Metabolismo central: catabolismo y anabolismo Diversidad de fermentaciones:
alcohlica, homolctica, heterolctica, cido-mixta, butanodilica, Propinica acetona-butanol.

MICGRAL2007
Otras fermentaciones. Metabolismo secundario. Fijacin de nitrgeno.
Esquema general de metabolismo
Esquema general de metabolismo
Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology
Categoras de los organismos segn su metabolismo

Fuente de Energa Luz Foto Quimio Enlaces qumicos
Fuente de carbono
Inorgnico (CO2)
- lito -
- organo -
Orgnico (azcares, lpidos, aminocidos)
Fotolitotrofos Plantas Bacterias y arqueas fotosintticas
Quimiolitotrofos Bacterias Arqueas
Fotoorganotrofos Bacterias Arqueas
Quimioorganotrofos Bacterias, Arqueas, Hongos y Animales
MICGRAL2007

Fuente de Energa Luz Foto Quimio Enlaces qumicos Orgnico (azcares, lpidos, aminocidos) Quimioorganotrofos
Fuente de carbono
Inorgnico (CO2)
- lito -
- organo -
Lwoff, van Niel, Ryass, Tatum (1946)
Fotolitotrofos Plantas Bacterias y arqueas fotosintticas
Quimiolitotrofos
Fotoorganotrofos
Bacterias Arqueas
Bacterias Arqueas
Bacterias, Arqueas, Hongos y Animales
Auttrofo: capaz de sintetizar sus propios metabolitos esenciales Hetertrofo: incapaz de sintetizar sus propios metabolitos esenciales

Autotrophs Energy Source Carbon Source Name Example Most photosynthetic bacteria, e.g. Chromatium (anaerobic), Cyanobacteria (aerobic)
Light
Inorganic
Photoautotroph Chemolithotrophic autotroph (chemoautotroph) Chemoorganotrophic autotroph
Inorganic Organic Heterotrophs: Light Inorganic Organic
Inorganic Inorganic
Nitrobacter Pseudomonas oxalaticus
Organic Organic Organic
Photoheterotroph Chemolithotrophic heterotroph ("mixotroph") (Chemo)heterotroph
Purple and green photosynthetic bacteria,
e.g. Rhodospirillum Desulphovibrio E. coli
Mecanismos de generacin de energa

fotofosforilacin: fotosntesis fosforilacin oxidativa fosforilacin a nivel de substrato Fosforilacin
AMP-P + Pi AMP~PP

fotosntesis
Fotosntesis anoxignica Slo PSI Bacterias rojas y prpura
Fotosntesis oxignica PSII y PSI Cianobacterias

fotosntesis

fotosntesis
Cross-section of the R. sphaeroides ICM, illustrating the function of the major components of this bioenergetic membrane. The figure depicts the orientation of ICM components relative to the cytoplasmic and periplasmic compartments. Abbreviations: Bchl, bacteriochlorophyll; Bchl2, bacteriochlorophyll special pair; ADP, adenosine diphosphate; ATP, adenosine triphosphate; Pi, phosphate; e, electron; Q, ubiquinone; cyt c2, cytochrome c2; B800850 & B875, light harvesting complexes, respectively.
doi:10.1016/j.mib.2006.10.005

fosforilacin oxidativa
Substrato reducido Substrato oxidado C6H12O6 + 6 O2 6CO2 + 6H2O
Energa
G0= - 317.66 kcal/mol
C6H12O6 + [NAD+] [NADH + H+] + 6O2
6CO2 + [NADH + H+] [NAD+] + 6 H2O
Glucolisis + Ciclo Krebs Respiracin
Energa

fosforilacin a nivel de substrato
1,3-difosfoglicerato
Fosfoglicerato quinasa G'o= - 4.5 kcal/mol
ADP ATP
3-fosfoglicerato
Conceptos de respiracin y fermentacin

El contenido de NAD+ de la clula es limitado y puede agotarse
C6H12O6 + [NAD+] [NADH + H+] + 6O2
6CO2 + [NADH + H+] [NAD+] + 6 H2O
La respiracin y la fermentacin son procesos que recuperan el contenido celular de NAD+
En la RESPIRACIN, el [NADH2] se oxida usando un aceptor de electrones EXTERNO En la FERMENTACIN, el [NADH2] se oxida usando un aceptor de electrones INTERNO
Respiracin aerobia
CO2 ATP sntesis Compuesto orgnico Flujo de carbono Biosntesis Flujo de electrones
O2
NADH + H+ + O2
NAD+ + H2O
Respiracin anaerobia
CO2 ATP sntesis Compuesto orgnico Flujo de carbono Biosntesis Flujo de electrones NO3SO4= Aceptores de electrones orgnicos
NADH + H+ + 2 NO3-
NAD+ + 2 NO2- + H20
Torre de electrones
e-
Par donador / aceptor
2H+ / H2 (-0.38) 6 eCO2 / metanol (-0.38) 6 eNAD+ / NADH (-0.32) 2 eCO2 / acetato (-0.28) 8 eS0 / H2S (-0.28) 2 eS04= / H2S (-0.22) 8 ePiruvato / lactato (-0.19) 2 eS4O62- / S2O32- (-0.024) 2 eFumarato / succinato (+0.03) 2 e-
Ubiquinona ox/red (+0.11) 2 eCitocromo c ox/red (+0.25) 1 eCitocromo aox/red (+0.39) 1 e-
Cuanto ms grande sea la cada de potencial, mayor ser la energa liberada
NO3- / NO2- (+0.42) 2 e-
NO3- / N2 (+0.74) 5 eFe3+ / Fe2+ (+0.76) 1 e O2 / H2O (+0.82) 2 e-
Potencial oxidante
Citocromo box/red (+0.035) 1 e-
Potencial reductor
CO2/glucosa (-0.43) 24 e-
Respiracin
Respiracin aerobia
Glicolisis + ciclo TCA
Glicolisis + ciclo TCA
GLUCOSA
GLUCOSA
ATPasa
SISTEMA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES
ATPasa
SISTEMA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES
NO3-
NO2-
Exterior de la clula
Cadena transportadora de e-
Membrana celular
Transportador de eoxidado
Transportador de ereducido
Interior de la clula
Metabolismo de la glucosa
Glucosa
Conversin de la energa por la ATPasa
Principios generales de metabolismo, respiracin y fermentacin

Esquema general de metabolismo. Catabolismo y anabolismo. Metabolismo primario y secundario. Categoras de microorganismos segn su metabolismo. Mecanismos de generacin de energa:
fotosntesis fosforilacin oxidativa fosforilacin a nivel de substrato
Conceptos de respiracin y fermentacin. Respiracin aerobia y anaerobia. Metabolismo central: catabolismo y anabolismo Diversidad de fermentaciones:
Otras fermentaciones. Metabolismo secundario. Fijacin de nitrgeno.
Metabolitos primarios y secundarios

METABOLITOS PRIMARIOS:
-Se producen en el curso de las reacciones metablicas anablicas o catablicas que tiene lugar durante las fases de crecimiento y que contribuyen a la produccin de biomasa o energa por las clulas. -Se producen principalmente en la trofofase o fase de crecimiento.
METABOLITOS SECUNDARIOS:
-Se producen por rutas anablicas especializadas cuando no hay crecimiento. -Significado evolutivo controvertido por ser imprescindibles. Pueden ser una estrategia para mantener en funcionamiento los sistemas metablicis cuando no hay crecimiento. -Son indicativos de diferenciacin y se producen durante la idiofase de los cultivos.
Catabolismo de la Glucosa RUTA DE EMBDEN-MEYERHOF (EM) RUTA ENTNER-DOUDOROFF RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO RUTA DE LA FOSFOCETOLASA
Ruta de Embden-Meyerhoff
Transporte de la glucosa
ATP FFK
AMP
Efecto Pasteur
- La ms comn - Funciona en condiciones aerobias y en anaerobias. - La ruta produce: 2 piruvato (C3) 2ATP 2NADH + 2H+
Ruta de Embden-Meyerhoff
Ruta de Entner-Doudoroff
Glucosa + 2 NAD + ADP+ Pi 2 Piruvato + 2 NADH + ATP
Ruta de Entner-Doudoroff
- Presente en ciertas Gram-negativas aerobias como Pseudomonas. - Muy rara en hongos - Relativamente infrecuente como va de fermentacin
(KDPG)
Zymomonas
gave azul
Aguamiel Pulque Tequila
Ruta de las Pentosas fosfato - Presente en muchas bacterias y en la mayora de los eucariontes. - Puede ser simultnea a la ruta EM. - Funciona en condiciones aerobias y anaerobias. -Importancia en catabolismo y en anabolismo.
2 fructosa-6-fosfato (C6) gliceraldehdo-3-fosfato (C3) 3CO2 + 6NADPH + 6H+
3 Glucosa-6-fosfato (C6) 6NADP+ + 3 H2O
a ut R
de
s la
sa o nt pe
Ruta de la Fosfocetolasa o de Warburg-Dickens (WD)
Fosfocetolasa
Es la ruta que siguen ciertas bacteria lcticas (especialmente Lactobacillus y Leuconostoc) Se puede considerar una variante de la ruta de la PF puesto que se forma un azcar C5 y, por consiguiente, tiene lugar una descarboxilacin. Sin embargo, en la ruta WD la enzima fosfocetolasa rompe el azcar C5 y de lugar a dos ramas que coinciden a la formacin de lactato y etanol en un proceso de fermentacin heterolctica.
Fermentacin heterolctica
Ciclo de Krebs
Nucletidos oxidados
Nucletidos reducidos
Exterior de la clula
Cadena transportadora de e-
Membrana celular
Transportador de eoxidado
Transportador de ereducido
Interior de la clula
Metabolismo de la glucosa
Glucosa
Principios generales de metabolismo, respiracin y fermentacin Diversidad de fermentaciones:

