UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN FACULTAD DE QUMICA

Qumica Clnica II E.L.I.S.A

Profesor: Roque Gamboa Yaez Giovanni Xool Castellanos

integrantes: Estrella Chacn Benjamn I. Vzquez Cob Carlos A. Dzib Poot Manuel A. Gngora Araujo Amairany

Saln: Audiovisual 1

Fecha de entrega: 30 de Abril de 2012 Importancia Son utilizados en el diagnstico mdico, la industria de alimentos y el estudio y control del medio ambiente.

En estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinolgicos, oncolgicos, en los trasplantes, la medicina forense y la antropologa.

Con propsitos mdicos se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas plasmticas, antgenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parsitos, hongos, bacterias, virus)

Los resultados aportan elementos diagnsticos, informacin de enfermedad y coadyuvan en la planificacin del tratamiento.

Introduccin Los Acs son la base de los inmunoensayos Analito es todo lo que se mide en una prueba de laboratorio. En el inmunoensayo, el analito puede ser tanto un Ac como un Ag. Los Acs poseen una alta especificidad y afinidad por un Ag especfico. Es esta unin especfica lo que permite la deteccin de analitos por medio de una variedad de tcnicas de inmunoensayo. La nomenclatura de los inmunoensayos es confusa, en general el nombre tiene la palabra inmuno y posteriormente la palabra que indica el marcador utilizado (Ej: enzimo) y por consiguiente hace referencia a la metodologa utilizada para la deteccin de la reaccin colorimtrica, espectrofotometra. Con el avance cientfico-tecnolgico se han desarrollado in vitro una gran variedad de Acs contra las ms diversas sustancias biolgicas.

Entonces cmo se define ELISA? Mtodo analtico que depende de la reaccin Ag-Ac.

De terminacin de la [Ag] o un [Ac], mediante el uso de ellos inmovilizando en fase slida y el otro en solucin.

Cualitativo, cuantitativo. Dependiendo del diseo: se puede emplear Ags, haptenos, o Acs marcados con una enzima, para revelar: Ags, Acs, hormonas o frmacos presentes en los fluidos corporales.

El producto de la reaccin, puede ser detectado y cuantificado mediante un marcador enzimtico con un sustrato apropiado.

Principio bsico de ELISA De la reaccin consiste; al suero problema se le agrega un conjugado que son anticuerpos dirigidos contra anticuerpos humanos o antgeno, los cuales se unirn a una enzima. Las enzimas son capaces de modificar al sustrato en presencia de un cromgenos produciendo un producto coloreado que es detectado visualmente o por un espectrofotmetro. Este principio tiene las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre.

Fundamento

 La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de estos componentes (Ag Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente) la reaccin Ag-Ac quedara inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un sustrato especifico que al actuar con la enzima producir un color observable colorimetra. La reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. Caractersticas a tomar en cuenta respecto a esta reaccin: Especificidad Diversidad Afinidad Avidez a simple vista o cuantificable por espectroscopia o

Diferentes tipos de elisa: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sndwich ELISA competitivo ELISA No competitivo

Ventajas: Muy sensibles,gran numero de muestras procesadas simultanea mente, resultados rpidos, utilizacin de reactivos poco txicos,menor costo y cuantificacin de diversas sustancias. Componentes de ELISA: Fase solida, antgeno, anticuerpo, complejo-enzima, sustrato.

DISEOS: ELISA COMPETITIVO El anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra. Variacin: Se utiliza un reactivo limitado Se detectan Ac especficos independientes de su isotipo

ELISA NO COMPETITIVO Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color. Variacin: Tambin conocido como inmunometrico reactivo en exceso Con reactivo en exceso son los mas utilizados en infecciosas Diseados para dectar Ags como Acs inmunopatologias

Pasos generales de elisa 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo. 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos. 3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo

4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del substrato 9. Unin del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color Elisa directo 1. Se selecciona una fase solida, esta se escoge dependiendo del tipo de ensayo a realizas, y de las determinadas propiedades del materia. En la tabla siguiente se menciona alguno de estos materiales para la fase solida.

