B YOK MYADA TEMEL HESAPLAMALAR

Do. Dr. Ufuk akatay Do. Dr. Seval Aydn Prof. Dr. Ahmet Belce

B YOK MYADA TEMEL HESAPLAMALAR

B YOK MYADA TEMEL HESAPLAMALAR

Do. Dr. Ufuk akatay

stanbul niversitesi, stanbul Tp Fakltesi, Klinik Biyokimya Merkez Laboratuar

Do. Dr. Seval Aydn

stanbul niversitesi, Cerrahpaa Tp Fakltesi, Biyokimya Anabilim Dal

Prof. Dr. Ahmet Belce

stanbul niversitesi, Cerrahpaa Tp Fakltesi, Biyokimya Anabilim Dal

 NDEK LER
B R M S STEMLER ve DNMLER KONSANTRASYON ve D LSYON HESAPLARI
Genel tanmlamalar Sorular ve cevaplar

P PETLER
Genel aklamalar Gravimetrik pipet kalibrasyonu Fotometrik yntemle pipet kalibrasyonu Sorular ve cevaplar

SANTR FJ
Genel prensipleri Rotor tipleri Rlatif santrifj kuvvetinin bulunmasnda kullanlan eitliin hesaplanmas Alternatif rotorun rpm ve sedimentasyon sresinin hesaplanmas Berraklatrma faktrnn (k) hesaplanmas Sorular ve cevaplar

ELEKTROMANYET K RADYASYON, SPEKTROFOTOMETR VE SPEKTROFLOROMETR

Elektromanyetik radyasyon Molekler orbital teorisi ve elektromanyetik radyasyonun molekl ile etkileimi Spektrofotometri Lambert-Beer eitliinin hesaplanmas Lambert-Beer kanunundan sapmalar Dorudan spektrofotometrik yntem ile protein konsantrasyonunun belirlenmesi Spektrofotometrik yntem ile nkleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi Spektrofotometrik yntem ile enzim aktivitesinin belirlenmesi Spektroflorometri Sorular ve cevaplar

STANDART ER DEN YARARLANILARAK YAPILAN KONSANTRASYON HESAPLAMALARI

Genel prensipleri Sorular ve cevaplar

pH ve TAMPONLARLA LG L HESAPLAMALAR
Genel tanmlamalar Henderson-Hasselbalch eitliinin hesaplanmas pH metre ve tamponlarn hazrlanmas Sorular ve cevaplar
4

YEN GEL T R LEN B R B YOANAL T K YNTEM N DENEYSEL GEERL L N N TEST ED LMES

Analitik Kesinlik ve Doruluk Recovery (Verimlilik) Lineerite (Dorusallk) Sorular ve cevaplar

KAYNAKLAR NDEKS

NSZ
Disiplinler aras bir bilim olan biyokimya; matematik, fizik ve kimyann prensipleri ile sistematik olarak btnleerek, canllkla ilgili srelerin ayrt edici zelliklerini yap ve fonksiyon arasndaki ilikilerin terimleri ile aklamaya almaktadr. Son yllarda biyokimyann hcre biyolojisi ve mikrobiyoloji ile birlemesiyle oluan molekler biyoloji alan; tp, tarm, eczaclk ve gda endstrisindeki biyolojik srelerin anlalmasnda ve kontrolnde nemli gelimelere yol amtr. Kitabmzda her blmn banda verilen temel bilgiler, blm sonunda verilen problemlerin zmne yardmc olacak ekilde geniletilmitir. Blm iindeki temel bilgi ve kavramlar problemlerin anlalmasna ynelik olarak yer yer ekil ve tablolarla desteklenmitir. Matematiksel ve fiziksel tanmlamalar ile bu tanmlamalardan trevlenen ilikiler, her konuyu temel dzeyde anlamaya yetecek lde snrl tutulmutur. Kitabmzdaki blmlerin sonunda verilen pek ou temel ve pratik neme sahip aklamal saysal soru ve cevaplarn, farkl disiplinlerden gelen okuyucularn deneysel almalarnda benzer modeller oluturmalarna yardmc olmasn mit ediyoruz. Kitabn yayna hazrlanmas srasndaki katklarndan dolay Karolin Yanara teekkr ederiz.

B R M S STEMLER ve DNMLER
Bilimsel lmler konvansiyonel olarak metrik sistem ile ifade edilir. Ondalk-esasl olan metrik sistem, matematikte kullanlan ondalk sistemle uyumludur. Bu sistemin nemli bir avantaj; kesirli olarak da gsterilebilen standart l birimlerinin ondalkl sistemde gsterilebilmesine olanak tanmasdr. Metrik sistemde; arlk, uzunluk, hacim ve zamann gsterilmesi iin kullanlan standart birimler srasyla gram (g), metre (m), litre (L) ve saniyedir (s). Standart birimler standart nek ve sembollerle gsterilir (Tablo 1.1). Kantitatif analiz yaplan laboratuarlarda ondalkl olarak gsterilen birimlerin 10un kuvveti eklinde kullanlmas metrik sistem birimlerin birbirine dntrlmesinde ve hesaplanmasnda kolaylk salamaktadr (Tablo 1.2). Metrik sistem bilimsel alanda yaygn olarak kullanlmakla birlikte, rapor edilen birimler bakmndan bir laboratuardan dierine farkllklar grlebilmektedir. Bilimin uluslararas niteliine bal olarak, bilim evreleri arasndaki iletiimi kolaylatrmak amacyla, kantitatif lmlerle ilgili birimlerin ak olarak tanmlanmasna ve standardizasyonuna ihtiya duyulmutur. Bu nedenle 1960 ylnda SI (System International: Systme International dUnits) kabul edilmi ve birok uluslararas bilimsel organizasyon tarafndan benimsenmitir. Zaman iinde orijinal SI sisteminde deiiklikler yaplarak biyokimya laboratuar ile ilgili verilerin rapor edilmesine daha uygun bir hale getirilmitir. Biyokimyada genellikle kk hacimlerin kullanlmas nedeniyle; (SI) yerine konvansiyonel birimler olan litre (L), mililitre (mL), mikrolitre (L), nanolitre (nL) gnmzde pek ok bilimsel dergide kullanlmamaktadr (Tablo 1.2). Konvansiyonel konsantrasyon birimini SI karlna evirebilmek iin maddenin molekl arlnn bilinmesi gerekir. Tablo1.3teki fiziksel sabitler ve Tablo 1.4teki semboller SI kapsamnda yaygn olarak kullanlmaktadr. Ppm, ( ng.: Parts per million) milyonda bir birime verilen isimdir. Herhangi bir zeltideki toplam madde miktarnn milyonda (mikro) 1 birimlik maddesine 1 ppm denir. Her harfi de kk olarak "ppm" eklinde yazlr. Dier bir konsantrasyon birimi olan Ppb ( ng: Parts per billion) ise milyarda bir (nano) olarak tanmlanr. Tablo 1.1: Kantitatif terimlerle ilgili yaygn olarak kullanlan birimler, nek ve semboller Kat 1018 1015 1012 109 106 103 102 101 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 nek Exa Peta Tera Giga Mega Kilo Hekto Deka Desi Santi Mili Mikro Nano Piko Femto Atto Sembol E P T G M k h da d c m n p f

Tablo 1. 2: Konvansiyonel ve uluslararas sistemdeki (SI) hacim nitelerinin birbirine dnmleri Konvansiyonel 1 litre (L) 1 mililitre (mL) 1 mikrolitre (L) 1 nanolitre (nL)
3