ALCOHLICA:
Fermentaciones
- En la fermentacin etanlica o alcohlica: el piruvato se reduce para formar etanol y CO2 : Glucosa + 2ADP + 2Pi 2etanol + CO2 + 2ATP - Es el proceso de fermentacin que lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae (pocas bacterias).
Fermentaciones
HOMOLCTICA: -Su nico producto final es el cido lctico. Su ecuacin global es: Glucosa + 2ADP + 2Pi 2 cido lctico + 2 ATP Estas bacterias producen el piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de Embden-Meyerhof. -Proceso presente en muchas bacterias lcticas: Streptococcus (grupo enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus.
Fermentacin heterolctica
Su producto final no es exclusivamente cido lctico. El proceso tiene un rendimiento menor que la fermentacin homolctica. El piruvato de esta ruta procede de la va de las pentosas. La reaccin global es: Glucosa ADP + Pi
Ac. Lctico + etanol CO2 + ATP
Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo lctico pertenecientes a los gneros Leuconostoc y Lactobacillus.
Fermentacin cido mixta

Produce cido actico, etanol, H2, CO2 y proporciones diferentes de cido lctico o propinico (frmico) segn las especies. La llevan a cabo las enterobacterias. En esta ruta de fermentacin se produce ATP adems de la reoxidacin del NADH+H+.
Hidrogenoliasa frmica
Fermentacin butanodilica
Variante de la fermentacion cido mixta. Presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia. En esta ruta se produce acetona que se detecta mediante la reaccin de VogesProskauer
Voges-Proskauer
Fermentacin del cido propinico
Proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y cido propinico como productos finales. Ruta fermentativa la presentan las bacterias del tipo Propinobacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbvoros
Fermentacin de acetona-butanol
Tipo de fermentacin llevado a cabo por bacterias anaerobias estrictas del gnero Clostridium. Se producen compuestos orgnicos disolventes de gran importancia industrial
Reaccin de Stickland llevada a cabo por algunas bacterias del gnero Clostridium
Fermentacin de aminocidos: reaccin de Stickland

NAD+ NADH 2 Acetil-P 2 ADP 2 Pi 2 Acetato- + 2 NH3
2 ATP
Alanina
NAD+ NADH
CoA CO2 Pi CoA
Piruvato + NH3
Glicina Aminocidos que participan en la reaccin de Stickland Aminocidos oxidados Aminocidos reducidos Glicina Prolina Hidroxiprolina Triptfano Arginina
Acetil-CoA
Acetil-P
ADP ATP
Acetato-
Alanina Leucina Isoleucina Valina Histidina
Metabolismo central
Rutas anablicas
Caractersticas comunes de los metabolitos secundarios

Tienden a producirse cuando el crecimiento est limitado (cultivo contnuo). Se forman por enzimas especficos a partir del metabolismo central. No son esenciales para el crecimiento o para el metabolismo central. Son especficos para cada especie, y a veces, de cada cepa.
Familias de metabolitos secundarios POLIQUTIDOS TERPENOS AMINOCIDOS
POLIQUTIDOS
Est presente en bacterias, hongos y en plantas. Sirve nicamente para la produccin de metabolitos secundarios. Parte del malonil-CoA que forma el primer paso en la sntesis de cidos grasos. Ejemplos: griseofulvina (antibitico producido por Penicillium griseofulvum) aflatoxinas (toxinas producidas por Aspergillus flavus y por A. parasiticus) ocratoxinas (toxinas producidas por algunos tipos de Aspergillus y de Penicillium) lovastatina (producida por A. terreus)
TERPENOS
Se inician a partir del Acetil-CoA. Produce tanto metabolitos primarios (carotenos, esteroles) como secundarios. Ejemplos: Ciertos carotenos. Toxinas como la toxina T2 y los tricotecenos (producidos por alguna especie de Fusarium).
MICGRAL2007
Rutas de sntesis de las familias de metabolitos secundarios
Terpenos Poliqutidos
MICGRAL2007
Rutas de aminocidos
RUTAS QUE PARTEN DE AMINOCIDOS AROMTICOS
Compuestos alucingenos tales como el cido lisrgico, la psilocibina (Psylocibe) y la muscarina (Amanita muscaria).
RUTAS QUE PARTEN DE AMINOCIDOS ALIFTICOS

Penicilinas (Penincillium chrysogenum) Toxinas como la falotoxina (Amanita phalloides)
Transmisin de la informacin gentica

Reparto del material gentico en procariontes y eucariontes. Transformacin Conjugacin Transduccin.
Transferencia horizontal del material gentico en procariontes
Transmisin horizontal de informacin gentica en eucariontes. Aplicaciones biotecnolgicas de la gentica microbiana Transcripcin y traduccin en procariontes y en eucariontes. Regulacin de la expresin gnica. El modelo del opern: operones inducibles y represibles Secuenciacin de genomas.
Dogma Central de la Biologa Molecular

Informacin
Replicacin del ADN
Informacin
Transcripcin: sntesis de de ARN
ncleo
Informacin
citoplasma
Membrana nuclear
Traduccin: sntesis de protenas Protena ribosoma
protena
Dogma Central de la Biologa Molecular

Entre clulas de diferente generacin Dentro de una clula
Entre clulas de la misma generacin
Clula parental
Replicacin Clula recombinante Recombinacin Divisin celular Traduccin Protena Transcripcin
Clulas hijas
Metabolismo y crecimiento celular
Transcripcin y traduccin en bacterias

Protena
Traduccin
Direccin de la transcripcin
RNA polimerasa
Polirribosoma Ribosoma Direccin de la traduccin
Transformacin
Transformacin de E. coli con un gen de resistencia a ampicilina (AMP) y un marcador de fluorescencia
Transformacin
Factor de virulencia Cpsula virulento, muerto
Str. pneumoniae
Ratn vivo
Str. pneumoniae
avirulento, vivo
Ratn vivo
Ratn muerto
encapsulado (virulento) y vivo
Str. pneumoniae
Transformacin bacteriana
Otra bacteria DNA externo Otra organismo
Bacteria competente recombinacin Competente natural Competente inducida
Bacteria transformada
Restriccin = destruccin
Streptococcus pneumonia
Escherichia coli
Transformacin permanente
Eliminacin del ADN externo
Transformacin bacteriana
Bacteria competente Plsmido Fragmento de ADN con un origen de replicacin autnomo Codifica genes responsables de funciones prescindibles Proporciona algunas funciones nuevas a la clula en condiciones especiales
Bacteria transformada
La transformacin es un sistema de baja eficiencia Una buena eficiencia es 109 ufc/g de DNA
Tamao del plsmido: aprox. 3 -10 kpb Peso molecular del plsmido: 660 x 3 x 103 = 1980 x 103 2 x 106 por tanto, entre 2 y 6 x 106. 1 g de DNA plasmdico equivale a entre 2 y 5 x 10-13 moles de plsmido y a ms de 1011 molculas Por tanto, slo 1 de cada 100 molculas del plsmido transforma realmente una clula
Multiplicacin del plsmido con la bacteria
Conjugacin bacteriana
E. coli portadora
del plsmido F plsmido F
E. coli sin
E. coli F+
E. coli F-
Pelo F
F
Clulas de E. coli en proceso de conjugacin
E. coli F+
E. coli F+
E. coli F+
E. coli F+
En la conjugacin se transmite el plsmido F de la cepa donadora (F+) a la receptora (F-) a travs del pelo F. En este proceso, la clula receptora (F-) se convierte en una nueva donadora (F+)
Conjugacin bacteriana: clulas Hfr

E. coli portadora
del plsmido F F integrado en el cronmosoma
E. coli portadora del plsmido
E. coli F+
E. coli Hfr
F
Pelo F
E. coli F-
F
Clulas de E. coli en proceso de conjugacin
F
En las clulas Hfr, el plsmido F est integrado en el cromosoma de la bacteria donadora. Durante la conjugacin, la bacteria donadora pasa a la receptora su cromosoma En la clula receptora se puede producir recombinacin entre el ADN entrante y el propio de la bacteria La clula receptora se convierte en Hfr si se consigue transmitir todo el cromosoma de la donadora
Bacterifago Receptor especfico
Virus bacterianos: ciclos lticos y lisognicos

Ciclo lisognico. El virus se integra en el cromosoma bacteriano y se multiplica con la bacteria como un gen ms
Infeccin
En condiciones de estrs, los virus lisognicos pueden pasar a ciclo ltico
Ciclo ltico. El virus se multiplica en la bacteria y termina causando su lisis, lo que produce la liberacin de ms viriones
Transduccin generalizada
Infeccin con el fago En algunas cpsulas vricas se empaqueta por error ADN bacteriano
El ADN bacteriano se fragmenta y el virus se multiplica
Se sintetizan las protenas de la cpsula del virus bacteriofago
Algunos viriones liberados en la lisis llevan ADN bacteriano El virin portador de ADN bacteriano lo introduce en otra bacteria en cuyo cromosoma puede integrarse por recombinacin
Transduccin especializada
Infeccin con el fago Al activarse el ciclo ltico, en algunos casos, el virus se escinde llevando un fragmento del ADN bacteriano
El virus se integra (ciclo lisognico) en una posicin dada del cromosoma bacteriano
Los viriones liberados en la lisis llevan ADN bacteriano Al producirse una nueva infeccin lisognica, el virus introduce un fragmento del ADN de la bacteria infectada en primer lugar
Sistemas de modificacin-restriccin
Las enzimas de modificacin (metilacin) reconocen secuencias especficas y las metilan
GAATTC ATTAAG
Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas no metiladas y las cortan
Metilasa
-TCGTGAATTCATGT-AGCACTTAAGTACA-
EcoRI
-TCGTG AATTCATGT-AGCACTTAA GTACA-
-TCGTGAATTCATGT-AGCACTTAAGTACAEcoRI es inactiva sobre el