2. Se fija los anticuerpos a la fase solida, el anticuerpo previamente se debi seleccionar dependiendo las caractersticas del ensayo y del antgeno a determinar. Se pueden manejar dos tipos de anticuerpos: a. Anticuerpos Policlonales i. Heterogneos ii. Reconocen eptopes diferentes del Ag iii. Producidos por numerosos clones de Linfocitos b. Anticuerpos Monoclonales i. Homogneos

ii. Especificidad nica iii. Producidos por un nico clon de Linfocitos Disponibles en cantidades ilimitadas 3. Luego del a incorporacin de cada componente se debe efectuar una serie de lavados, esto para eliminar el exceso (fisico-inmunologico) que no se haya fijado al soporte solido. a. Generalmente: De 3 a 6 lavados dpendiendo de la tipo Duracin de 30 sega 1 minc/u Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH7,2

4. Adicin del Antgeno, se adiciona la muestra que contiene el antgeno a determinar. a. Contenido en la muestra, puede ser: i. Completo ii. Extrado totalmente iii. Una fraccin purificada iv. Pptido sinttico v. Protena recombinante 5. Si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Se realiza un Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado 6. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima, el

segundo anticuerpo reconocer los antgenos y se unir, creando un complejo que tiene acoplado una enzima que se encuentra en el conjugado del segundo anticuerpo 7. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 8. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado a. El sustrato especfico al actuar con la enzima producira un color observable colorimetra. a simple vista o cuantificable por espectroscopia o

Monoclonal o Policlonal?

Dependiendo de los tipos de anlisis se puede seleccionar el tipo de anticuerpo, siendo el policlonal el de mayor sensibilidad debido a que este puede reaccionar con varios antgenos, y el monoclonal como el mayor especifico debido a que solo reacciona con un solo tipo de antgeno. Enzimas Son seleccionadas segn el estudio Peroxidasa Fosfatasaalcalina -galactosidasa Penicilinasa Ureasa Glucosa oxidasa

Requerimientos del sustrato: Solubles en agua ( aunque tambin existen insolubles en agua) Fcil de manipular No txicos, no mutagenicos, Bajo costo

Hay una gran lista de sustratos dependiendo de la enzima que dar un color diferente Formacin de colores por la accin enzimtica

ELISA Indirecto Consta de las siguientes etapas: (Captacin de anticuerpos): 1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. 2. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 3. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. 4. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 5. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. 6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 7. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). 1. Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno.

2. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. 3. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo. Lectura e interpretacin de resultados La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimtricamente. Evita la adquisicin de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacas. Los resultados finales de la lectura colorimtrica se reflejan numricamente mediante valores de absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la longitud de onda ms adecuada para la coloracin final alcanzada. A simple vista, pueden ser ledos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacin y no se presenten abundantes casos dudosos. Dicha lectura visual tendr el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos lmite. Una de las grandes ventajas de la tcnica ELISA es la posible automatizacin de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatizacin se puede conseguir con un simple colormetro o espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automtica de microplacas. Reporte de resultados:

Reporte cualitativo Positivo Negativo

Reporte cuantitativo ng o g/ mL Unidades internacionales de ELISA (UIE).

El cambio de color indica un resultado positivo, porque la enzima ha reaccionado con el sustrato. De acuerdo a la absorbancia de ese producto obtenido, a partir del sustrato que cataliza la enzima, depende el resultado. Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados. Aplicaciones Deteccin de antgenos o anticuerpos: Virus, Hongos, Parsitos, bacterias. Deteccin de autoanticuerpos:.IgG (Factor reumatoideo), DNA, Protena del ncleo Tiroglobulina- Microsomales Complejos inmune. Medicin de Hormonas: Progesterona, estrgenos, cortisol, insulina, testosterona, gonadotrofina corinica humana, TSH. Deteccin de antgenos tumorales: Antgeno prosttico, Alfa-fetoprotena,

Antgeno del ovario, Antgeno carcinoembrionario.

Referencias bibliogrficas 1. Lequin, R.M. enzy inmunoassay (EIA)/ Enzyme-linked inmunosorbent Assay ( ELISA). Clinical chemistry. 2005 2. Martinez, J. inmunologa. Bases moleculares y celulares 3. Geors, J. Immunochemical tecniques. Laboratory Manual