CARACTERIZAO DE MICROORGANISMOS I

C L A S S IF IC A O D E M IC R O R G A N IS M O S
T A X O N O M IA : D o g re g o q u e r d iz e r A r r a n jo o r d e n a d o C i n c ia d a ta x o n o m ia in c lu i: C la s s ific a o (a rra n jo ou a g ru p a m e n to c o m p a rtilh a m c a ra c te rs tic a s c o m u n s )

de

o rg a n is m o s

que

T A X A o u c a te g o ria s ta x o n m ic a s O b je tiv a a g ru p a r o s o rg a n is m o s c o m b a s e e m s u a s s im ila rid a d e s . G n e ro s = E s p e c ie s in tim a m e n te re la c io n a d a s E s p c ie = o ta x o n b s ic o E s tirp e /is o la d o = in d iv id u o o u m e m b ro d e u m a d a d a e s p c ie N o m e n c la tu r a O b je tiv a id e n tific a r, c o m u m n o m e , u m o rg a n is m o o u o g ru p o a q u e e le p e rte n a . F ilo g e n ia = a h is to ria e v o lu tiv a d e u m g ru p o A ta x o n o m ia fo r n e c e fe r r a m e n ta s : p a ra e s c la re c e r a e v o lu o d o s o rg a n is m o s e a s in te r-re la e s e n tre e le s . p a ra d e s e n h a r u m s is te m a d e c la s s ific a o n a tu ra l, re fle tin d o re la e s filo g e n tic a s re a is . A t o m o m e n to o s b i lo g o s j id e n tific a ra m e c la s s ific a ra m m a is d e 1 .5 m ilh e s d e o rg a n is m o s d ife re n te s .

SISTEMAS DE CLASSIFICAO
1. Linnaeux (sec. XVIII) - Binomial: Plantae Animalia 2. Haeckel (1866): Plantae Animalia Protista (bacterias, algas, protozorios e fungos) 3. Whittacker (1969) Baseado em observaes microscpicas: Planta (algumas algas, musgos, samambaias, conferas e fanerogamas) Animalia (esponjas, vermes, insetos e vertebrados) Protista (bolores aquaticos, bolores limosos, protozorios e algas primitivas) Fungi (leveduras, bolores multicelulares e cogumelos) Monera ou Procaryotae (todas as bactrias). Baseado em que todos eucariotos se originaram de procariotos. 4. Woese (1978) Baseado em bioqumica e biologia molecular: Archaea (bacteria resistente a alta temperatura/salinidade) Eubacteria (Todas as outras bacterias) Eucarya (planta, animal, protozoa, algas, fungi)

SISTEMA DE CINCO REINOS

(WHITTAKER)

SISTEMA DE TRS DOMNIOS

Descobertas recentes baseadas em estudos sobre RNA ribossomal e transportador, variabilidade em membranas lipidicas e sensibilidade a antibiticos mostraram que existem 2 tipos de clulas procariticas em adio s clulas eucariticas. 1978, University of Illinois, Carl Woese props agrupar os trs tipos de clulas em uma categoria chamada domnio que se posiciona acima de reino. Os trs domnios so: Archaea, Eubacteria, Eucarya (acima de reino) Procariotos e eucariotos desenvolveram de uma forma ancestral comum e evoluram em vias diferentes. Acredita-se que clulas eucariticas tenham surgido de um processo de endo simbiose onde uma clula eubactria ancestral tenha entrado em outra clula e desenvolvendo-se em organelas.

EVIDNCIAS

Mitocndrias e cloroplastos tm genes e ribossomos prprios. Variabilidade das seqncias nucleotdicas: Regies gnicas variam lentamente durante 4 bilhes de anos de evoluo o que sustenta a idia de que todos os organismos desenvolveram de ancestrais comuns. Regies espaadoras (introns) variam mais rapido: Maiores diferenas nestas regies sugere divergncia, h muito tempo, de um ancestral comum, enquanto mais similaridades mostra divergncia mais recente de um ancestral comum.