10 mL 1 mL 10-3mL 10-6mL

SI =1 dm3 =1 cm3 =1 mm3 = 1 nm3

=10-3 m3 =10-6 m3 =10-9 m3 =10-12 m3

Tablo 1.3: nemli fiziksel sabitlerin uluslar aras sistemdeki (SI) birimsel deerleri Fiziksel Sabit Avogadro says (N) Dalton (D) Elektron volt (eV) Elementer yk (proton) (e) Faraday sabiti (F) Planck sabiti (h) Universal gaz sabiti (R) Vakumdaki k hz (c) Kelvin (K) Birim 6.023 x 1023 1.661 x 10-24 g 1.602 x 10-19 C 1.602 x 10-19 C 9.6485 x 104 C mol-1 6.626 x 10-34 J sn-1 8.314 J mol-1K-1 2.998 x 108 m sn-1 273.15 oC

Tablo 1.4: Bilimsel adlandrmalarda yaygn olarak kullanlan harfler ve okunular A () (alfa) E () (epsilon) I () (iota) N () (n) P () (ro) () fi B () (beta) Z () (zeta) K () (kappa) () ki () sigma X () ki () (gama) H () (eta) () (lambda) O () (omikron) T () (tau) () pisi () (delta) () (teta) M () (m) () (pi) Y () (upsilon) () (omega)

Sorular ve cevaplar
Soru 1: Aada verilen ondalkl saylar bilimsel sistemde gsteriniz. a) 0.000000000015 b) 0.0000500042 c) 437.28 x 10-7 Cevap: a) 1.5 x 10-11 b) 5.00042 x 10-5 c) 4.3728 x 10-5 Soru 2: Aada bilimsel sistemde verilen saylar ondalkl sisteme eviriniz a) 4.37 x 105 b) 2 x 101 c) 23.4 x 107 d) 3.2 x 10-4

Cevap: a) 437000 b) 20 c) 234000000 d) 0.00032 Soru 3: 50 M-1 ditiyonitin konsantrasyonunu mM cinsinden hesaplaynz. Cevap: a-1=1/a 1/50 M = 0.02 M =20 mM Soru 4: znrlk sabiti (Kd) 3.8 mM olarak verilmektedir. M-1 olarak karln hesaplaynz. Cevap: 3.8 mM=3.8 x 10-3 M a-1=1/a olduundan 0.263 x 103 M-1 Soru 5: Aadaki birimlerin birbirine dnmlerini hesaplaynz. 50 L=? mL, 0.5 mg= ? g, 250 mL= ? L, 0.05 mg= ? ng Cevap: 50 L x 1 mL / 1000 L = 5 x 10-2 mL 0.5 mg x 103 g / 1 mg = 500 g 250 mL x 1/ 1000 = 0.25 L 0.05 mg x 106 / 1 mg = 5 x 104 ng Soru 6: Protein konsantrasyonu 7.8 g/dL olarak saptanan bir serum rneinin 300 Lsi bir deney tpne pipetleniyor. Tpteki protein miktarn miligram cinsinden hesaplaynz. Cevap: 7.8 g/dL=7.8 x 103 mg/dL 1 dL=102 mL=105 L Tpteki protein miktar= 3 x 102 x 7.8 x 103 / 105 = 3 x 7.8 x 105 x 10-6 = 3 x 0.78 =2.34 mg Soru 7: Molekl arl 0.4 kDa olan 100 mg doymu ya asidi monomolekler film tabakas halinde su stne yayldnda bir banyo kvetini, ya da bir yzme havuzunu mu, yoksa bir gln yzeyini mi kaplar? 1 Ao=0.1 nm=10-10 m, 1 nm=10-9m, 1 ya asidi molekl 21 (A0)2 alan kaplar. Cevap: 0.4 kDa=400 Da=400 g 400 g ya asidi 1 moldr, 0,1 gram ya asidi =0.1 x 1 mol g / 400 g =2.5 x 10-4 mol g 2.5 x 10-4 mol/g x 6.02 x 1023molekl / 1 mol/g =1.5 x 1020 molekl (1.5 x 1020 ) x (21 oA2=21 x 10-20 m2) / 1 molekl =31.5 m2 Bu alann yzme havuzunu kaplad dnlebilir. Soru 8: nsan diploid genomunu oluturan DNA molekl 6 x 109 baz ifti iermektedir. Baz ifti saysn kilobaz (kb) olarak hesaplaynz. Cevap: 1 kb = 103 baz olacana gre DNA= 6 x 109 / 103 = 6 x 109 x 10-3 = 6 x 106 kb Soru 9: 90 mg/dL glukoz deerini, bilimsel sistem olarak kullanlan stl saylar yardm ile SIdeki karl olan mmol/Lye eviriniz.[MW (molekl arl) =180 g/mol] Cevap: 90 mg/dl=900 mg/L 180 g/mol=180000mg/mol mol/L= (900 mg/L) / (180000 mg/mol)= (9 x 102 x 10-4) / 18 = 0.09 / 18 = 0.005 mol/L=5mmol/L

Soru 10: 4.5 g/dL albumin konsantrasyonunu mol/L olarak hesaplaynz. (MW=65000 g/mol) Cevap: 4.5 g/dL = 45 g / L = 45 / 65000=0.000692 mol/L 0.000692 mol/L x 106 = 692 mol / L Soru 11: 5000 g etanol iinde 5 mg metanol zndne gre metanol konsantrasyonunu ppm olarak hesaplaynz. Cevap: 5 (mg) x 106 ( ) / 5 x 106 (mg) = 1 ppm Soru 12: Ara srcs olarak trafik kazasna karan kiinin kazadan iki saat sonra Devlet Hastanesi acil servisinde yaplan alkol lm sonucu 250 mg/dL alkoll olduu anlalyor. Kaza annda bu kiinin ka promil alkoll olduunu hesaplaynz. (1 promil alkol = 100 mg/dL) Cevap: Metabolizma sonucu kandaki alkol dzeyinde bireysel farkllklar olmakla beraber, bir saatte 0.12 0.18 promil, ortalama 0.15 promil azald tbben bilindiine gre; kiinin kazadan iki saat sonra 250 mg/dL=2.50 promil saptanan kan alkol dzeyinin kaza srasnda; 2.5 + ( 2 saat x 0.12 ) = 2.74 2.5 + ( 2 saat x 0.15 ) = 2.80 2.5 + ( 2 saat x 0.18) = 2.86 2.74 2.86 promil arasnda ve ortalama olarak 2.80 promil olduu kabul edilebilir.