AND modificado
modificacin
No restriccin
No modificacin
Restriccin
Aplicaciones biotecnolgicas de la gentica microbiana
Aplicaciones biotecnolgicas de la gentica microbiana
Opern Inducible
P Plac O R P
lacZ lacY
lacA
R represor P RNApol
Opern de la lactosa Los genes de catabolismo de lactosa no se expresan cuando este azcar no est disponible en el medio en el que se encuentran las clulas.
DO550 -gal t
Opern Inducible
P Plac O
lacZ LacY
lacA
P
R represor
transacetilasa permeasa -gal P
INDUCCIN
lactosa
RNApol DO550 -gal t
Opern de la lactosa Los genes de catabolismo de lactosa se expresan cuando este azcar est disponible en el medio en el que se encuentran las clulas.
Opern Represible
P P P O
A
P
Expresin gnica
R represor P RNApol
Sntesis endgena de trp
Opern del triptfano Los genes de anabolismo del triptfano se expresan cuando no hay ninguna fuente externa de este aminocido que puedan utilizar las clulas
DO550 trpB t
Opern Represible
P P P O R
R represor
R P RNApol
Bloqueo de la sntesis endgena de trp
triptfano
Represin DO550 trpB t
Opern del triptfano Los genes de anabolismo del triptfano no se expresan cuando hay una fuente externa de este aminocido que puedan utilizar las clulas
Secuenciacin de genomas
Formacin de la tierra Aparicin de los animales

Eucariontes multicelulares Eucariontes
Origen de los procariontes
Origen de los eucariontes
Procariontes
Origen de la fotosntesis oxignica
http://www.bacterialphylogeny.com/
Taxonoma y filogenia
Identificacin Clasificacin Nomenclatura Clasificacin filogentica basada en comparacin de secuencias de Historia evolutiva de los microorganismos Clasificacin que refleja la historia evolutiva de los microorganismos
RNA 16S Grupos de genes
Genomas
Universal tree of life
Filogenia basada en la comparacin de secuencias representativas del ARN 16S de organismos seleccionados en los tres reinos
El Reino Archaebacteria pas a denominarse Archaea con posterioridad a la publicacin de este trabajo
Woese, C. 1987.Bacterial evolution. Microbiological Reviews 51: 221-271
Gram positivas Gram negativas
Las bacterias representan la mayor parte (90%) de los procariontes conocidos. Actualmente se clasifican en 25 grupos taxonmicos o phyla sobre la base de la secuencia del 16s-RNA
Gram negativas
Proteobacterias
Caulobacterales - ej. Caulobacter Parvularculales Rhizobiales - ej. Rhizobium Acidithiobacillales Aeromonadales - ej. Aeromonas Alteromonadales - ej. Pseudoalteromonas Cardiobacteriales Chromatiales bacterias prpura del S Enterobacteriales - ej. Escherichia
Alpha
Rhodobacterales Rhodospirillales - ej. Acetobacter Rickettsiales - ej. Rickettsia Sphingomonadales ej. Sphingomonas Burkholderiales - ej. Bordetella Hydrogenophilales Methylophilales
Gamma
Legionellales - ej. Legionella Methylococcales Oceanospirillales Pasteurellales - ej. Haemophilus Pseudomonadales - ej. Pseudomonas Thiotrichales - ej. Thiomargarita Vibrionales - ej. Vibrio Xanthomonadales - ej. Stenotrophomonas
Beta
Neisseriales - ej. Neisseria Nitrosomonadales ej. Nitrosomonas Rhodocyclales Procabacteriales Desulfarcales Bdellovibrionales
Myxococcales - Myxobacteria Syntrophobacterales Desulfuromonadales
Delta
Desulfobacterales Desulfovibrionales Desulfurellales
Epsilon
Nautiliales Campylobacterales - ej.g. Helicobacter
Clase Bacteroidetes
Bacteroidales
Bacteroides
Bacteroidetes
Clase Flavobacteria Clase Sphingobacteria
Bacillus
Bacillales Lactobacillales
Bajo contenido en G+C
Firmicutes
Clostridum
Mollicutes
Mycobacterium
Alto contenido en G+C
Actinobacteria
Streptomyces
Firmicutes
Bacterias Gram-positivas con bajo contenido en G+C
Bacillales
B. cereus Bacillus B. anthracis B. thuringiensis Staphylococcus Staph. aureus
Bacilos
Enterococcus Lactobacillus
Lactobacillales
Lactococcus Streptococcus Pediococcus Oenococcus C. botulinum
Clostridios
Clostridium
C. tetani C. perfringens
Mollicutes
Mycoplasma Phytoplasma
Actinobacteria
Bacterias Gram-positivas con alto contenido en G+C
Mycobacterium Streptomyces Corynebacterium Frankia Propionibacterium
Grupos de microorganismos ms importantes en agronoma
procariticos
Gram
eucariticos
protozoos algas positivos esporulantes no esporulantes hongos lquenes
acelulares
virus viroides priones Hongos filamentosos Levaduras Ascomicetos Deuteromicetos Basidiomicetos perfectos imperfectos bacterias vegetales animales
negativos aerobios anaerobios obligados facultativos
Clasificacin estructural
Clasificacin funcional filogentica
Otros microorganismos
Microorganismos Gram negativos aerobios

Grupo de los rizobios
Fijacin de nitrgeno en simbiosis Patgeno vegetal Ingeniera gentica vegetal
Agrobacterium
Brucella Acetobacter y Gluconobacter Azotobacter
Patgeno de animales y humanos Produccin industrial de vinagre Fijacin de nitrgeno en vida libre Patgeno de animales y humanos (oportunista) Patgeno vegetal Agente de deterioro de alimentos Agente de biorremediacin
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
Azotobacter
Ferredoxina (oxidada)
Fe (reducido) Nitrogenasa I Fe (oxidado)
MoFe (oxidado) Nitrogenasa II MoFe (reducido)
Ferredoxina (reducida)
Brucella
B. mellitensis
B. abortus
Microorganismos Gram negativos anaerobios facultativos

Enterobacteriaceae
Fermentacin cido-mixta
Escherichia Shigella Salmonella
Fermentacin butanodilica
Serratia Enterobacter Klebsiella Erwinia
Yersinia
Vibrionaceae
Aeromonas Vibrio
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Erwinia carotovora
Erwinia amylovora
Erwinia amylovora
Erwinia amylovora
Vibrio
Microorganismos Gram-negativos anaerobios obligados
Ecologa de la produccin de metano
Organismos metangenos
Microorganismos Gram positivos esporulantes

Formacin de la endospora
Bacillus thuringiensis
El gen Bt se inserta en un cultivo
El insecto plaga muere al comer cualquier parte de la planta transfromada
Clostridium tetani
Clostridium tetani
Microorganismos Gram positivos no esporulantes

Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Staphylococcus
Otras bacterias
bacterias lcticas
Listeria Corynebacterium
grupo corineforme
Propionibacterium. Frankia
Actinomicetos
Streptomyces Mycobacterium
Microorganismos Gram positivos no esporulantes

