1.

Introduo

As protenas so os maiores constituintes de toda clula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma funo biolgica associada s atividades vitais. [1] Nos alimentos, alm da funo nutricional, as protenas tm propriedades organolpticas e de textura. Podem vir combinados com lipdeos e carboidratos. [1] A tabela 1 apresenta a quantidade de protena nos vrios tipos de alimentos.

Tabela 1: Teor de protenas em vrios tipos de alimentos. [1] Origem animal Leite integral Carne assada Ovo integral 3,5% 25% 13%

Origem vegetal Arroz integral Arroz polido 7,5% -9,0% 5,2% - 7,6%

Farinha de trigo 9,8% - 13,5%

Os peptdeos e as protenas so molculas formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Enquanto os peptdeos podem possuir de 2 (dipeptdeo) at dezenas (oligopeptdeo) de resduos, majoritariamente as protenas contm um nmero prximo ou bastante superior a 100 aminocidos.[2] A maioria dos peptdeos de baixa massa molar no exibe estrutura secundria definida quando dissolvidos em gua (comportamento conformacional randmico). Tal comportamento, porm, podem ser alterados em presena de protenas, sais, detergentes ou solventes orgnicos. Ao contrrio, as protenas apresentam estruturas secundrias e tercirias bem definidas em solues aquosas. Muitas tambm exibem estrutura quaternria. [2] Os peptdeos podem atuar como neurotransmissores, toxinas, antibiticos, adoantes, substratos e inibidores de proteases, fatores liberadores de hormnios ou hormnios. As protenas desempenham funes variadas que vo desde as estruturais at

as metablicas, passando pelas de defesa, motilidade ou de reserva. Essa enorme diversidade funcional coloca os peptdeos e as protenas em posio de destaque no campo das aplicaes biotecnolgicas. [2] Tal conhecimento gerou enorme interesse por estas biomolculas e por metodologias que levassem sua produo, isolamento, purificao, identificao e quantificao. Estas passaram a ser sistematicamente estudadas e aprimoradas. [2] Em relao s metodologias empregadas, o procedimento mais comum para a identificao de protena a determinao de um elemento ou de um grupo pertencente a protena. Os elementos analisados geralmente so carbono ou nitrognio, e os grupos so aminocidos e ligaes peptdicas. Entre os mtodos de anlise de grupos, destacam-se os seguintes: (i) mtodo por biureto, (ii) mtodo por fenol, (iii) mtodo por espectrofotometria ultravioleta, (iv) mtodos turbidimtricos, (v) mtodo dye-binding e (vi) mtodos fsicos. [1]

1.1

Mtodo por fenol ou Follin-Ciocalteau-Lowry. [1]

Foi uma das primeiras determinaes colorimtricas de protena, realizada a partir de 1912. O mtodo de Lowry apresenta limite de deteco de 0,7 mg.L-1 e leituras de absorbncia em comprimento de onda 750 nm. Neste mtodo, ocorre reduo dos constituintes ativos do reagente folin-fenol por meio das cadeias laterais de alguns aminocidos que contribuem com quatro eltrons ou pela retirada de dois eltrons de cada unidade tetrapeptdica dos peptdeos e protenas, que facilitada pela formao do quelato entre o cobre (II) e peptdeos/protenas [3]. Aps a reao acima ocorrer, a soluo desenvolve uma cor que ser medida num colormetro e comparada com uma curva padro. Contudo, o mtodo apresenta algumas vantagens e desvantagens, abaixo citadas [1]: Vantagens: (i) de 10 a 20 vezes mais sensvel que a determinao por UV, e 100 vezes mais sensvel que o mtodo por biureto. (ii) bastante especfico, pois so poucas as substncias potencialmente interferentes, sendo a sacarose, em alta concentrao, uma das poucas.

Desvantagens:

(i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi)

lento. Destri a amostra. Operaes mltiplas (muita manipulao). Necessita de curva padro com protena conhecida. Necessita perodo de incubao entre a adio dos reagentes. A intensidade da cor pode variar com a composio da protena hidrolisada.

1.2

Sobre o leite

Do ponto de vista biolgico, o leite o produto da secreo das glndulas mamrias de fmeas mamferas [5]. Possui elevado valor nutritivo, sendo o nico alimento que satisfaz s necessidades nutricionais e metablicas do recm-nascido de cada espcie. [4] Do ponto de vista fsico, o leite um fluido viscoso constitudo de uma fase lquida e partculas em suspenso, formando uma emulso natural, estvel em condies normais de temperatura ou de refrigerao. uma mistura homognea de grande nmero de substncias (lactose, glicerdeos, protenas, sais, vitaminas, enzimas, etc.), das quais algumas esto em emulso (a gordura e as substncias associadas), algumas em suspenso (as casenas ligadas a sais minerais) e outras em dissoluo verdadeira (lactose, vitaminas hidrossolveis, protenas, do soro, sais, etc.).