10

KONSANTRASYON ve D LSYON HESAPLARI

Genel aklamalar
Belirli konsantrasyondaki zeltilerin laboratuar ortamnda hazrlanmasnda; yzde konsantrasyon, molarite, normalite ve dilsyon (sulandrma) hesaplarnn anlalmas nem tamaktadr. Yzde konsantrasyon olarak tanmlanan zeltilerin hazrlanmasnda; arlk veya hacim birimine ya da molekl arlna baklmakszn, arlk/arlk (w/w), arlk/hacim (w/v), hacim/hacim (v/v) olarak gerekli hesaplamalar yaplr. En sk kullanlan yzde zelti tipi; arlk/hacim (w/v) olarak adlandrlan ve birimi g/dL olan zeltilerdir. Molarite (M) rutin olarak litredeki mol says (mol/L) veya bazen mililitredeki milimol (mmol/mL) says olarak ifade edilir. Normalite (N) ise litredeki edeer (ekivalen) arlk says veya mililitredeki miliekivalen (mEq/mL) arlk saysdr. Edeer arlk, molekl arlnn (g/mol), etki deerine blnmesiyle hesaplanr. Etki deeri asitlerde ortama verilen hidrojen iyonu (H+) saysna, bazlarda ise hidroksil (OH-) saysna eittir. Redoks reaksiyonlarnda alnp verilen elektron says etki deerliliini belirler. Normalite genellikle asitlerle ve bazlarla ilgili hesaplamalarda kullanlmaktadr. Baz bileiklerin edeer arl, kendi molekl arlna, ya da baka bir kimyasal maddenin edeer arlna eit olabilir. Dilsyon; konsantre veya stok haldeki maddenin zeltinin toplam son hacmine orann gsterir. Dilsyonlarda konsantrasyon birimi deimeden kalr. Stok zeltinin, toplam zelti hacmine oranna dilsyon faktr ad verilir. Dilsyon faktr ile konsantrasyon arasnda ters bir iliki vardr. Dilsyon faktr arttka konsantrasyon azalr. Dilsyon faktrn hesaplamak iin; ihtiya duyulan zelti konsantrasyonunu stok zeltinin konsantrasyonuna blmek yeterlidir. Birbirini takip eden seri dilsyonlarla konsantre bir zeltiden, daha seyreltik zeltiler elde etmek mmkndr. Standart erinin oluturulmasnda kullanlan zeltiler hazrlanrken, pediatrik hasta serumu gibi rnein az olduu durumlarda, ya da konsantrasyonu yksek olan bir parametrenin yol at Beer kanunundaki lineeriteden sapmaya bal olarak seri dilsyona bavurulabilir. Seri dilsyon ilk olarak basit dilsyonla balar. Takip eden dilsyonlar bir nceki dilsyondan gerekletirilir. En son yaplan dilsyonla elde edilen zeltinin dilsyon faktr, ncekilerin dilsyon faktrlerinin arpmna eittir.

Sorular ve cevaplar
Soru 1: 1000 mL %10 (w/v)luk NaOH hazrlamak iin ne kadar NaOH gereklidir? Cevap: 10 / 100 = x / 1000 x=100 g 100 g NaOH tartlr son hacim 1000 mLye tamamlanr. Soru 2: Bir mol kristal suyu ieren CuSO4 tan % 10luk 100 mLlik bir zelti hazrlayabilmek iin ne kadar CuSO4 . 1H20 tartmalyz. MW (Molekl arl)= CuSO4 . 1H20= 178 g Cevap: CuSO4 = 178 -18 = 160 g % 10 CuSO4 = 178 g x 10 / 160 =11.13 gr CuSO4 . 1H20 tartlr, 100 mLye tamamlanr. Soru 3: Molekl arl 135000 g/mol olan proteinin, 2 x 10-4 mol/L lik zeltisinin mililitrede ka miligram protein ierdiini hesaplaynz.

11

Cevap: 2 x 10-4 mol/L x 135000 g / mol = 27 g =27000 mg mLdeki protein miktar= l mL x 27000 mg / 1000 mL =27 mg/mL Soru 4: Molekl arl 167000 olan proteinin, 2 mg/mLlik zeltisinin molaritesini hesaplaynz. Cevap: Ldeki protein miktar = 1000 mL x 2 mg / 1 mL = 2000 mg =2 g M= 2 g x 1 mol / 167000 = 1.2 x 10-5 M Soru 5: Enzim reaksiyonu 10 mL hacim ierisinde gerekletirildikten sonra, reaksiyonu durdurmak iin son konsantrasyon 10 mM olacak ekilde kalsiyum klorr (CaCl2 . 6H20) ilave ediliyor. Kalsiyum klorrn kristal suyu ile birlikte arl 219.08 g/mol olduuna gre, ka miligram kalsiyum klorr hidrat tartmak gerektiini hesaplaynz. Cevap: 219.08 g/mol = 219080 mg/mol (10 mM x 219080 mg/mol) / 1000 mM =2190. 80 mg 1 L=1000 mL 10 mL(10mM)=(10 mL x 2190.80 mg) / 1000 mL = 21.91 mg Soru 6: 50 mL 20 mM NaOH zeltisi nasl hazrlanr? MW (NaOH)= 40 g/mol Cevap: M1 x V1 = M2 x V2 20 mM x 50 mL = 1000 mM x V2 V2= 1 mL alnr, 50 mLye distile su ile tamamlanr. ya da NaOH (g) = 40 g/mol x 20 mM / 1000 mM = 0.8 g NaOH (1000 mL iin) = 0.04 g NaOH (50 mL iin) Soru 7: zgl arl 1.19 g/mL olan %38lik deriik HClin normalitesi nedir? MW (HCl) =36.5 g/mol Cevap: zgl arlk x % = g/mL 1.19 x 0.38=0.452 g/mL = 452 g/L 36.5 g HCl / L = 1 N 452 g/L / 36.5 g/Ekivalent arlk = 12.4 N Soru 8: 24.5 g H2SO4 kullanarak bir litre zelti hazrlandnda zeltinin molarite ve normalitesi ne olur? MW (H2SO4)=98 g/mol Cevap: 1 mol / 98 g = x / 24.5 g x =0.25 mol/L=0.25 M Etki deerlilii=Molekl arl / Deerlilik Normalite=Molarite x Etki deerlilii Sulu zeltilerinde bir mol slfirik asit ortama 2 mol hidrojen iyonu verdiinden, slfirik asidin etki deerlilii ikidir. 0.25 M x (98 / 2)= 0.25 x 49 =0.5 N Soru 9: 3000 mEq/L konsantrasyonundaki sodyum stok zeltisinden, 100 mEq/Llik sodyum zeltisi hazrlamak iin dilsyon faktrn hesaplaynz.

12

Cevap: 100 / 3000 = 1 / 30 Sodyum stok zeltisinden 1 mL alnr 30 mLye tamamlanr. Soru 10:1:20 orannda sulandrlm 10 M NaOH, 1:5 orannda sulandrlm 2 M HClin konsantrasyonlarn hesaplaynz. Cevap: NaOH= l mL x 10 M / 1000 mL = 0.01 mol/mL =1000 mL x 0.01 mol/mL / 20 mL = 10 / 20 = 0.5 M HCl = 1 mL x 2 M / 1000 mL = 0.002 mol/mL = 1000 mL x 0.002 mol/mL / 5 mL = 2 / 5 = 0.4 M Soru 11: 1000 mg/mLlik glukoz zeltisi nce 1:10 daha sonra 1:2 orannda sulandrlyor. Dilusyonlar sonucu elde edilen rnekteki glukoz konsantrasyonunu mg/dL olarak hesaplaynz. Cevap: Glukoz = 1mL x 1000 mg / 1000 mL = 1 mg/mL Toplam dilsyon= ilk dilsyon x ikinci dilsyon =1:10 x 1:2 =1:20 1000mL x 1 mg / 20 mL= 50 mg/L 5 mg /dL Soru 12: 200 g/L lik hemoglobin standartndan, 150 g/L, 100 g/L, 50 g/L konsantrasyonlarnda, 6 mL hacmindeki zeltileri hazrlamak iin kaar mL standart alnmal ve ne kadar dilent eklenmelidir? Cevap: C1 x V1 = C2 x V2 lk konsantrasyon x lk hacim = stenen konsantrasyon x stenen hacim 200 g/L x V1 = 150 g/L x 6 mL V1 = 4.5 mL 1.5 mL dilent eklenmeli. 200 g/L x V1 = 100 g/L x 6 mL V1 = 3 mL 3 mL dilent eklenmeli 200 g/L x V1 = 50 g/L x 6 mL V1 = 1.5 mL 4.5 mL dilent eklenmeli Soru 13: 1.5 mL %0.5lik SDS zeltisi hazrlayabilmek iin ka mikrolitre (L) %20lik SDS zeltisine ihtiya vardr? Cevap: C1 x V1 = C2 x V2 lk konsantrasyon x lk hacim = stenen konsantrasyon x stenen hacim 0.005 x 1.5 mL = 0.20 x V2 V2 = 0.0375 mL=37.5 L 37.5 L %0.5lik SDSden alnarak 1.5 mLye tamamlanr. Soru 14: Be tpten oluan ve birbirini takip eden aadaki dilsyon sisteminde birinci ve nc tplerde ka kat sulandrma yapldn hesaplaynz. Birden bee kadar olan tplere 0.5er mL dilent konur. Birinci tpe 0.5 mL hasta serumu konulduktan sonra; birinci tpten ikinciye, ikinciden ncye, nc tpten drdnc tpe ve son olarak drdnc tpten beinci tpe 0.5 mL rnek aktarlr. En son olarak 5. tpteki 0.5 mLlik hacimdeki rnek dar atlr. Cevap: 1 / Sulandrma katsays (X) = Transfer edilen hacim / Toplam hacim 1 / X = 0.5 / 1 ( ler,dlar arpm yaplr) 0.5X = 1.0 X = 2 Birinci tpteki sulandrma oran 1/ 2 bulunur. nc tpteki sulandrma oran = 1/2 x 1/2 x 1/2= 1/8