Bacterias lcticas.
Streptococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus
Listeria
Frankia
Streptomyces
BLOQUE III.- MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Tema 15.- Microorganismos y productos industriales Tema 16.- Aislamiento y caracterizacin de productos de origen microbiano Tema 17.- Produccin microbiana de alimentos Tema 18.- Utilizacin de microorganismos en procesos ambientales
Bibliografa: Biologa de los Microorganismos de Brock, captulo 12 en la 8 edicin Biologa de los Microorganismos de Brock, captulo 30 en la 10 edicin
MG2007
Tema 15.- Microorganismos y productos industriales
Origen de las cepas industriales. Propiedades de un microorganismo industrial Productos industriales de origen microbiano Trofofase e idiofase Caractersticas de los fermentadores a gran escala Cambio de escala en la fermentacin: escalado
MG2007
Tema 16.- Aislamiento y caracterizacin de productos de origen microbiano
Antibiticos -lactmicos Produccin de vitaminas y aminocidos Bioconversin microbiana Produccin microbiana de enzimas Clulas inmovilizadas Produccin de cido ctrico
MG2007
INTRODUCCION
Los antibiticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioteraputicos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de produccin para la penicilina y al inicio de la era de investigacin sobre los antibiticos. En la actualidad continua siendo una de las reas ms importante de investigacin dentro de la Microbiologa Industrial.
1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos qumicos de sntesis como balas mgicas selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsn es efectivo contra la sfilis. Acua el trmino quimioterapia. Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la accin del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo Woods descubre el mecanismo de accin de las sulfamidas. Estamos en plena Edad de oro de la Quimioterapia de sntesis. Fleming descubre la penicilina, el primer antibitico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacutica se muestra "indiferente. Chain y Florey purifican la penicilina. Se usa en la 2 Guerra Mundial. Comienza la era de los antibiticos naturales Waksman, un microbilogo de suelos, ha iniciado una bsqueda de microorganismos productores de antibiticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la poca dorada de los antibiticos (quimioterpicos naturales), y la bsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos.
1932-35 1940 1929 1940 1944
INTRODUCCION
Los antibiticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioteraputicos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de produccin para la penicilina y al inicio de la era de investigacin sobre los antibiticos. En la actualidad continua siendo una de las reas ms importante de investigacin dentro de la Microbiologa Industrial. El nmero de antibiticos descritos contina aumentando debido a los programas intensivos de bsqueda en todos los pases industriales. En 1961 eran conocidos 513 antibiticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990 alrededor de 8000. Cada ao se detectan aproximadamente 300 nuevas sustancias con actividad antibitica, de las que el 30-35% son componentes secundarios de las fermentaciones de antibiticos conocidos. Del gran nmero de antibiticos conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producan por fermentacin en 1984. Adems, ms de 50 antibiticos se producan como compuestos semisintticos y 3 antibiticos (cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina) se producen en forma completamente sinttica.
INTRODUCCION
Los antibiticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibiticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y cido fusdico tienen importancia clnica. En las bacterias existen muchos grupos taxonmicos que producen antibiticos. La mayor variedad en estructura y nmero de antibiticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el gnero Streptomyces. La produccin mundial de antibiticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por ao. Las ventas brutas anuales, slo en USA, eran de 1000 millones de dlares, con la cefalosporina en la posicin de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas.
Porcentajes de produccin de diversas familias de quimioterpicos
INTRODUCCION
Los antibiticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibiticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y cido fusdico tienen importancia clnica. En las bacterias existen muchos grupos taxonmicos que producen antibiticos. La mayor variedad en estructura y nmero de antibiticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el gnero Streptomyces. La produccin mundial de antibiticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por ao. Las ventas brutas anuales, slo en USA, eran de 1000 millones de dlares, con la cefalosporina en la posicin de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas. Antes de 1960 aproximadamente el 5% de los antibiticos recientemente aislados eran tiles teraputicamente. En los aos siguientes fueron descubiertos nuevos antibiticos a una velocidad aproximadamente constante, pero el porcentaje de los nuevos antibiticos que realmente llegaban al mercado descendi desde el 2,6% entre 1961-1965 al 1% entre 1966-1971. Esto se debe fundamentalmente a un aumento severo en los costes del desarrollo y de las pruebas clnicas, de forma que muchos fabricantes producen solamente aquellos compuestos que claramente muestran un progreso teraputico prometedor. Por trmino medio se necesitan alrededor de 8-10 aos para desarrollar un nuevo antibitico a un coste medio de 10x106 - 20x106 dlares (6 12x106 ). La obtencin de mejores antibiticos se lleva a cabo por modificacin de los compuestos conocidos utilizando medios qumicos o genticos (mutasntesis, fusin de protoplastos, tecnologa del DNA recombinante). Sin embargo, solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibiticos con estructuras bsicas enteramente nuevas, especialmente por la utilizacin de nuevos procedimientos de prueba y por la investigacin en nuevos grupos de microorganismos.
PRODUCCION DE PENICILINAS
Los antibiticos -lactmicos son metabolitos secundarios Los antibiticos -lactmicos se caracterizan por poseer en su estructura el anillo -lactmico que est compuesto por 3 tomos de carbono y 1 tomo de nitrgeno. Los antibiticos lactmicos se pueden dividir en cinco clases diferentes: Penicilinas Clavamas Cefalosporinas Monobactamas Carbapenemas Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los ms efectivos de todos los agentes teraputicos usados en el control de las enfermedades infecciosas.
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigacin en Oxford, bajo la direccin de Florey y Chain, la aisl a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicacin clnica de la penicilina se realiz en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.
Penicillium notatum
Sir Alexander Fleming, 1952
Photograph courtesy of Associated Press
Penicillium notatum
Placa de Petri sembrada con Staphylococcus aureus y contaminada con P. notatum
Fleming
Chain
Florey
Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +. Son lbiles en medio cido y pueden ser inactivadas por hidrlisis del anillo -lactmico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina, solamente un pequeo porcentaje de pacientes desarrollan alergia (0,5-2%). Los antibiticos -lactmicos son inhibidores especficos de la sntesis de peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son anlogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos frmacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintticas y cefalosporinas tienen efecto tambin frente a Bacterias G -.
SITIO DE ACCIN DE LAS PENICILINAS
1.- Estructura qumica

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6.
1.- Estructura qumica

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6.
2.- Biosntesis y regulacin
El anillo -lactmico-tiazolidnico de la penicilina se produce a partir de L-cistena y Lvalina. La biosntesis se produce por medio de un dipptido compuesto de cido L-a-aminoadpico (L-a-AAA) y L-cistena. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reaccin de epimerizacin, dando lugar a la formacin del tripptido d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclacin del tripptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioqumicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadpico) con cido fenilactico activado. El 6APA, que no es un producto intermediario de biosntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.
Metabolito secundario
Ruta de produccin de penicilina en Penicillium chrysogenum
SNTESIS DE PENICILINA G Ruta de produccin de penicilina en Penicillium chrysogenum
Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosntesis de la penicilina. El aminocido lisina es sintetizado a partir de la va que origina el cido L-a-aminoadpico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta biosinttica ramificada comn. La lisina inhibe la sntesis de penicilina debido a que inhibe por retroalimentacin a la homocitrato sintasa, un enzima implicado en la sntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse penicilina. Sin embargo, la retrorregulacin por lisina no parece ser una etapa limitante en la biosntesis de penicilina. La biosntesis de penicilina se ve afectada por la concentracin de fosfato y tambin muestra una clara represin catablica, particularmente por glucosa.
2.- Penicilinas naturales, semisintticas y biosintticas

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6. Si la fermentacin de penicilina se lleva a cabo sin adicin de precursores de la cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla solamente es til teraputicamente la bencilpenicilina; los otros compuestos deben ser eliminados durante la etapa de recuperacin del producto. La fermentacin puede ser controlada mejor aadiendo un precursor de la cadena lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Ms de 100 penicilinas biosintticas han sido producidas de esta forma. En los procesos comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas la penicilina G y la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O. Utilizando el cido fenoxiactico, como precursor de la cadena lateral, se consigui la obtencin de penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es particularmente estable en medio cido y que puede, por tanto, suministrarse por va oral al contrario de lo que ocurre con la penicilina G ya que debido a su sensibilidad a los cidos no se puede administrar oralmente puesto que es hidrolizada en el estmago.
Amoxicilina
Ampicilina
Ncleo central de la penicilina Ncleo central de las cefalosporinas

A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintticas incluyen diversas penicilinas obtenidas al aadir qumicamente una gran variedad de cadenas laterales al cido 6-APA. Penicillium chrysogenum puede sintetizar este cido si el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la produccin de 6-APA en estas condiciones es tan pequea que hace inviable este procedimiento. La deacilacin qumica tampoco es rentable pues este proceso comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura y en condiciones anhidras estrictas, requirindose adems varios solventes qumicos. Por estas razones, la produccin industrial del 6-APA necesario para la fabricacin de penicilinas semisintticas se realiza por deacilacin enzimtica de la penicilina G. Este proceso biolgico se basa en la produccin por ciertas bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilacin se realiza en H2O a 37C, lo que reduce considerablemente los costes. Despus de la deacilacin se obtiene una solucin de sales sdicas del cido fenilactico y 6-APA. El fenilactico recuperado se puede utilizar posteriormente para la produccin de penicilina G. Debido a sus mejores caractersticas (estabilidad a la acidez, resistencia a -lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las penicilinas semisintticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia. Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43% como material de partida para la produccin de penicilinas semisintticas.
2.- Penicilinas semisintticas
3.- Desarrollo de cepas y de tcnicas de cultivo
La produccin de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un ttulo de penicilina de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde 0,0012 g/l hasta 50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de seleccin de cepas. Los primeros procesos para la produccin de penicilina implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio lquido (Czapek-Dox-glucosa). El perodo de incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la penicilina se extraa con solventes previa separacin del micelio
3.- Desarrollo de cepas y de tcnicas de cultivo
La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era ms adecuado para la produccin en cultivo sumergido que la cepa original, Penicillium notatum.
P. Chrysogenum permiti trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente de carbono y energa, y agua de macerado de maz (corn-steep liquor) como fuente de nitrgeno.
Mediante posterior mutagnesis fue aislada la cepa WisQ176, la cepa original de la lnea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fue adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue utilizada como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas, acerca de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los aumentos de rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las cepas, tambin han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre la fermentacin y la eficiencia de recuperacin del producto.
3.- Desarrollo de cepas

Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a travs del screening emprico de mutantes. Hasta mitad de los aos 60 los mutgenos utilizados ms frecuentemente eran los rayos X, mostaza nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Ms recientemente han sido utilizados como mutgenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y los nitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la mutacin haba alcanzado su lmite. El descubrimiento de un ciclo parasexual en Penicillium chrysogenum proporcion una forma de utilizar la recombinacin gentica para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigticos que tenan ttulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con produccin superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de diferentes lneas. La tcnica de fusin de protoplastos abri un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta produccin obtenindose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por mutacin y seleccin. Adems, algunas de las cepas resultantes han tenido mejores caractersticas de crecimiento, como esporulacin ms estable y mejor crecimiento para la produccin del inculo. El uso de la ingeniera gentica para aumentar la sntesis de enzimas que catalizan pasos limitantes, mediante la amplificacin gnica o mejora de la transcripcin, no ha sido todava posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de datos biosintticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vector-hospedador. Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformacin
4.- Mtodos de produccin

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxgeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentacin de penicilina es un proceso aerbico con una velocidad de absorcin volumtrica de oxgeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireacin requerida est entre 0,5-1,0 volmenes de aire (volumen de lquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura ptima es de 25-27C. En un esquema tpico de produccin de penicilina el inculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad de las cepas de alta produccin, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las cepas. La concentracin de esporas (ptima 5x103/ ml) y la formacin de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir una velocidad ptima de formacin de penicilina, los agregados (pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta. Despus de varias etapas de crecimiento est preparado el cultivo de produccin. En la fermentacin tpica de penicilina existe una fase de crecimiento de unas 40h con un tiempo de duplicacin de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxgeno es crtico en el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxgeno. Despus de la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de produccin de penicilina. Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de produccin puede extenderse hasta 120-160h.