TRS DOMNIOS
WOESE

Archaea (arqueobactria)
Clulas procariticas Parede celular sem peptidioglicano Sobrevivem em ambientes extremos o que caracteriza 3 reinos: 1. Metanogeneas (anaerbicos estritos que produzem metano (CH4) a partir de dioxido de carbono e hidrognio). 2. Halfilas (dependem de altas concentraes de sais) - mar morto. 3. Termoacidfilas (demandam ambientes cidos e quentes) vulces e fontes termais.

Eubactria
Clulas procariticas Parede celular com peptidioglicano Sensveis a antibiticos Incluem 4 reinos: 1. Micoplasmas - minsculos 2. Cianobacterias- conhecidas como algas azuis 3. Bactrias Gram-positivas 4. Bactrias Gram-negativas.

MATRIA ORGNICA X BACTRIAS ANAERBIAS = CH4 gs metano, CO2 gs carbnico, H2O gua. H2S gs sulfdrico, NH3 amnia e novas clulas.

Eukarya (eucariotos) Celulas eucariticas Quando tem paredes celulares no possui peptideoglicanos No so sensveis a antibiticos Inclui 4 reinos: a. Reino Protista Simples, unicelulares Exemplos: fungos limosos, euglenoids, algae, protozorios, diatomceas, etc. b. Reino Fungos So eucariotos unicelulares ou multicelulares. Possuem parede celular No realizam fotossntese Obtm nutrientes via absoro. Exemplos: Ascomicetos, basidiomicetos, leveduras c. Reino Plantae Eucariotos multicelular Clulas se organizam em tecidos Possuem parede celular Nutrio ocorre via fotossntese e absoro. d. Reino Animalia Eucariotos multicelulares Clulas organizadas em tecidos No possuem parede celular Nutrio via ingesto

NOMENCLATURA CIENTFICA
Desenvolvida no sculo XVIII por Linnaeux. Para evitar confuso de identidade baseado em nomes comuns (varia regionalmente). NOMENCLATURA BINMIAL = Todo organismo recebe dois nomes. Genrico (Gnero) comea com letra maiscula Especfico (Espcie) comea com letra minscula Ambos nomes so sublinhados ou escritos em itlico Existem entidades cientficas responsveis pelas regras de nomeclatura. Cdigo Internacional de Nomenclatura Botnica Comisso Internacional de Bacteriologia Sistemtica, publicaes da classificao na revista International Journal of Systemic Bacteriology e Bergey's Manual. Todos os nomes derivados do latim / Grego. Nomes antigos (errados) seguem em parnteses (= sinnimo).

A HIERARQUIA TAXONMICA

Os organismos so agrupados em uma srie de subdivises Reinos relacionados = mesmo Domnio / Imprio (no caso de bactria) Filos relacionados = mesmo Reino Classes relacionadas = mesma Diviso / Filo Ordens similares = mesma Classe Famlias similares = mesma Ordem Gneros relacionados = mesma Famlia Espcies relacionadas = mesmo Gnero Organismos intimamente relacionados e se reproduzem entre si = Espcie

CLASSIFICAO DE BACTRIAS Encontrada no Bergey's Manual of Systematic Bacteriology So separadas em 4 divises: 3 Eubacteria e 1 Archaea Classificao baseada em similaridades na seqncia do rRNA. Cada diviso separada em classes, num total de 7 classes. Uma espcie bacteriana uma populao de clulas com caractersticas similares. Bem diferente das espcies eucariticas cuja definio baseada no fato de que os indivduos podem cruzar entre si = espcie biolgica. Bergey's Manual - usado como referncia para identificao de bactrias no laboratrio.