1.2.1 Protenas do leite [5]

As casenas e as protenas do soro diferenciam-se (tabela 2) por sua origem e caractersticas qumicas.

Tabela 2: Concentrao mdia de substncias nitrogenadas (% nitrognio total) do leite de vaca. Protenas Casenas s1 s2 Protenas do soro -lactoglobulina -lactoalbumina Soroalbumina bovina Imunoglobulinas Outras Nitrognio no-protico Peptdeos Aminocidos livres Outras substncias 95 76 30 8 27 9 2 19 9,5 3,5 1,0 2,0 3,0 5 0 0 0

Do ponto de vista tecnolgico, as diferenas mais destacveis so:

(i) Sua solubilidade distinta a pH 4,6: as protenas do soro so solveis e as casenas no (esse pH o ponto isoeltrico destas). Graas a essa caracterstica, fabrica-se iogurte, por exemplo, e podem separar-se facilmente as duas espcies proteicas.

(ii) A capacidade de algumas proteases coagularem as casenas e formar gel (base da indstria de queijo), enquanto as protenas do soro so insensveis enzima. (iii) A termorresistncia das casenas, que permite a esterilizao do leite sem que geleifique. As protenas do soro se desnaturam pela ao do calor. (iv) As casenas formam partculas coloidais (as micelas), enquanto as protenas do soro encontram-se dissolvidas na fase aquosa do leite.

1.2.1.1

Micelas [5]

J foi anteriormente citado, que no leite, as casenas encontram-se sob a forma de disperso coloidal, formando partculas de tamanho varivel. Essas partculas que dispersam a luz e que, portanto, conferem ao leite sua cor caracterstica, recebem o nome de micelas. Cerca de 95% das casenas formam partculas coloidais, ficando as restantes molecularmente dispersas dentro do leite. A micela no formada apenas por casenas, mas, em termos de extrato seco, aproximadamente 7% so componentes de baixo peso molecular, e recebem o nome de fosfato coloidal. O tamanho e o nmero de micelas esto inversamente relacionados; isto , quanto menores so as micelas, maior seu nmero. A micela uma partcula muito hidratada; calcula-se que para cada grama de matria seca pode haver 3 g de gua.

1.2.2 Protenas do soro

Nas ltimas dcadas, numerosas pesquisas vm demonstrando as qualidades nutricionais das protenas solveis do soro do leite, tambm conhecidas como whey protein. As protenas do soro so extradas da poro aquosa do leite, gerada durante o processo de fabricao do queijo. Durante dcadas, essa parte do leite era dispensada pela indstria de alimentos. Somente a partir da dcada de 70, os cientistas passaram a estudar as propriedades dessas protenas [5]. Evidncias recentes sustentam a teoria de que as protenas do leite, incluindo as protenas do soro, alm de seu alto valor biolgico, possuem peptdeos bioativos, que atuam como agentes antimicrobianos, anti-hipertensivos, reguladores da funo imune, assim como fatores de crescimento [5]. 5

As protenas do soro do leite apresentam uma estrutura globular contendo algumas pontes de dissulfeto, que conferem certo grau de estabilidade estrutural. As fraes, ou peptdeos do soro, so constitudos de: -lactoglobulina (BLG), lactoalbumina (ALA), albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas (Igs) e glicomacropeptdeos (GMP). Essas fraes podem variar em tamanho, peso molecular e funo, fornecendo s protenas do soro caractersticas especiais. Presentes em todos os tipos de leite, a protena do leite bovino contm cerca de 80% de casena e 20% de protenas do soro [6]. Os sistemas de obteno de protenas do soro so diversos e a escolha de um deles baseia-se na matria-prima disponvel e do grau de pureza desejado. Os principais mtodos empregados so: (i) precipitao cida, (ii) coagulao enzimtica ou (iii) centrifugao [5].

2. Objetivos
(i) leite. (ii) Utilizar aparelhagem destinada a medir a concentrao de substncias pela Aplicao do mtodo a um material biolgico: dosagem das protenas do

absoro da luz que atravessa as suas solues. (iii) substncia. (iv) correlao. (v) Utilizar o grfico obtido para determinar a concentrao da substncia em Fazer a regresso linear dos dados e avaliar o valor do coeficiente de Construir um grfico da absorbncia em relao concentrao de uma

uma soluo de teor desconhecido. (vi) (vii) Calcular o fator de diluio de uma amostra. Expressar o teor de protenas em uma amostra em mg/mL; g/L e em %.