Actualmente la extraccin con solventes es la base para la separacin y purificacin de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objeto de disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extraccin posteriores. Las penicilinas G y V son cidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas cidas son solubles en muchos solventes orgnicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extraccin se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrfugos en etapas mltiples, a temperaturas de 0 - 3 C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversin. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio cido con una cintica de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extraccin en medio cido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es ms estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilnico (6-APA) la produccin de penicilina V es ms aconsejable.

La extraccin de penicilina se puede realizar en una o ms etapas sucesivas, con una acidificacin del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizndose la extraccin y concentracin en extractores centrfugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbn para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalizacin se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores crticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentracin de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalizacin a partir de un solvente se requiere tambin un exceso de Na+ o K+ , siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vaco. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente voltil que tambin separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vaco o calor radiante. La penicilina cristalina G o V as obtenida puede ser empleada como tal o como intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas semisintticas, cuidando en todos los casos que los productos debern tener un grado farmacutico. El cido 6-APA puede ser obtenido por va enzimtica (penicilinacilasa) o qumica; sin embargo todas estas etapas escapan al alcance de esta monografa, por lo tanto se remite al lector interesado a la bibliografa.

El medio de un cultivo tpico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y generalmente consiste en: Lquido de maceracin de maiz (4-5% peso seco). Una fuente de Nitrgeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero. Una fuente de carbono, lactosa. Varios tampones El pH se mantiene constante a 6,5. El cido fenilactico o el fenoxiactico se alimentan continuamente como precursores (0,5-0,8% del total). Los procesos con alimentacin de glucosa o melazas tambin tienen xito. En estos casos las velocidades de alimentacin son de 1.0-2.5 kg*m-3*h-1, con una concentracin de glucosa de 500 kg*m-3. Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energtico, el 25% para el crecimiento y slo el 10% para la produccin de penicilina.
Produccin de penicilina (x) en cultivos discontnuos. La variacin en biomasa se representa con punto negros
Produccin de penicilina (x) en cultivos discontnuos. La variacin en biomasa se representa con punto negros
La principal fuente nitrogenada empleada hasta la dcada del 70 fue "corn steep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibitico probablemente al suministrar compuestos como aminocidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, adems de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suministro, y tambin debido a la introduccin de precursores especficos de la cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de semilla de algodn, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o ms caros.

En 1976 se demostr la importancia de un suministro continuo de amonio (por alimentacin con (NH4)2SO4), que permitiese mantener niveles del mismo de aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificando la relacin nitrgeno/carbono en la alimentacin, se comprob que cuando el cultivo estaba limitado en nitrgeno cesaba la produccin de penicilina, la cual se restableca al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH4+ podra reflejar su necesidad para la sntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cistena. El azufre se incorpora como (NH4)2SO4 y con la fuente de nitrgeno orgnica (extractos, peptona). El fsforo en forma inorgnica se adiciona como sales de fosfato y se aconseja mantener su concentracin entre 250 y 500 mg l-1 con alimen tacin continua. Adems se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" es una fuente importante de fsforo. Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicialmente, o bien por alimentacin en los medios, una cantidad relativamente grande de precursor. El requerimiento terico de fenilacetato sdico, es 0.47 g g-1 de penicilina G cida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V cida.

Se ha intentado la produccin de penicilina por fermentacin continua, pero ha sido difcil debido a la inestabilidad de las cepas de produccin. Como alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar (feed batch). En este procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentacin se saca y se reemplaza con solucin fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin reduccin del rendimiento.
Se est llevando a cabo una intensa investigacin para producir penicilina con clulas inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostr la ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero esta tcnica no ha sido introducida todava a nivel comercial. La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio. Despus de la separacin del micelio, la recuperacin del producto se lleva a cabo por medio de dos etapas de extraccin continua en contracorriente del caldo de fermentacin con acetato de amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.
Tema 17.- Produccin microbiana de alimentos. Produccin de vinagre. Produccin de levadura. Produccin de cerveza. Produccin de vino. Produccin de queso. Produccin de yogur. Produccin de pan. Otros procesos microbianos de produccin de alimentos. Conservacin de alimentos por fermentacin. Utilizacin de microorganismos como alimentos.
MG2007
Composicin en protenas y cidos nucleicos de diferentes fuentes de protena celular
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Contenido proteico de proteinas unicelulares de levaduras
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Produccin de vinagre
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Produccin de levadura.
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Produccin de cerveza.
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Produccin de vino.
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Produccin de queso.
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Produccin de yogur.
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Produccin de pan.
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Otros procesos microbianos de produccin de alimentos.
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Conservacin de alimentos por fermentacin.
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Utilizacin de microorganismos como alimentos.
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Composicin en protenas y cidos nucleicos de diferentes fuentes de protena celular
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Contenido proteico de proteinas unicelulares de levaduras
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1. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. - Alimento deteriorado: aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. - Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. - Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. - Las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables. Durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de micoorganismos predominante la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales.
Tema 19.- Enfermedades transmitidas por los alimentos
Origen de los microorganismos patgenos presentes en los alimentos. Infecciones transmitidas a travs de alimentos. Intoxicaciones alimentarias agudas y crnicas. Virosis. Enfermedades causadas por priones. Enfermedades producidas por protozoos. Enfermedades producidas por helmintos.
CONCEPTOS
Enfermedades transmitidas por alimentos Principios de anlisis de alimentos
Origen de los microorganismos patgenos presentes en los alimentos Infecciones e intoxicaciones Virosis Funcin del anlisis de alimentos Microorganismos indicadores e ndices Valores de referencia Determinacin de valores de referencia Puntos crticos
Mtodos generales de anlisis de alimentos

Principios de deterioro de alimentos
Recuento de microorganismos totales Enterobacterias y coliformes (Escherichia coli) Estreptococos del grupo D Estreptococos mitis-salivarius Bacilos y clostridios
Enfermedades transmitidas por alimentos

Origen de los microorganismos patgenos presentes en los alimentos Infecciones e intoxicaciones Virosis
Vas de transmisin de microorganismos

Agua o alimentos contaminados
toxiinfecciones alimentarias Patgeno generalmente de tipo gastrointestinal Patgenos vehiculizados por: Comida Manos Heces Moscas
Salmonelosis Infecciones por diferentes E. coli Fiebre tifoidea por S. typhi Clera causado por V. cholera Infecciones
bacterianas
Intoxicaciones
vricas
Staph. aureus Botulismo C. botulinum
Virus de gastroenteritis viral aguda Rotavirus Hepatitis A Polio
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- Microorganismos de origen endgeno (zoonosis) o exgeno. - Para que se produzca la toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: Suficiente nmero para colonizar el intestino. Suficiente nmero para intoxicar el intestino. Cantidades de toxina significativas. Las infecciones cumplen los postulados de Koch.
POSTULADOS DE KOCH
El microorganismo debe encontrarse en todos los casos de la enfermedad Debe aislarse y obtenerse como cultivo puro a partir de las lesiones Debe reproducir la enfermedad cuando se inocula, a partir de un cultivo puro, en un animal de experimentacin susceptible (modelo animal) Debe aislarse el mismo microorganismo en cultivo puro a partir de las lesiones producidas en el animal. El microorganismo debe inducir una respuesta inmune con la aparicin de anticuerpos especficos en la sangre del hombre o animal infectado que puedan demostrarse por pruebas serolgicas.

- Microorganismos de origen endgeno (zoonosis) o exgeno. - Para que se produzca la toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: Suficiente nmero para colonizar el intestino. Suficiente nmero para intoxicar el intestino. Cantidades de toxina significativas. Las infecciones cumplen los postulados de Koch. - En las intoxicaciones hay que demostrar la presencia de toxinas. - La funcin del microbilogo de alimentos ha de ser principalmente la de prevencin y para ello hay que considerar: Las fuentes de contaminacin. Las rutas de infeccin. La resistencia de los patgenos a condiciones adversas. Las necesidades de crecimiento de los patgenos. Minimizar la contaminacin y el crecimiento de los microorganismos. Tcnicas de deteccin y aislamiento. Mtodo de muestreo proporcional al riesgo.