13

P PETLER
Genel aklamalar
Pipetler belli hacimdeki svlar transfer etmeye yarayan cam ya da plastikten yaplm laboratuar gereleridir. Gnmzde pek ok laboratuarda bu tr pipetlerin yerini otomatik pipetler almaya balamtr. To contain (TC) pipetler belirli hacimdeki svy tamamen iinde tuttuu halde, tutulan hacimdeki svy btnyle dar vermez. Pipet ieriini tamamen dar verebilmek iin flemek gerekir. Daha ok viskozitesi yksek svlar ekmek iin kullanlr. To deliver (TD) pipetler ise zerinde iaretli olan hacmi pipetlemeyle flemeye gerek duyulmadan tam olarak darya brakr. Dk viskoziteli svlar iin kullanlr. Pipetlerin snflandrlmas Tablo 3.1de verilmitir. yi kaliteli cam pipetler genel olarak borosilikat camdan yaplr. Borosilikat camlar sert, inko gibi ar metalleri iermeyen, s okuna ve alkali korozyona direnli camlardr. Pek ok kez kullanlabilirler. Kalibrasyon bilgisi cam zerine yaklmak suretiyle yazlmtr. Bu yzden srekli ykansalar dahi zerlerindeki kalibrasyon bilgisi okunabilirlik zelliini yitirmez. Ancak krk ya da atlak olduunda kullanlmalar gvenli deildir. Mikropipetler biyokimya laboratuvarlarnda geni bir kullanm alanna sahiptir. Tek hacimli olan bu TC pipetlerle, 1 L kadar kk hacimleri ekerek kullanmak mmkndr. Mikropipetlerde yzeyin hacme orannn ok yksek olmas nedeniyle pipet ieriinin boaltlmas srasnda nemli bir miktar sv cam yzeylerde asl kalr. Total hacmi doru bir ekilde dar verebilmek iin pipeti birka kez ekilecek svyla durulamak gerekir. Daha sonra ekilen hacim tam olarak dar pipetlenebilir. Mikropipetlerin yerini gnmzde yar otomatik mikropipetler almtr. TD tipinde olan bu pipetlerin kapasitesi 1-1000 L arasnda deiebilmektedir. Baz modelleri sabit hacimliyken, dierlerinin hacmi ayarlanabilir zelliktedir. Bir piston yardmyla ekme ve brakma ilemi gerekletirilir. Kullanlp atlabilir zellikteki silikon kapl plastik ularn d ve i yzeyi ekilen hacmi brakma srasnda sv tutmama zelliindedir. Tablo 3.1: Pipetlerin snflandrlmas I. Tip A. To contain (TC) B. To deliver (TD) II. Tip (Drenaj zelliklerine gre) A. flemeli B. Kendiliinden akan III. Tip A. ll veya dereceli 1.Serolojik 2.Mohr 3.Bakteriyolojik 4.Ball,Kolmer veya Kahn 5.Mikropipet B. Transfer 1.Volumetrik 2.Ostwald-Folin 3.Pasteur pipetleri 4.Otomatik makro veya mikropipetler

14

Gravimetrik pipet kalibrasyonu

Cam pipetlerin retim aamasndan sonra laboratuarda yeniden kalibrasyonu genellikle gerekli olmad halde, otomatik pipetlerin belirli zaman aralklarnda gravimetrik olarak kalibrasyonu analiz sonularnn gvenilirlii bakmndan nem tar. Gravimetrik yntem en ok tercih edilen pipet kalibrasyon yntemidir. Gravimetrik pipet kalibrasyonu zaman alc bir ilem olduundan, pipetlerin gnlk olarak kalibrasyonu pratik deildir. Otomatik pipetler iin ylda drt kez kalibrasyon yaplmas nerilmektedir. Gerekli Materyaller Otomatik pipet. 10-20 adet pipet ucu Pipetlenen hacimsel arln SD=0,1i kadar hassas ve doru lm yapabilen terazi. Tartlacak svy ierisinde tutabilecek byklkte tartm kab. Deiyonize/Distile su Termometre ve barometre lemler

1. Kabn arl (Wv) ve suyun scakl (t) llerek kaydedilir. Btn materyallerin oda scaklnda olmasna dikkat edilir. Hava basnc barometreden okunarak kaydedilir. 2. Kalibrasyonu yaplacak pipetle belirli bir miktar deiyonize su ekilir. Dikkatlice pipet ucunun d ksm silinir. Bu srada yanl kalibrasyona neden olmamak iin pipet ucuna dememeye dikkat edilmelidir. 3. Deiyonize su daha nceden arl saptanm olan kap iine pipetlenir. 4. inde su bulunan cam kabn arl hassas terazide tartlarak kaydedilir (Wf). 5. 4. Basamaktan elde edilen arlktan, 1. Basamaktan elde edilen arlk kartlr. Sonu kaydedilir. 6. Eer plastik pipet ucu kullanlyorsa her pipetlemede pipet ucu deitirilmelidir.1-4. basamaklar en az dokuz kez tekrarlanmaldr. 7. Suyun ortalama arl hesaplanr. Hesaplanan ortalama arlk, scaklk ve basnca bal olarak Handbook of Chemistry and Physicsden bulunan dzeltme faktr (Ft) ile arplr. 8. Pipetin doruluu, dier deyile pipetin beklenen hacmi veya pipetleme yetenei (aktel kapasitesi) aadaki formlden hesaplanr.
(Wf Wv) x (Ft)= Aktel kapasite (mL) lmler sonucunda elde edilen veri (n) says arttka pipet kalibrasyonunun istatistiksel geerlilii artar. Kk yzde sapma deerlerinde kesinlik (precision) daha kuvvetlidir. %Sapma =[(Beklenen kapasite Aktel kapasite) / (Beklenen kapasite)] x 100