3.

Metodologia utilizada

3.1

Equipamentos e reagentes

3.1.1 Instrumentao

Para a conduo do procedimento experimental, foram utilizados os seguintes instrumentos: aparelho de espectrofotmetro UV-VIS (BIOESPECTRO SP-220).

3.1.2 Reagentes utilizados

Os seguintes reagentes foram empregados:

(i) (ii)

cido clordrico (Reagentes Analticos Impex). Hidrxido de sdio (Reagentes Analticos Impex), ambos de grau analtico.

(iii) (iv) (v) (vi) (vii) (viii)

Reagente de Folin-Ciocalteau (Pr-Qumios). Soluo de leite em p 1%. Soluo padro de protena (BSA 1 mg/mL). Soluo A (soluo de sulfato de cobre 1% (p/v)). Soluo B (soluo de tartarato de sdio e potssio 2% (p/v)). Soluo C (2% de carbonato de sdio + 0,1 M hidrxido de sdio).

3.2

Preparo do reagente E

Em um bquer, colocou-se na seguinte ordem:

(i) (ii) (iii)

0,3 mL da soluo A; 0,3 mL da soluo B; 30 mL da soluo C.

A mistura das solues acima descritas foi denominada de reagente E.

3.3

Procedimento para dosagem de protena utilizando o mtodo Lowry.

Pipetaram-se de acordo com a tabela 3, diferentes volumes da soluo padro BSA, gua e amostra.

Tabela 3: Procedimento para dosagem de protena utilizando mtodo de Lowry. Volume de soluo Tubo padro BSA (1mg/mL) Volume de gua L Aguardar Reagente E 10 a temperatura ambiente. Reagente de FolinCiocalteau Incubar durante 10 temperatura ambiente e ao abrigo da luz 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L -

1 2 3 4 5 6

0 40 80 120 160 200

200 160 120 80 40 0

2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL

Para completar a tabela 3 acima, os seguintes passos foram seguidos:

(i) Com uma pipeta adicionou-se em todos os tubos 2 mL do reagente E. Misturou-se e deixou-se em repouso a temperatura ambiente por 10 minutos. (ii) Decorrido o tempo de incubao, adicionou-se 200 L do reagente de Folin-Ciocalteau. Agitao foi feita e fez-se a incubao durante 30 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. (iii) Aps o trmino da incubao, o aparelho de espectrofotmetro foi ligado e ajustado na posio do filtro no comprimento de onda desejado (750 nm). (iv) Inseriu-se na cela do fotocolormetro uma cubeta contendo o branco, e o aparelho foi zerado.

(v) Inseriram-se no aparelho as solues padres e a amostra. A anotao dos valores de absorbncias foi feita.

3.4

Preparo da amostra 1

A amostra 1 foi preparada, de acordo com os itens abaixo:

(i) 100 mL. (ii)

Mediu-se 5 mL de leite e adicionou-se 45 mL de gua em um bquer de

cido clordrico 5 M foi acrescentado com uma pipeta de 2 mL at

ocorrer a coagulao do leite. (iii) (iv) O volume de cido gasto foi anotado. O material obtido foi filtrado, sendo que o material retido no papel de

filtro foi descartado. O filtrado foi denominado de Amostra 1 sendo reservado para uso posterior.

3.5

Preparo da amostra 2

A amostra 2 foi preparada segundo o mtodo abaixo:

(i)

Foi feita a diluio do leite em 1/80 com gua destilada (1 mL de leite +

79 mL de gua). Sendo que essa amostra contm todas as protenas do leite.

3.6 Lowry

Leitura das absorbncias da amostra 1 e da amostra 2 pelo mtodo de

As leituras de ambas as amostras foram feitas seguindo o mtodo abaixo apresentado:

(i)

Enumeraram-se trs tubos de ensaio em duplicata e prepararam-se solues de acordo com os volumes estabelecidos pela tabela 4.

Tabela 4: Esquema para dosagem das protenas do leite. Tubo 0 1 2 gua 0,2mL Amostra 1 0,2mL Amostra 2 0,2mL Reagente E 2 mL 2 mL 2 mL * Sim Sim Sim Reativo de FolinCiocalteau 0,2mL 0,2mL 0,2mL ** Sim Sim Sim

*Agitar os tubos e deixar em repouso por 15. ** Agitar os tubos e deixar em repouso por 30 no escuro (dentro do armrio).