POSSVEIS RELAES FILOGENTICAS DOS PROCARIOTOS

CLASSIFICAO DE VRUS
No so parte dos 5 reinos ou dos 3 domnios No so considerados clulas So parasitas intracelulares obrigatrios e utilizam o maquinrio da clula do hospedeiro para sua multiplicao. Genoma viral direciona a biossntese da clula hospedeira para sntetize molcular e alguns podem se incorporar ao genoma do hospedeiro. Espcie viral = uma populao com caractersticas similares (morfologia, genes, enzimas, capa proteica, etc) ocupando um nicho ecolgico especfico, uma clula hospedeira. Hipteses sobre origem dos virus: Surgiram de DNA/RNA de replicao independente (por exemplo plasmidios) Surgiram a partir de clulas degenerativas (que perderam habilidade de sobreviver independemente, sobrevivendo somente associadas a outras clulas)

MTODOS PARA CLASSIFICAO E IDENTIFICAO DE MICROORGANISMOS Caractersticas morfolgicas (estruturais) Visualisadas atravs de microscopia Tamanho, forma, arranjo Estruturas intracelulares e extracelulares Base de Taxonomia clssica Simples No suficiente para disciminar muitas bacterias (podem ser muito parecidas) Baixa preciso sobre relaes filogenticas Caractersticas culturais Visualisadas a olho n ou com auxlio de lupa Baseada em forma, arranjo, cor (subjetivo) Base da Taxonomia clssica Usadas na classificao de fungos Exigncias nutricionais (Testes bioqumicos) Necessidades nutricionais ajudam na identificao (compostos simples at complexos) Condies fsicas (temperatura, luminosidade, oxignio, etc) ajudam na identificao. Produo de enzimas: amplamente utilizadas na identificao de bactrias Mais rpido que morfologia Mais preciso que morfologia Utilizado nos laboratorios hospitalares

Mtodo para identificao rpida de gneros de bactrias entricas

Mtodo para identificao rpida de bactrias

EnterotubeTM da Becton Dickison

API 20E

OUTRAS TCNICAS PARA DIFERENCIAO Tcnicas sorolgicas Teste de aglutinao em lminas Western blotting Elisa Fagotipagem Seqenciamento de aminocidos Perfil de cidos graxos Citometria de fluxo Hibridizao de cidos nucleicos Outros

Caracterizao de Microrganismos
Microscpia

Relao entre tamanho de vrias amostras e a resoluo do olho humano, microscopio optico e microscopio eletrnico

MICROSCPIO PTICO COMPOSTO Condensador: Focaliza os raios de luz atravs da amostra Lentes objetivas: Magnificao da imagem depois que a luz passa atravs da amostra Lente ocular: Amplia a imagem formada pela lente objetiva

 Calculo da ampliao (magnficaco) total: ampliao da objetiva X ampliao da ocular Ex: lentes objetivas de 10, 40 ou 100 X ocular de 10 = 100x, 400x e 1000x Resoluo / Poder de resoluo: a menor distncia entre dois pontos em que ainda podemos distingir cada ponto individualmente. Resoluo: Quanto maior o comprimento de onda, menor a resoluo Ex: Luz branca tem comprimento longo resoluo max de 0.2mm ndice de refrao: medida da velocidade relativa com que a luz passa atravs de um material.

REFRAO NO MICROSCPIO COMPOSTO USANDO LEO DE IMERSO

TIPOS DE MICROSCOPIA
Microscopia de cam po claro (microscpio ptico com posto normal) Fonte de luz uma lmpada ou luz do dia. Raios que incidem no espcim e so desviados e refocalizados pelas lentes objetivas. Amostras transparentes no destacam m uito necessitando usar corantes para visualizao adequada. Microscopia de cam po escuro Tem condensador e objetiva especiais. Condensador direciona os raios para a amostra em tal ngulo que somente os raios que incidem sobre a amostra so desviados para as objetivas. til para microorganismos em que corantes no podem ser usados. Ex: Microorganismos vivos que tem movimento caracterstico - Espiroquetas, Treponema pallidum. Microscopia de Contraste de Fase Tem condensador e objetiva especiais. Permite contraste entre materiais com densidades diferentes na amostra. Mais densos aparecem mais claros Menos densos (mais prxim a a da gua) mais escuros til na visualizao da estrutura celular dos microorganism os vivos

Campo claro

Campo escuro

Contraste de fase

Microscopia de Contraste com Interferencia Diferencial (CID) Similar a microscopia de contrase de fase (utiliza as diferenas nos ndices de refrao) 2 feixes de luz Prismas separam cada feixe de luz, adicionando cores contrastantes Resoluo maior do que contraste de fase Cores brilhantes Quase tridimensional

MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA Fluorescncia: abilidade de substancias em absorver comprimentos de luz de ondas curtas (UV) e refletir a luz em um comprimento de onda maior, visualisada com filtros especiais de luz. Alguns organismo fluorescem naturalmente sob iluminao especial, mas alguns precisam ser corados com um corante fluorescente fluorocromo, DAPI, FITC, Calcofluor. Microrganismos examinado sob microscpio fluorescncia aparecem luminosos (fluorescentes). de

Exemplos: Mycobacterium tuberculosis tratada com fluorocromo auramina O se liga fortemente ao corante e visualisado em amarelo-brilhante contra um fundo escuro). Imunofluorescncia: Fluorocromo combinado quimicamente com um anticorpo especifico contra um dado microrganismo. Reao positiva = fluorescencia = identificao positiva = muito rapido. Exemplos: Treponema pallidum (Sifilis)

MICROSCOPIA ELETRNICA

Microscopia Confocal (MC)

Microscopia eletrnica de varredura (MEV) Microscopia eletrnica de transmisso (MET)

MET

MEV

Microscopia tica

MEV

MET

PREPARAO DE AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA PTICA Colorao: A maioria dos microorganismos so incolores sob o microscpio. Portanto necessrio cor-los com um corante para visualiz-los. Tipos comuns de colorao Colorao simples: usa solues aquosas ou alcolicas de um nico corante. Ex: Azul de metileno, carbolfuccina, violeta genciana, etc. Coloraes diferenciais: usa solues aquosas ou alcolicas de diferentes corantes permitindo diferenciar tipos distintos de bactrias. Colorao de Gram Colorao de resistncia ao lcool-cido

COLORAO DE GRAM Desenvolvida pelo bacteriologista dinamarques Hans Christian Gram (1884) Procedimento muito til, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos
Gram-positivas Gram-negativas

Caractersticas importantes para diferenciao

Gram-posistivas tem parede celular de peptideoglicano mais espessa Gram-negativa tem parede menos espessa e com uma camada de lipo polissacardeos

Princpio
Diferenas estruturais na parede celular dos dois grupos afetam a capaci dade de reteno ou liberao da combinao de corantes usados (violeta genciana e iodo).

PROCEDIMENTO DA COLORAO DE GRAM

(a) O Um esfregao de cocos e bacilos fixado com calor primeiramente coberto com um corante prpura bsico (colorao primria) como a violeta de genciana, e ento o corante lavado. (b) O esfregao coberto com iodo (um mordente) e lavado. Neste momento, ambas as bactrias gram-positivas e gram-negativas adquirem cor prpura. (c) A lmina lavada com etanol ou uma soluo de lcool-acetona (um descolorante) e ento lavada com gua. Agora, as clulas gram-positivas esto prpura e as gram-negativas esto incolores. (d) Na etapa final, a safranina adicionada como contracorante, e a lmina lavada, seca e examinada microscopicamente. As bactrias gram-positivas retm o corante prpura, mesmo aps a lavagem com lcool. As bactrias gram-negativas aparecem de cor rosada, pois adquirem o contracorante safranina.

 Quando aplicados aos indivduos dos dois grupos, a violeta genciana e o iodo penetram facilmente as clulas. Dentro das clulas os dois corantes se combinam formando o complexo CV-I O complexo CV-I maior que cada corante individualmente Devido ao seu tamanho o CV-I no pode ser removido pelo lcool atravs da
parede intcta das bactrias gram positivas. Desta forma a violeta genciana fica retida dentro da clula a qual se torna purpura.

Nas clulas gram negativas o lcool consegue retirar o complexo CV-I pois o
lcool rompe a camada externa de lipopolissacardeo permitindo a sada do corante, deixando as bactrias incolores.

o corante safranina que permite a visualizao das clulas gram negativas

as quais se apresentam rosa.

QUESTES PARA O TESTINHO DA PRXIMA AULA

1 Explique os domnios Archae, Eubacteria e Eucaria. 2 Como ocorre a colorao de Gram? 3 Explique o que so bactrias metanognicas, halfilas e termoacidfilas.