15

Spektrofotometrik yntemle pipet kalibrasyonu

Kalibrasyon geerliliinin denetlenmesinde en ok kullanla yntem gravimetrik pipet kalibrasyonu olmasna ramen, otomatik pipetlerin kalibrasyonu iin fotometrik yntemden de yararlanlabilir. Potasyum bikromat gibi molar ekstinksiyon katsays ve konsantrasyonu bilinen bir bileiin, test edilecek pipetle dilsyonu ile meydana gelecek absorbans ve konsantrasyon deiiminden hesaplanan aktel konsantrasyonla, beklenen konsantrasyon arasndaki ilikiden yararlanlarak pipetin kalibrasyon geerlilii kontrol edilir. Tablo 3.2: Scaklk ile suyun younluu arasndaki iliki
o

Younluk 0.9982 0.9980 0.9978 0.9976 0.9973 0.9971 0.9968 0.9965 0.9963 0.9960 0.9957

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Sorular ve cevaplar
Soru 1: 10 mLlik cam pipetin kalibrasyonu ile ilgili veriler aada verilmitir. Pipetin beklenen hacimden ne oranda saptn hesaplaynz. Bu sapma kabul edilebilir limitler iinde midir? Wf = 31.9961 g Wv = 22.0391 g t= 24 oC Ft=1.003771 (Tablodan) Cevap: (Wf Wv) x (Ft)= Aktel kapasite (mL) (31.9961 -22.0391) x (1.003771)=9.9945 mL
16

%Sapma = [(Beklenen kapasite Aktel kapasite) / (Beklenen kapasite)] x 100 %Sapma=[(10-9.9945) / (10)] x 100 = %0.055 Rutin analizlerde % 0.1den kk sapmalar veya hatalar dikkate alnmaz. % 0.1in stndeki sapmalar iin dzeltme deeri dikkate alnmaldr. Soru 2: 1 mLlik otomatik pipete ait n=9 lm sonucunda elde edilen ortalama aktel kapasite 0.886 mLdir. a) Standart kapasiteden % sapma ne kadardr? Bu sapma kabul edilebilir limitler iinde midir? b) Otomatik pipet 500 Lye ayarlandnda pipetle ekilen zelti hacmi minimum ve maksimum hangi deerler arasnda olabilir? Cevap: a) Ortalama aktel kapasite= 0.886 mL %Sapma =(Beklenen kapasite Ortalama aktel kapasite) / (Beklenen kapasite) x 100 %Sapma=[(1-0.886) / 1] x 100 =%0.114 mL Standart kapasiteden sapma deeri > %0.1 deerinin stnde olduu iin kabul edilebilir limitler iinde deildir. b) %Sapma=0.114 mL = 114 L (1000 L hacim iin), Bu yzden 500 57 deeri elde edilir. Minimum=443 L Maksimum=557 L Soru 3: 1 mLlik otomatik pipetin kalibrasyon geerliliinin deerlendirilmesinde Tablo 3.3deki hangi standart kapasiteden % sapma deeri dikkate alnmaldr? Tablo 3.3: Pipet kalibrasyonunda lm says ve % sapma arasndaki iliki lm says (n) 9 8 10 9 12 11 7 Cevap: n=12 %Sapma=0.058 Soru 4: Cam pipetle 25 oCde ekilen 10 mL deiyonize suyun arl ne kadardr? Cevap: Tablo 3.2den 25 oC scaklkta, d=0.9971 g//mL olarak verildiine gre; 10 mL deiyonize suyun arl 9.971 g olarak hesaplanr. % Sapma 0.053 0.050 0.053 0.051 0.058 0.057 0.051

17

Soru 5: 10 Llik otomatik pipetin spektrofotometrik kalibrasyonu iin 0.01 mol/Llik NaOHten 2.5 mL, 105 mg/dLlik p-nitrofenolden ise 10 L kullanlyor. Farkl volumetrik pipetler kullanlarak referans dilsyonlar, kalibrasyonlu pipet kullanlarak da test dilsyonlar gerekletiriliyor. Referans dilsyonlarn 401 nm dalga boyundaki ortalama absorbans A1=0.550, test dilsyonlarnn ortalama absorbans ise A2= 0.561 hesaplanyor. Test solsyonunun dilsyon oran D= 1/251 son hacmi V=2510 L olduuna gre, aktel olarak pipetlenen hacim nedir. Pipetlenen hacim analitik olarak kabul edilebilir snrlar iindemidir? Cevap: Pipetlenen hacim (L) = A2 / A1 x D x V =0.561 / 0.550 x 1/251 x 2510 =10.20 L Hata oran (%) = (100 x 0.20) / 10 = %2 Pipetin nominal kapasitesi 10 L olduuna gre, hata % 2 oranndadr. retici firmalar tarafndan, pipetler iin kabul edilen hata snr genellikle nominal deerin %1inden kktr. Bu nedenle hata oran kabul edilebilir snrn zerindedir.

18

SANTR FJ
Genel prensipleri
Santrifjleme; kat materyali santrifjleme kuvveti kullanarak sv haldeki sspansiyondan ayrma ilemidir. Santrifjle ayrma teknikleri; ayrlacak paracklarn, uygulanan santrifj kuvvetine kar gsterdikleri fiziksel davranlara baldr. Ayrlmas istenilen paracklar oluturan molekllerin greceli (rlatif) arlklar, ekli ve younluu, bu taneciklerin santrifj kuvvetine kar gsterdikleri fiziksel davranlar etkiler. Santrifjle ayrma tekniinin temeli; sspansiyon halindeki paracklar yerekimi ivmesinden (g=9.81 m/sn2) daha byk bir kuvvetle ve hzla ayrma esasna dayanr. Parack tanm; ortamda znm veya sspansiyon halinde bulunan, mikroskobik ya da makroskopik boyuttaki zc veya sspansiyon svs dndaki oluumlar kapsad iin olduka geni kapsamldr. Biyokimyada santrifjleme ile ayrlan ve zerinde allan paracklar genel olarak hcreler, organeller, DNA ya da proteinler gibi byk molekllerdir. Santrifj kuvveti ktle, hz ve yarap olmak zere deikene baldr. Dakikadaki dnme says [revolutions per minute (rpm)], oluan santrifj kuvveti ise greceli santrifj kuvveti [relative centrifugal force (RCF) veya gravite (g)] olarak ifade edilmektedir. RCF ve santrifj hz arasndaki iliki aadaki eitlikte verilmitir. RCF = 1.118 x 10-5 x r x (rpm)2 Eitlikteki 1.118 x 10-5 asal hzdan hesaplanan bir sabit, r ise cm olarak santrifj ekseninden test tpnn yerletii blmn tp dibiyle temas ettii noktaya kadar llen mesafedir. RCF deerini ayrca nomogram yardmyla da hesaplamak mmkndr (ekil 4.1). Santrifjler set st veya zemin st olmasna, soutmal olup olmamasna, ya da rotor bann zelliine [hareketli-koval (ekil 4.2), sabit al (ekil 4.3), vertikal rotorlu (ekil 4.4)] gre snflandrlrlar. Santrifjn hz kalite kontrol amacyla takometre kullanlarak kontrol edilebilir.