(ii) (iii)

O espectrofotmetro foi ligado, o aparelho foi zerado com o tubo branco. As leituras dos padres e das amostras foram feitas no aparelho a 750 nm.

(iv)

As leituras de absorbncia obtidas foram anotadas.

4.

Resultados e discusso

4.1

Construo da curva padro

Esse procedimento foi baseado de acordo com a tabela 3 apresentada no interior da seo metodologia utilizada. Dessa maneira, a partir de uma concentrao conhecida de protena, foi possvel construir esse tipo de curva padro. A construo da curva foi feita a partir de leituras feitas no aparelho de UV-VIS, sendo que todas as leituras referentes a cada um dos tubos foi foram feitas em duplicatas. Portanto, o grfico obtido refere-se s mdias desses valores. Tal grfico foi gerado de maneira a estabelecer uma relao entre concentrao versus absorbncia.

10

Figura 1: Curva de calibrao para BSA em diversas concentraes.

Aps o grfico ter sido gerado, obteve-se a seguinte equao da reta obtida a partir da linearizao do mesmo: ( )

Tal que:

E, para coeficiente de regresso linear:

O que gerou um desvio padro da reta, igual a:

O coeficiente R de regresso linear revelou uma forte correlao positiva entre as variveis concentrao versus absorbncia observadas na figura 1, evidenciando desse modo um ajuste bastante favorvel para a reta. Toda a anlise matemtica acima demonstrada, assim como tambm o grfico gerado foram obtidos da ferramenta grfica computacional Origin, verso 6.1.

11

4.2

Teor de protenas nas amostras

A leitura das amostras no aparelho de UV-VIS retornou os valores expressos na tabela 5.

Tabela 5: Valores de absorbncia obtidos das amostras 1, 2 e branco. Amostras Absorbncia 1 (u.a) Absorbncia 2 (u.a) Mdia das absorbncias Branco 1 2 0 0,398 0,413 0 0,295 0,351 0 0,406 0,323

A partir das mdias de absorbncia obtidas na tabela 5, foi possvel estimar numericamente a concentrao de protenas de cada uma das amostras 1 e 2. Esse resultado foi obtido da equao demonstrada no item 4.1, a qual foi gerada da curva padro de protena conhecida. Portanto, de forma a obter a concentrao, empregou-se:

Amostra 1:

Amostra 2:

A partir desses valores obtidos de concentrao para cada uma das amostras, considerou-se o fator de diluio aplicada a cada uma delas, de maneira a encontrar a concentrao de protena existente nas solues originais.

12

Dessa maneira, como fator de diluio tal que:

Onde:

Amostra 1:

Amostra 2:

13

4.2.1 Clculo para teor de casena

O fator multiplicativo de 0,9 em relao a quantidade de protenas do soro, referese a proporo existente entre as protenas do soro e as protenas totais do leite. Isto , para cada 1 litro de leite, 0,9 litros corresponde quantidade de soro em soluo. Portanto, para teor de casena na amostra:

)]

Em porcentagem, esse valor expresso empregando-se regra de trs simples:

14

Sendo assim, na anlise feita, 84% das protenas totais do leite, constituem-se de casena. Contudo, tal valor obtido nesse relatrio, entra em conflito com a informao fornecida na tabela 2, onde se aponta que a casena compe 75% das protenas totais do leite. Desse modo, verifica-se que deve ter ocorrido algum erro no identificado durante a prtica, causando esse tipo de distoro de valores.

15

5. Referncias bibliogrficas

[1] Cecchi, H. M. Fundamentos tericos e prticos na anlise de alimentos. 2 edio. Campinas: Editora da Unicamp, 2003. [2] Jnior, P. A., Kilikan, B. V. Purificao de produtos biotecnolgicos. Barueri: Manole, 2005. [3] Miwa, A. C. P., Falco, P. B., Calijuri, M. C. Avaliao de mtodos espectrofotomtricos para determinao de protena em amostras de lagoas de estabilizao. Engenharia sanitria ambiental. Vol.13 - N 2 - abr/jun 2008, 236-242. [4] Sgarbieri, V. C. Propriedades fisiolgicas-funcionais das protenas do soro de leite. Revista de Nutrio. Campinas, 17(4): 397-409, out./dez., 2004. [5] Ordoez, A. J. P. Tecnologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005. [6] Haraguchi, F. K., Abreu, W. C., Paula, H. Protenas do soro do leite: composio, propriedades nutricionais, aplicaes no esporte e benefcios para a sade humana. Revista de Nutrio. Campinas, 19(4): 479-488, jul./ago., 2006

16