1. Transmisin: Hay que diferenciar entre infecciones e intoxicaciones y entre infecciones con DMI (dosis mnima infectiva) o DI50 (dosis infectiva que produce la enfermedad en el 50 % de la poblacin) bajas o altas. En muchos casos no est totalmente claro si el proceso es intoxicativo o infectivo. La DMI vara entre las personas dependiendo de su estado general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la higiene). En general las enfermedades tienen un tiempo de incubacin corto (2-10 h.) y suelen cursar con sndromes gastrointestinales

2. Morbilidad:
Solo se declara un 10 % de las toxiinfecciones (aprox.) por lo que la incidencia real de estas enfermedades no est clara.
3. Factores que contribuyen a la produccin de casos y brotes de enfermedades de etiologa microbiana transmitidas por los alimentos.
En general hay un doble fallo: (1) Contaminacin del alimento seguido de (2) abuso de temperatura que permite que los microorganismos proliferen. Los alimentos afectados con ms frecuencia son los animales (90 %) y las fuentes de contaminacin suelen estar en los establecimientos donde fueron servidos ms que en las plantas de procesado.
4. Manifestaciones clnicas ms frecuentes y complicaciones de las enfermedades transmitidas por alimentos:
En general son enfermedades breves y de buen pronstico. cursan tras 2 - 10 h. de incubacin con sndrome gastroinestinal (dolor intestinal, diarrea, vmitos). En general no tienen complicaciones salvo en poblaciones de riesgo.

C. INFECCIONES ALIMENTARIAS TRANSMITIDAS POR BACTERIAS: 1. Salmonelosis:
Producidas por algunos serotipos. Su incidencia va en aumento asociada al incremento de animales portadores. Los diferentes serotipos requieren DMI diferentes, aunque hay un gran nmero de ellos que son patgenos. El origen de las salmonelas puede ser endgeno (animales portadores asintomticos) o exgeno; las prcticas ganaderas favorecen la infeccin a travs de los piensos que pueden generar portadores asintomticos y del manejo de los animales en el matadero (aves, cerdos, terneros). En cualquier caso, los nmeros inicales suele ser pequeos y la contaminacin aparece si el alimento no es tratado correctamente desde el punto de vista trmico. Las medidas profilcticas se dirigen al control de animales portadores, procesamiento de alimentos (pasteurizacin) y reduccin de las posibilidades de contaminacin exgena. Puede ser invasiva o toxignica.

C. INFECCIONES ALIMENTARIAS TRANSMITIDAS POR BACTERIAS: 2.- Gastroenteritis por Escherichia coli enteropatgeno:
La mayora de los serotipos de E. coli son incuos; pero hay algunos enteropatgenos (enterotoxignicos no invasivos productores de una enterotoxina termolbil de alto peso molecular, TS; y enteroinvasivos que penetran en la mucosa intestinal) productores de enfermedades en nios y adultos y en animales. Para los adultos las vas de contagio son alimentos y agua. No est clara la patogenicidad de las cepas enteropatgenas de animales para el hombre y se supone que la principal va de contaminacin es la exgena. Las medidas profilcticas se dirigen a la eliminacin de animales enfermos, control de la contaminacin por manipulacin humana y refrigeracin adecuada para evitar el crecimiento de las bacterias presentes.

C. INFECCIONES ALIMENTARIAS TRANSMITIDAS POR BACTERIAS: 3.- Enteritis producidas por Bacillaceae
Producidas por Clostridum perfringens o por Bacillus cereus. Se requieren altos nmeros de bacterias (105 bact gr-1) y pueden producirse en alimentos tratados trmicamente e, incluso, protegidos frente a la recontaminacin. En C. perfringens los alimentos vehculo son carnes fras o recalentadas y platos a base de carne; en B. cereus arroz y pastas. Patolgicamente ambas enteritis son diferentes: la de C. perfringens se produce porque se ingieren muchas bacterias que al esporular reformadas (se trata de una intoxicacin), mientras que en B. cereus se trata de una intoxicacin por una toxina preformada. Las esporas de C. perfringens son ubcuas y pueden producir problemas en todo tipo de alimentos, sobre todo carnes, piezas grandes y alimentos precocinados. Las prevencin pasa por enfriar rpidamente el alimento cocinado que no vaya a ser consumido para evitar el desarrollo de las formas vegetativas de la bacteria.

D INTOXICACIONES ALIMENTARIAS AGUDAS:
enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano.
1. Botulismo: intoxicacin por Clostridium botulinum.

C. botulinum produce una intoxicacin mediante bajas dosis de una neurotoxina muy potente que produce al esporular. Es una bacteria anaerobia que puede crecer en conservas de alimentos de pH relativamente alto (>4.5) que no se han tratado trmicamente de forma adecuada. Se ha detectado un tipo de bofulismo infantil producido por la ingestin de esporas que germinan y vuelven a esporular en el intestino produciendo de nuevo la toxina. Profilaxis: tratamiento trmico adecuado de las conservas usando tratamiento 12 D u otros agentes coadyuvantes (sal, nitratos) para alimentos con pH > 4.5. La toxina botulnica es termolbil y se destruye si se calienta la conserva.

2. Intoxicacin estafiloccica.
Producida por la ingestin de alimentos en los que ha crecido una cepa patgena de Staphylococus aureus productora de enterotoxina termorresistente. La principal reserva de S. aureus es la piel, y cavidad buconasal de operarios que pueden contaminar los alimentos cuyo contenido en agua es bajo (productos de pastelera, jamn curado...) porque a mayor aw otra flora sobrecrece a S. aureus. La enfermedad es muy rpida con vmitos y dolor aguado, suele durar menos de 30 horas. Las medidas profilcticas van encaminadas a dismisnuir la contaminacin y el desarrollo de las bacterias mediante tratamientos trmicos adecuados; la destruccin de las toxinas es muy difcil dada su termorresistencia.

3. Intoxicacin por Bacillus cereus.
B. cereus como C. perfringeus, una bacteria ubcua y su ingestin en bajas cantidades es incua. Produce dos tipos de sndromes: intoxicacin diarrica (asociada a una toxina termosensible similar a la de C. perfingens que se produce durante el crecimiento exponencial y que est asociada a alimentos como sopas de ave, carne, salsas, pudding...) y una forma emtica (asociada a una toxina termorresisitente similar a la de S. aureus y asociada a arroz, y otros alimentos ricos en almidn cocinados). Profilaxis: dada la termorresistencia de las esporas hay que procurar enfriar muy rpidamente los alimentos cocinados ricos en almidn, y conservarlos a baja temperatura, para evitar el crecimiento de las formas vegetativas.

E. INTOXICACIONES ALIMENTARIAS CRONICAS:
micotoxicosis provocadas por mohos productores de toxinas activas por va oral. Muchos mohos son productores de substancias proticas de bajo peso molecular y accin txica conocidas como micotoxinas. Elevadas ingestiones de micotoxinas pueden producir cuadros agudos fcilmente detectables; pero estos casos son raros, es ms frecuente la intoxicacin por bajas dosis de micotoxinas que pueden producir intoxicaciones crnicas con efectos oncognicos o inhabilitantes en diferentes rganos (hgado, rin, cerebro). Las micotoxinas pueden ingerirse por contaminacin con mohos de alimentos de baja actividad de agua (queso, mermelada, alimentos curados, cereales) o por piensos, en el caso de animales con intoxicaciones crnicas pueden transmitir las toxinas a travs de sus productos (huevos, leche). Debido al bajo peso molecular las micotoxinas suelen ser muy termorresistentes y pueden difundir grandes distancias en los alimentos por lo que tratamientos trmicos suelen ser inefectivos y la simple eliminacin del moho no evita la micotoxina. Las profilaxis se centran en evitar la contaminacin por hongos de los alimentos y piensos (quesos, pan, harinas, cereales, frutas y mermeladas) no solo por razones estticas sino tambin sanitarias.

F. VIROSIS TRANSMITIDAS POR LOS ALIMENTOS.
El nmero de unidades infectivas que puede producir la enfermedad es muy bajo. Normalmente no suelen aislarse en los laboratorios de microbiologa de alimentos porque su manipulacin es tcnicamente compleja.
1.- Hepatitis tipo A
Este virus se transmite a travs del agua contaminada con materia fecal y de alimentos muy manipulados en condiciones de higiene deficientes (ensaladas de patatas, frutas contaminadas, zumos contaminados) y productos marinos presentes en zonas costeras contaminadas. El virus es termorresistente por lo que la proflaxis ha de centrarse en la higiene del operario, agua y productos.
Principios de anlisis de alimentos
Funcin del anlisis de alimentos Microorganismos indicadores e ndices Valores de referencia Determinacin de valores de referencia Puntos crticos
Tema 20.- Principios generales de anlisis microbiolgico de los alimentos.
Funcin del anlisis microbiolgico de alimentos. Microorganismos indicadores e ndices. Toma de muestras y anlisis microbiolgico. Fundamentos de los procedimientos analticos. Valores de referencia. Determinacin de valores de referencia. Anlisis de puntos crticos. Fundamentos ecolgicos de la eleccin de criterios microbiolgicos y de la fijacin de valores de referencia.
1. Variaciones en la carga microbiana si no hay BPE 2. Anlisis de puntos crticos 3. Sucesiones microbianas y deterioro de alimentos 4. Deterioro por grupos de alimentos

El anlisis microbiolgico de los alimentos tiene dos finalidades: (1) Comprobar la calidad de las prcticas de elaboracin del alimento (2) Comprobar la aceptabilidad de los alimentos en el mercado internacional. La finalidad principal del anlisis microbiolgico de alimentos NO es detectar microorganismos patgenos sino comprobar si el alimento ha sido preparado correctamente de forma que la probabilidad de la presencia de patgenos en l sea aceptablemente baja
Microorganismos indicadores e ndices