Rotor tipleri
Hareketli-koval rotorlar rnek tp, tp tayc kovalardan birinin iine yerletirilir. Rotorun hzlanmasyla birlikte kova yer ekimi etkisiyle durduu dikey pozisyondan, santrifj kuvveti ynnde yatay pozisyona geer. Geni al bu rotorlarda, kme yolu tpn uzunluuna eittir. Santrifjleme srasnda paracklar ilk olarak tp eperi etkisiyle tm eperlerde birikmeye, daha sonra da birlikte dibe hareket ederek kelti oluumuna neden olur. Hareketli-koval rotorlar uzun sedimentasyon yolu nedeniyle, kelti elde etmek iin ok uygun deildir. Sabit al rotorlar rnek tpleri iinde boluk bulunmayan rotor iindeki tp yuvalarna yerletirilir. Tplerin as, yerletirme, santrifjleme ve boaltma aamalarnda deimeden kalr. Santrifj kuvvetinin artmasyla birlikte, tpn iindeki zelti yer deitirir. Belirli hacimdeki rnek iin sabit al rotorlardaki kme yolu, hareketli-koval rotorlara gre daha ksadr. Paracklar yanal tp eperine hareketli-koval rotorlara gre daha hzl ulap, eperlerden kayarak kelti oluumuna neden olur. Sabit al rotorlar kelti elde etmek iin avantajldr. Bu yzden hcre fraksiyonlarn elde etmeye ynelik olarak, diferansiyel santrifjleme ile DNA ve RNA eldesi iin gerekletirilen izopiknik santrifjleme ileminde tercih edilir. Rotor asnn dar olmas

19

nedeniyle sedimentasyon yolu ksadr. Sedimentasyon yolunun ksal kelti eldesindeki etkinlii artrr. Sabit al rotorlarn as 14o ile 40o arasnda deimektedir. Vertikal rotorlar Vertikal rotorlarda tpler santrifjleme srasnda dikey pozisyonunu korur. Santrifj kuvvetinin etkisiyle sv g kuvveti ynnde hareket eder. Bu rotorlarda evrilecek olan tplerin kapa kuvvetli hidrostatik basnca kar koyabilecek zellikte olmaldr. Ad geen bu tip rotor iinde sedimentasyon yolu en ksa olandr. Minimum yarap ve g kuvveti ile dk rotor hzlarnda hzl ayrma salanr. zopiknik santrifjleme iin en uygun olan rotor tipidir. kelti eldesi ile ilgili tekniklerde kullanlmas nerilmemektedir.

ekil 4.1. Greceli santrifj kuvvetini (RCF) hesaplamakta kullanlan nomogram

20

ekil 4.2. Boyuna kesitte hareketli-koval rotorun grnm

21

ekil 4.3. Boyuna kesitte sabit al rotorun grnm

22

ekil 4. 4. Boyuna kesitte vertikal rotorun grnm

23

Rlatif (greceli) santrifj kuvvetinin bulunmasnda kullanlan eitliin hesaplanmas

Santrifjle ktrme ileminin etkinlii oluan santrifj kuvvetine (G) baldr. G deeri; rotorun asal hznn ( ) karesi ile paracn dnme merkezine cm olarak nsal mesafesine (r) bal olarak aada verilen eitlie gre belirlenir. G=2r (1)

Rotorun bir dn 2 radyana eit olduu iin, rotorun asal hzn radyan/sn olarak vermek mmkndr. Bu yolla rotor hzn allagelmi bir ekilde dakikadaki (60 sn) dnme hz (rpm ) olarak gsterebiliriz. = 2 rpm / 60 (2) Santrifj kuvveti (G)nin rpmden yararlanlarak hesaplanmas iin (2) numaral eitlik (1) numaral eitlikteki 2 yerine konulur ve (3) numaral eitlik elde edilir. G=4 2 rpm2 r / 3600 (3) Yer ekimi ivmesi (g=981 cm/sn2)dir. Paracn santrifj kuvveti etkisindeki arlnn, ayn paracn sadece yerekimi etkisiyle oluan arlna oranna greceli santrifj kuvveti (RCF) ad verilmektedir. RCF= F santrifjleme / F gravite = m.G / m.g = G / g = 2r / g (4) (2) numaral eitlik (4) numaral eitlikte yerine konularak alttaki eitlik elde edilir. RCF= 4 2 rpm2 r / 3600 x 981 (5) (5) numaral eitlik aada olduu gibi ksaltlarak son halini alr. RCF = 1.118 x 10-5 x r x (rpm)2 (6)

Alternatif rotorun rpm ve sedimentasyon sresinin hesaplanmas

Paracklar ktrmek iin gerekli sre; rotorun hzna, yarapna ve ken paracn kat ettii mesafeye, yani tpteki svnn derinliine baldr. Santrifjlemede orijinal koullarn salanmas arzu edilirse de, bu durum her zaman mmkn olmaz. RCF deeri bilinen orijinal rotordan, yarap bilinen alternatif rotorun rpm deerinin bulunmas aadaki eitliin hesaplanmas ile gerekleir. __________________________________________ rpm (alternatif rotor)= 1000 x RCF (orijinal rotor) / 11.18 x r (cm) alternatif rotor Santrifj sresi ve RCF deeri bilinen orijinal rotordan yararlanarak, alternatif rotorun RCF deerini kullanarak, alternatif rotor iin gerekli sedimentasyon sresi hesaplanabilir. zaman (alternatif rotor)= zaman x RCF (orijinal rotor) / RCF (alternatif rotor)

24

Berraklatrma faktrnn (k) hesaplanmas

kelti oluturma kapasitesi berraklatrma faktr (k) deeri ile ilikilidir. Kk (k) deerlerinde daha etkin bir ekilde ayrma, ya da kelti oluturma ilemi meydana gelir. (k) deeri aadaki (1) numaral eitlikte tanmlanmtr. k= (t) (s) 1013 (1) (t) deeri saat olarak zaman, (s) ise sedimentasyon katsaysn gstermektedir. s= ln (rmax / r min) / 2 (t2 t1) (2) (2) numaral eitlikte, () radyan / sn olarak asal hz, rmax ve rmin arasndaki fark sedimentasyon mesafesini belirler. Mesafe ksaldka, (k) deeri klr. Daha kullanl bir eitlik (3) elde etmek iin asal hzn yerine rpm konulur, bu durumda doal olarak zaman birimi dakikadr. k=2.53 x 1011 ln (rmax / r min) / rpm2 (3) Verilen (k) deeri rotora zg bir deerdir ve 20 oCdeki saf suda paracn ulaabilecei maksimum hz gsterir. Ortamn viskozitesi ve suyun younluu arttka, (k) deeri doru orantl olarak artar. Dk hzlardaki kaktel deeri aadaki eitlik yardmyla hesaplanabilir. kaktel = k (rpmmax / rpm)2 (4)

Sorular ve cevaplar
Soru 1: Sabit-al rotora sahip bir santrifjde santrifjleme ilemi gerekletiriliyor. Santrifj tpnn st ksmndaki minimum yarap (rmin=4.8 cm), alt ksmndaki maksimum yarap ise (rmax=9 cm) olarak llmtr. Rotor dakikada 12000 kez dndne gre tpn alt ve st ksmndaki greceli santrifj kuvvetini hesaplaynz. Cevap: RCF = 1.118 x 10-5 x r x (rpm)2 RCFst= 1.118 x 10-5 x 4.8 x (12000)2 RCFst = 7728 g RCFdip=1.118 x 10-5 x 9 x (12000)2 RCFdip = 14489 g Hesaplamalardan grld gibi tpn alt ve st ksmlarndaki RCF deerleri arasnda yaklak iki kat fark bulunmaktadr. Soru 2: Ultrasantrifj 58000 rpmde altrlyor. a) Radyan/sn olarak asal hzn ve merkezden 6.2 cm uzaktaki santrifj kuvvetini hesaplaynz. b) Bu santrifj kuvveti ka yerekimi ivmesine edeerdir? Yerekimi ivmesi (g)=980 cm/sn2