Carga microbiana general del alimento Indicador Mesfilos aerobios totales Medio rico inespecfico a 37C Abundantes y sensibles Enterobacterias Estado general de higiene del alimento Estreptococos tipo D Medios con sales biliares Contaminacin reciente
Resistentes
Contaminacin fecal Azida sales biliares esculina Contaminacin con materia oral o nasal Medios con telutiro
Estreptococos
mitis salivarius
Bacillus
Contaminacin con termorresistentes Supervivientes a 80C 1 min
Indicador
Estado general de higiene del alimento
ndice
Presencia de patgenos

ndice
Salmonella
Fermentacin de lactosa MacConkey 44C
Escherichia coli
Presencia de patgenos
Nicho ecolgico comn
Estreptococos tipo D
Hepatitis A
Bacillus
Clostridios
La presencia del microorganismo ndice no implica la del patgeno, SLO seala que el alimento est contaminado con material en el que se encuentra frecuentemente el patgeno
Los valores de referencia indican los lmites mximos de microorganismos presentes en los alimentos elaborados de acuerdo a las buenas prcticas de elaboracin (BPE).
corregir Valorar PE
aceptar
< 100 muestras
N de muestras
Log Carga microbiana
Tomar alrededor de 10 muestras Seleccionar ms de 10 industrias Confeccionan curvas de distribucin
Determinacin de valores de referencia
> DMI o NMA DMI o NMA Comparar con DMI o NMA
Determinar el percentil 95%
<< DMI o NMA
N de muestras
95%
Valor de referencia
m>
Valor
Log Carga microbiana
Determinacin de valores de referencia

Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m es la llamada Zona de alerta cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del mtodo de recuento, tipo de alimento, modo de preparacin y poblacin de riesgo. Este valor M ha de establecerse tericamente y la relacin M/m vera entre 3 y 103 dependiendo del tipo de alimento.
95% N de muestras
DMI
Log carga microbiana
Tolerancia en valores de carga microbiana

Valor de referencia m = 10S
Anlisis de 10 muestras
8 muestras con carga c < 10s 2 muestras con carga 10S < c < 10S+1 9 muestras con carga c < 10s 1 muestra con carga c > 10S+2
ACEPTAR RECHAZAR
Principios para decidir el nmero y los criterios que se usen como valores de referencia
1. 2. Limitar el nmero de criterios para incrementar el nmero de anlisis Criterios escogidos atendiendo a consideraciones ecolgicas 1. Microorganismos que interfieren con la salubridad del alimento (ndices) 2. Microorganismos que indiquen falta de seguridad o perjudiquen su inocuidad (indicadores) Criterios formulados con cuidado en trminos cuantitativos (considerando los errores de la medida y la distribucin de los microorganismos en el alimento) Microorganismos denominados de forma correcta (nombre o grupo taxonmico) Mtodos ensayados y descritos con todo detalle para que puedan repetirse y compararse Valores de referencia numricos deducidos de muestras obtenidas despus de tratamiento siguiendo las BPE
3. 4. 5. 6.
- Cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto cada asociacin es especifica. - De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados. Existe una serie de factores que dirigen esta seleccin. Factores intrnsecos (aw, pH , redox, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos), composicin del alimento. Tratamientos tecnolgicos: modifican flora inicial. Factores extrnsecos: condiciones fsicas del ambiente. Factores implcitos: relaciones entre los micoorganismos establecidas como consecuencia de los factores a, b y c. - Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento.
Leche, crema, queso y helados Carne fresca Alimentos de origen marino Huevos y derivados Hortalizas y verduras y tubrculos
Frutas, zumos y refrescos Encurtidos y vinagretas
Mantequilla Margarina
pH cido pH neutro emulsionados
Semiconservas
Grupos de alimentos
con actividad de agua reducida
congelados.
tratados trmicamente y envasados en recipientes hermticos.
perecederos pasterizados no envasados
Conservas appertizadas Alimentos totalmente estriles humedad intermedia:(aw= 0,7-0,85) (salazones, leche condensada, mermeladas. completamente estabilizados: (aw <0,6)
Productos de pastelera Empanadas de carne Pan

pH cido emulsionados
te ac B
as ri
pH neutro
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.

ia s Bacter
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.

pH cido emulsionados
te ac B
as ri
pH neutro
ia s Bacter
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.

ias r te c Ba
pH neutro pH cido
Ho ng os
emulsionados
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.
Hongos

ias r te c Ba
pH cido
Ho ng os
emulsionados
te ac B
as ri
pH neutro
ia s Bacter
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.
Hongos
Leche, crema, queso y helados Carne fresca Alimentos de origen marino Huevos y derivados Hortalizas y verduras y tubrculos
Frutas, zumos y refrescos Encurtidos y vinagretas
Mantequilla: Margarina:
Semiconservas
Grupos de alimentos
congelados.
Conservas appertizadas Alimentos totalmente estriles humedad intermedia:(aw= 0,7-0,85) (salazones, leche condensada, mermeladas. completamente estabilizados: (aw <0,6)
Productos de pastelera Empanadas de carne Pan
Tema 18.- Utilizacin de microorganismos en procesos ambientales
Tratamiento aerobio de aguas residuales. Tratamiento anaerobio de aguas residuales. Tratamiento de residuos slidos urbanos. Biorremediacin
Mtodos de medida de la materia orgnica

Demanda Biolgica de Oxgeno (D.B.O.) Cantidad Total de Carbono (C.O.T.) Demanda Qumica de Oxgeno (D.Q.O.)
Demanda Biolgica de Oxgeno (D.B.O.)

Concentracin de oxgeno consumido por los microorganismos
1. Demanda por quimiohetertrofos (D.O.H.) D.O.H. ( mg/ml) = D1-D5 / P Transformacin: comp.orgnicos + O2 biom. Bacteriana + NH4 + H2O biom. Protozoos + CO2
biom. Bacteriana + O2 + protozoos
Demanda Biolgica de Oxgeno (D.B.O.)

Concentracin de oxgeno consumido por los microorganismos
2. Demanda por nitrificantes (D.O.N.) Oxidacin de NH4+ a NO2- y NO3Parte del nitrgeno se incorpora a las bacterias Factor de correccin: D.O.N. = ( N disponible N asimilable )x 4.33
Demanda Qumica de Oxgeno (D.Q.O.)

Cantidad de oxgeno requerido para oxidar la materia orgnica
Valores similares a los de D.B.O. Salvo cuando la materia orgnica no es biodegradable
Carbono Orgnico Total
Carbono Orgnico Total
Cantidad de CO2 producida al oxidar la materia orgnoca con oxgeno y calor. Valores comparables a los de la D.Q.O.
Objetivos del tratamiento biolgico de aguas residuales

1. Reducir el contenido en materia orgnica de ls 2. Reducir su contenido en nutrientes 3. Eliminar los patgenos y parsitos
Composicin de la contaminacin de aguas residuales

Materia orgnica fcilmente biodegradable 40-60% protenas 25-50% carbohidratos 10% lpidos trazas de otros compuestos Materia orgnica en forma de Carbono orgnico disuelto (C.O.D.) Carbono particulado (C.O.P.)
Composicin de la contaminacin de aguas residuales
Tratamiento de aguas residuales

1.Tratamiento preliminar Eliminacin de residuos fcilmente separables 2.Tratamiento primario Procesos de sedimentacin 3.Tratamiento secundario Procesos biolgicos: lodos activados Procesos qumicos: desinfeccin 4.Tratamiento terciario Reduccin final de la D.B.O.
DESINFECCIN
FLOCULACIN
FILTRACIN
ALMACENAMIENTO
SEDIMENTACIN
Tratamiento mediante lodos activados

1. Etapas: 1. Oxidacin de materia orgnica en tanque de aireacin 2. Floculacin para separar biomasa
Tratamiento mediante lodos activados

2. Microorganismos presentes en los flculos 1. Bacterias: - Zooglea - Pseudomonas - Bacillus 2.Hongos: - Penicillium - Cephalosporium 3.Protozoos: - Ciliados - Flagelados - Rizpodos 4. Rotferos
Digestin anaerobia de aguas residuales

1. Ventajas sobre la digestin aerobia 1. Proceso ms barato: no hay que suministrar O2 2. Menor produccin de lodo por menor rendimiento 3. Produccin de gas 2. Desventajas frente a la digestin aerobia 1. Proceso lento 2. Muy sensible a agentes txicos
Tratamiento de residuos slidos urbanos

1. Caractersticas de los residuos 1. Composicin heterognea 2. Produccin muy concentrada 3. Composicin variable en tiempo, historia, etc 2. Tratamientos para los residuos slido urbanos 1. Vertedero 2.Incineracin 3.Reciclado y compostaje
Tratamiento de residuos slidos urbanos
Etapas del tratamiento de los R.S.U.