25

Cevap: a) = 2 rpm / 60 = 2 x 3.14 x 58000 / 60 = 6070.7 radyan/sn G= 2r =(6070.7)2 x 6.2 = 2.285 x 108 cm/sn2 b) RCF= G / g = 2.285 x 108 cm/sn2 / 980 cm/sn2 = 233163 g Soru 3: skelet kas homojenatndaki spesifik bir yapsal protein, sabit al rotor kullanlarak 7500 RCF deerinde, yaklak 43 dakikada ayrlyor. Yarap 9 cm olan sabit al alternatif rotor kullanldnda ayn protein ka rpmde ayrlr? Cevap: _________________________________________ rpm (alternatif rotor)= 1000 x RCF (orijinal rotor) / 11.18 x r (cm, alternatif rotor) _______________ ___________ rpm (alternatif rotor)=1000 x 7500 / 11.18 x 9 = 1000 x 7500 / 100.62 =8633 rpm Soru 4: Sabit al titanyum rotor maksimum 52000 rpmde dnebilme zelliine sahiptir. Rotorun rmax =10.8 cm, rmin=3.2 cm olduuna gre k (berraklatrma) deerini hesaplaynz. Elde edilen k deerini aada verilen tablodaki deerlerle karlatrarak doku homojenatndan elde edilen znr zellikteki proteinin ayrlabilmesi iin en uygun rotoru seiniz. Tablo 4.1: Ultra hzl rotorlarn k deeri ve total kapasitesi Rotor Tipi Hareketli-koval Hareketli-koval Hareketli-koval Sabit al (18o) Sabit al (14o) Sabit al (29o) Vertikal Vertikal Vertikal RCFmax (g) 90300 285000 484200 59200 94500 511000 70000 240600 510000 RCFmin (g) 39300 119000 254000 29600 63300 220800 50400 173400 416600 Toplam kapasite (mL) 102 84 26.4 940 210 112 312 280 40.8 k 338 137 45 398 113 38 123 34 8

Cevap: a) k=2.53 x 1011 ln (rmax / r min) / rpm2 k=2.53 x 1011 ln (10.8 / 3.2) / (52000)2 k= 2.53 x 1011 x ln 3.375 / (5.2 x 104)2 k= 2.53 x 1011 x 1.216 / 27.04 x 108 k=2.53 x 103 x 1.216 / 27.04 k=3077 / 27.04 =114 b) k=8 olan vertikal rotor Soru 5: Bir aratrma makalesindeki ynteme gre; 4 saat santrifjleme sresi iinde, maksimum hzda, k= 225 olan sabit al bir rotor (Rotor A) kullanlarak kelti oluturulabilmektedir. Daha ksa srede, maksimum hzda, k=63 olan farkl bir sabit al rotor (Rotor B) kullanarak ayn materyalden kelti elde edilmesi amalanmaktadr. kelti oluturmak iin gerekli olan sreyi hesaplaynz.

26

Cevap: trotor B = (63 x 4) / 225 = 1.12 saat Soru 6: Greceli santrifj kuvvetini hesaplamakta kullanlan nomogram (ekil 4.1) yardm ile r=10 cm, 1000 g deerlerine karlk gelen rpm deerini bulunuz. Cevap: RCF=1000 g 3000 rpm

27

ELEKTROMANYET K RADYASYON, SPEKTROFOTOMETR ve SPEKTROFLOROMETR

Elektromanyetik radyasyon
Spektrofotometrik lmler elektromanyetik radyasyon geirgenliinin dedektr tarafndan llmesi prensibine dayand iin, elektromanyetik radyasyonun ana zelliklerinin anlalmas nem tamaktadr. Ik elektromanyetik radyasyonun grnen ksmdr. Elektromanyetik radyasyon birbirine dik iki yatay dzlemde salnm gsteren elektriksel ve manyetik alanlardan oluur. Ik ve elektromanyetik radyasyon spektrumunun dier ksm sinsoidal dalga hareketi gsteren, foton ad verilen enerji paketlerinden meydana gelmitir. Elektromanyetik spektrumda birbirini takip eden sinsoidal dalga pikleri arasndaki mesafe dalga boyudur ().Dalga boyu uluslararas sistemde nanometre ile llr (10-9 m). Saniyedeki dalga saysna ise frekans () ad verilmektedir. Frekans, k hz (c) / dalga boyu () deerine eittir. Dalga boyu ile enerji arasnda ters bir iliki bulunmaktadr. Uzun dalga boyunda az sayda foton bulunduundan enerji, ksa dalga boyuna gre daha dktr. Bir dier ifadeyle yksek frekanstaki n fotonlarda yksek enerjilidir. Bu iliki Planck sabiti (h=6.62 x10-34Js-1)nin yer ald aadaki eitlikte grlmektedir. E=h = h c/

ekil 5.1. Elektromanyetik dalga

28

Molekler orbital teorisi ve elektromanyetik radyasyonun molekl ile etkileimi

ki atom arasnda kimyasal ba olutuunda, atomlardan her biri ba oluumuna katlr ve ba elektronlar molekler orbital ad verilen yeni bir orbitalde yerini alr. Ba oluturan iki atomun iki atomik orbitali birleerek dk enerjili bir bonding molekler orbital ve ayn zamanda bir de yksek enerjili antibonding molekler orbital meydana getirir. Sigma ( ) ba ilk oluan molekler badr, iki s orbitali arasnda veya s orbitali ile px orbitali arasnda meydana gelir. Antiparalel konumdadr. Pi () ba, birbirine paralel iki orbitali arasnda meydana gelir. Molekler orbital teorisine gre her bonding ve orbitaline srasyla birer antibonding * ve * orbitali elik eder. Kimyasal ba oluumuna katlmayan deerlilik elektronlar nonbonding ya da n elektronlar olarak adlandrlr. Molekler orbitallerdeki elektron bulutlarnn dalm ekil 5.2de grlmektedir. Organik molekllerde n elektronlar azot, oksijen, kkrt ve halojenlerin atomik orbitallerinde yer alr. Elektromanyetik radyasyon madde iinden geerken eitli deiimlere neden olur. Madde tarafndan absorplanan foton, moleklde elektron geilerine, titreimlere ve dnme hareketlerine neden olur. Absorpsiyona bal olarak uyarlm atom veya molekllerin elektronlar hzla temel enerji dzeylerine dnerlerken, absorpladklar enerjinin bir ksmn elektromanyetik radyasyon veya s eklinde ortama salverirler. Organik molekllerdeki elektron geileri; elektromanyetik spektrumun grnr k veya ultraviyole blgesindeki radyasyonun molekllerdeki , ve n orbitallerinin elektronlar tarafndan absorpsiyonu sonucunda, elektronlarn yksek enerjili antibonding orbitallere (*, * n*) gemesiyle meydana gelir. Molekler orbitallerin enerji dzeyleri ekil 5.3de grlmektedir. Molekllerdeki atomlar srekli titreim halinde olduklarndan molekller statik yaplar deillerdir. Titreim frekans molekldeki atomlarn saysna ve bu atomlar birbirine balayan balarn gerginliine baldr. Baz molekler titreimler btn bir molekl iin parmak izi gibi tanmlayc bir zellik tarlarken, dier titreimler belli bir fonksiyonel gruba zgdr. Krmz tesi ve mikrodalga radyasyonu ise, molekllerin dnme enerjilerini deitirerek etkisini gsterir.