1. Incentivacin para la reduccin de volumen 2. Tratamiento por compostaje del material 3. Vertido o incineracin de residuos no compostables
Compostaje
Estrategias de clasificacin de residuos

1. Reciclable / No reciclable ms compostable 2. Compostable / No compostable ms reciclable
Compostaje
Fermentacin slida espontnea basada en el aumento de la temperatura producido por la actividad de los micoorganismos Conversin biolgica de residuos en material: 1. Microbiolgicamente estable 2. Con menor volumen y peso 3. Inocuo desde el punto de vista sanitario 4. Fciles de transportar y almacenar 5. Utilizables como aditivos para el suelo Posible slo con material BIODEGRADABLE
Generacin de calor durante el compostaje

1. Es necesario una masa mnima crtica para que se inicie el proceso. 2. Digestin aerobia de los nutrientes con produccin de calor. 3. Retroalimentacin trmica: incrementa velocidad de crecimiento. 4. Esterilizacin trmica del material.
Manipulacin del proceso de compostaje

1. Efecto de tamao y forma de la pila 2. Agitacin mecnica 3. Ventilacin
Manipulacin del proeceso de compostaje

1. Efecto de tamao y forma de la pila
Compostaje de hojas (material estacional) Pilas pequeas en otoo Unin de pilas en invierno Agitacin o separacin en primavera

2. Agitacin mecnica
No consigue una buena aireacin aunque no reduce la temperatura

Dos efectos: - Proporcionar oxgeno - Controlar la temperatura 1. Procesos basados en flujo libre de aire Diseados para proporcionar oxgeno no controlan temperatura Diseados para controlar la temperatura y oxgeno produce gradiente en la pila 2. Procesos basados en la recirculacin de aire Tnel holands
Cmo crecen los microorganismos en la naturaleza? En qu fase de crecimiento estn? Qu tipo de cultivo se ajusta ms a las condiciones naturales? Qu valores de T, aw, pH, y condicin redox encontramos en la naturaleza? Qu tipos de microorganismos encontramos? (Bacterias, hongos, virus)
Tema 23.- Los microorganismos en la naturaleza. El microorganismo y su microambiente. Superficies y biofilmes. Mtodos de ecologa microbiana. Mtodos de enriquecimiento y aislamiento. La columna de Winogradsky. Identificacin y cuantificacin de microorganismos usando sondas de cidos nucleicos, anticuerpos fluorescentes y recuentos de viables. Medida de la actividad de microorganismos usando istopos estables. Ambientes acuticos. Ambientes terrestres. Formacin del suelo. El suelo como hbitat microbiano. Microbiologa de la subsuperficie profunda. Metagenomas
individuo Comunidad 2
poblacin
Comunidad 1
Gremios
Comunidad 3
Zona xica
Distancia (mm)
Zona anxica
Distancia (mm)
microcolonias
Columna de Winogradsky
Mtodo de enriquecimiento Papel de aluminio
Agua de charco o estanque
Algas y cianobacterias
Bacterias prpura
Barro suplementado con nutrientes orgnicos y con CaSO4
Bacterias del azufre verdes y prpura
Descomposicin anxica y reduccin del sulfato
Rolf Daniel. 2004. The soil metagenome a rich resource for the discovery of novel natural products. Current Opinion in Biotechnology. Volume 15, Issue 3, Pages 199204
Rolf Daniel. 2004. The soil metagenome a rich resource for the discovery of novel natural products. Current Opinion in Biotechnology. Volume 15, Issue 3, Pages 199204
Uso de istopos estables para detectar actividad biolgica

(muestra 13C/12C) - (estndar 13C/12C) (estndar 13C/12C) X 1000
1. 2. 3.
4. 5.
Ciclos biogeoqumicos. Ciclo del carbono. Metanognesis y sintrofa. Ciclo del nitrgeno. 1. Fijacin del nitrgeno. 2. Desnitrificacin. 3. Nitrificacin. Ciclo del azufre. Ciclo del hierro. 1. Lixiviacin.
Fotosntesis oxignica
Ciclos C y O
Reservorios muy estables
Ciclo del carbono

luz
Produccin de metano a partir de celulosa

metano Origen biolgico Efecto invernadero
Condiciones anaerobias
metangenos arqueas
4 H2 + CO2
CH4 + 2 HO2
sintrofa El consumo de H2 es necesario para que se produzca la fermentacin fermentadores consumidores de H2
Produccin de metano a partir de celulosa

metano Origen biolgico Efecto invernadero
Condiciones anaerobias
metangenos arqueas
4 H2 + CO2
CH4 + 2 HO2
1.
2.
Produccin total de metano 350 800 x 108 kg/ao Bigena 80-85% total 1. Rumiantes 2. Termitas 70 % 3. Humedales 4. Pantanos Abigena 15 -20 % total 1. Combustin
Aumenta con aporte de protenas Suelos bien drenados a pH neutro Compuestos muy solubles
Inhibidores de nitrificacin nitrapirina
Ciclo del nitrgeno

Alto requerimiento energtico
85% del N2 fijado es bigeno
60 % terrestre 40 % mar Prdidas a la atmsfera 15 % NH3
Interconexin de ciclos biogeoqumicos

Oxidacin anaerobia de CH4
O2 O2 CH4 O2
Aire
O2 NH3 NO2-
O2 NO3CH4
O2 CO2
Agua contaminada con fertilizantes
Bacterias nitrificantes
Bacterias consumidoras de metano
Zona aerobia
Interfase
NO2NH3 N2 NO3CH4 NO2- / NO3CO2 + N2
Zona anaerobia
Planctomyces
Celulosa y otro material vegetal CH4 + CO2 + NH3 Bacterias no cultivadas ni clasificadas (80%) Arqueas relacionadas con las metanognicas (10%)
Raghoebarsing et al. 2006, Nature 440: 918-921
Bacterias anaerobias Protozoos Arqueas metangenas

Oxidacin anaerobia de CH4 Ciclos del carbono y del nitrgeno 5 CH4 + 8 NO3- + 8 H+ 5 CO2 + 4 N2 + 14 H2O
G0 = - 765 KJ mol-1 CH4 3 CH4 + 8 NO2- + 8 H+ 3 CO2 + 4 N2 + 10 H2O
G0 = - 928 KJ mol-1 CH4
Biomasa del cultivo enriquecido Proceso llevado a cabo por un consorcio > 1 mes
Eubacteria desconocida no cultivada (80%) ARN 16S Arquea prxima a metangenas (20%)
La desaparicin del metano en ambientes contaminados con NO3- es frecuente
Proceso extendido y con importancia ecolgica

Raghoebarsing et al. 2006, Nature 440: 918-921
hidrosoluble
H2S pH bajo HSpH neutro
gas
S2pH alto
Ciclo del azufre

Oxidacin anaerobia de CH4 Ciclos del carbono y del nitrgeno 5 CH4 + 8 NO3- + 8 H+ 5 CO2 + 4 N2 + 14 H2O
G0 = - 765 KJ mol-1 CH4 3 CH4 + 8 NO2- + 8 H+ 3 CO2 + 4 N2 + 10 H2O
G0 = - 928 KJ mol-1 CH4
Desnitrificacin
Ciclos del carbono y del azufre CH4 + SO4-- + H+ CO2 + HS- + 2 H2O
Efecto txico del HSRaghoebarsing et al. 2006, Nature 440: 918-921

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Antonio G. Pisabarro Catedrtico de Microbiologa

Estructura de los microorganismos

Estructura de los microorganismos

rbol filogentico universal

Clulas procariticas y eucariticas

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rbol filogentico universal

Biologa de los Microorganismos de Brock

Estructura de las clulas eucariticas

Estructura interna de una clula eucariota

Estructura de la hifa de un hongo

Estructura de las clulas procariticas Formas y tinciones

Morfologa de bacterias (G+)

No existe la separacin entre ncleo y citoplasma Haploides

Estructura de los microorganismos

Tamao y morfologa de las bacterias.

Tamao y morfologa de las bacterias. Formas L

Clulas normales de Bacillus subtilis (A) y formas L de esta bacteria (B)

Tamao y morfologa de las bacterias.

Micrografas electrnicas de formas L de B. subtilis

Tamao y morfologa de las bacterias.

Tamao y morfologa de las bacterias.

Tamao y morfologa de las bacterias.

Tamao y morfologa de las bacterias.

Tamao y morfologa de las bacterias.

10 m Lmite de resolucin ocular

Estructura de los microorganismos

Antonie van Leeuvenhoek

Antonie van Leeuvenhoek

Bacterias de la placa dental

Estructura de los microorganismos

Hans Christian Joachim GRAM (1853 - 1938)

Tincin de Gram: Staphylococcus aureus

Tincin de Gram: Enterococos

Tincin de Gram: Acinetobacter baumanii

Tincin de Gram de una muestra de lquido cerebroespinal infectado con B. anthracis

Estructura de los microorganismos

Grupo Hidro fbicos

Fosfolpido Protenas de Membrana

Acciones de las Protenas de Transporte

Uniporte Molcula Transportada Molcula Cotransportada

Biologa de los Microorganismos de Brock

Comparacin del Transporte Activo con la Difusin Simple

Transporte activo Concentracin Interna de solutos

Concentracin Externa de solutos

Biologa de los Microorganismos de Brock

ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO

ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO

ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO

En las cadenas peptdicas se alternan aminocidos con configuracin L y con configuracin D.

Subunidades del Peptidoglicano

Sntesis del peptidoglicano

Pentapptido Membrana citoplasmtica Interior Bactoprenol

Biologa de los Microorganismos de Brock

Estructura de los microorganismos

ESTRUCTURA DEL PEPTIDOGLICANO

Capa externa de Lipopolisacridos y Protenas (LPS)

Ncleo Polisacrido Capa Externa de Gram Negativa

8 nm Fosfolpido Espacio Periplsmico Lipoproten a Peptidoglicano Membrana Citoplasmtica

Biologa de los Microorganismos de Brock

Estructura de los microorganismos

Estructura de los microorganismos

Apndices bacterianos: flagelos y fmbrias.

Apndices bacterianos: flagelos y fmbrias.

Estructura de los microorganismos

Biologa de los Microorganismos de Brock