ekil 5.2. Bonding ve antibonding molekler orbitaller

29

ekil 5.3. Elektronik molekler orbitallerin enerji seviyeleri

Spektrofotometri
Lambert-Beer eitlii; k iddeti, konsantrasyon ve k yolunun uzunluu arasndaki matematiksel ilikiyi aklar. Eitlikteki Io ve I srasyla kvete giren ve kvetten kan n iddetini, T ise k geirgenlii olan transmitans ifade etmektedir. A =log (Io/I)= (1/T)= a b c (a) absorptivite ad verilen oransal bir sabittir. (b) santimetre olarak k yolunun uzunluunu, (c) ise absorbe eden maddenin konsantrasyonunu gstermektedir. In dalga boyuna ve absorbe eden maddenin zelliine bal olan absorbansn (A) birimi yoktur. Konsantrasyonun molarite olarak verildii durumda, () molar absorpsiyon katsays olarak adlandrlr ve eitlik A= b c eklinde gsterilir. Bu koulda ()nun biriminin L/mol.cm olduu eitlikten hesaplanabilir . Konsantrasyonun mg/mL, %1 olarak verildii durumda ise, (a) spesifik absorpsiyon katsays olarak adlandrlmaktadr. zeltiye gelen monokromatik n bir ksm zelti tarafndan absorbe edilir, dier ksm ise ortamdan serbeste geerek dedektr zerine der ve fotoelektrik olay sonucunda elektriksel sinyale dnr. Yzde transmitans (%T); rnekten geen n enerjisinin, rnee gelen k enerjisine orannn 100 ile arpmna eittir. Gelen n tamamnn absorbe edildii durumda %T=0, tamamnn getii durumda ise %T=100 deerine eittir. Absorbans llecek maddeyi iermeyen zc (kr, blank tpnn ierii) k yoluna yerletirilir. Bu olay sonucunda kvete gelen k byk oranda geerek dedektre ular, ksmen de zc ve kvet tarafndan absorbe edilir. Bu durumda cihazn gstergesi %100 Ta ayarlanr. I absorplayan rnei ieren kvet k yoluna yerletirilerek yeniden transmisyon llr. ki transmisyon

30

lm arasndaki fark absorbans llecek maddeden kaynaklanmaktadr. Spektrofotometrelerde rnekten kaynaklanan transmisyon deerinin, krn transmisyon deerine blnmesiyle elde edilen deer %T deerini verir (ekil 5.4).

ekil 5. 4. Yzde transmitans (% T)

Lambert-Beer kanununun hesaplanmas

Lambert-Beer eitliinin bulunmas aada aklamas yaplan bir dizi matematiksel hesaplama ile mmkn olmaktadr. -dI / I bdc veya -dI / I =kbdc

31

-dI ile gsterilen k transmisyonundaki (T) kk bir azalma, sabit bir k yolu uzunluunda hesaplanan dc konsantrasyonunda bir arta yol amaktadr. Oransal bir sabit olan k konsantrasyonu aratrlan maddenin zelliine baldr. Ik iddeti ve konsantrasyonla ilgili olarak, limitler arasnn integralinin alnmas ile ilemlere devam edilir.

c
0

-dI / I
Io

= kb
o

dc

-ln I / Io = kbc Yukardaki eitliin bandaki ( ) iaretinden eitlii, kurtarabilmek iin lnli ifadedeki pay ve payda yer deitirir ln Io/I = kbc stteki eitlikte yer alan e tabanna gre logaritma aadaki ekilde de yazlabilir 2.3 log Io/I = kbc log Io/I=k/2.3 b c log Io/I yerine A, k/2.3 yerine ise a yazlarak Lambert-Beer eitlii bulunur. A=abc

Lambert-Beer eitliinden sapmalar

Absorplayc sistemlerin ou dile zeltilerde Lambert-Beer kanununa uygunluk gsterir. Baz sistemlerde ise absorbansla konsantrasyon arasnda lineer olmayan bir iliki grlr. Bu durum Lambert-Beer kanunundan sapma olarak adlandrlr. Absorplayc maddenin yksek konsantrasyonda bulunmas absorbe edilen n krlma indeksinde deiime yol aarak Lambert-Beerden sapmaya neden olur. Bu yzden absorplayc sistemin 10-7 ile 10-2 mol/L arasndaki konsantrasyonlar genellikle absorbansla lineer bir iliki iindedir.

Dorudan spektrofotometrik yntem ile protein konsantrasyonunun belirlenmesi

Proteinlerin kromoforik amino asit ksmlar ultraviyole (UV) blgesinde absorpsiyon yaparak, spektrofotometrik yntemle dorudan protein konsantrasyonunun belirlenmesine olanak salar. 280 nm dalga boyundaki UVde absorpsiyonun llmesine dayanan bu dorudan yntem; protein yapsn bozmadan konsantrasyonun bulunmasna olanak salamakla birlikte, ok da duyarl bir yntem deildir. Yine de az miktarda rnekle alldnda tercih edilen bir yntemdir. UVde proteinlerin absorbansnn lm byk lde interferansdan etkilenir ve konsantrasyonu bulunacak olan proteinin amino asit ieriinin bilinmesine gereksinim gsterir.

32

280 nmde llen absorbansn ykseklii, proteinin triptofan ve tirozin ieriine baldr. 1 mg/mL konsantrasyonundaki farkl proteinlerin 280 nmdeki absorbanslar byk oranda farkllklar gstermektedir; Sz konusu absorbanslar sr serum albumini ovalbumin, sr immnglobulini ve yumurta ak lizozimi iin srasyla 0.63, 0.70, 1.38, 2.65 deerlerine sahiptir. Kas, beyin ve baz endokrin sistem dokularnda bulunan parvalbumin gibi aromatik amino asitleri iermeyen proteinler 280 nmde ok kk bir absorpsiyon deerine sahiptir. 260 nmdeki UV nda nkleik asitler maksimum absorbans gsterdikleri halde, 280 nm dalga boyunda da kuvvetli absorbans gsterirler. Bu nedenle homojenatlarn protein konsantrasyonu llrken, ortamdaki DNA ve RNAnn interferansa neden olmasna bal olarak, yksek protein konsantrasyonlar bulunur. Aada verilen eitlik yardmyla nkleik asitlerin absorbans kartlarak protein konsantrasyonunun hesaplanmasnda dzeltme yaplabilir. Protein konsantrasyonu (mg/mL)=(1.55 x A280) (0.76 x A260)

Spektrofotometrik yntem ile nkleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi

Spektrofotometrik yntemler,1 g/mLnin zerindeki nkleik asit konsantrasyonlarn belirlemek iin ok uygundur. 50 g / mL konsantrasyonundaki ift zincirli DNAnn 260 nmde absorbans (1)dir. Tek polinkleotid zincirli nkleik asitler ayn dalga boyunda daha yksek ekstinksiyon katsaysna sahiptirler. Tek zincirli nkleik asitlerde 260 nmde (1) deerindeki absorbans elde etmek iin 40 g / mL (ssDNA), 33 g / mL (ssRNA) konsantrasyonlarnda nkleik asit gereklidir. Bu deerler ortalama baz bileimindeki nkleik asitler iin verilen deerlerdir. Biyolojik bir kaynaktan saflatrlan nkleik asitlerdeki kontaminasyonu belirlemek iin 260nm ve 280 nm dalga boylarnda lm yaplr. Protein kontaminasyonu iermeyen DNA rneklerinde A260/A280 oran 1.8 deerine ok yakndr. Proteinlerin ve izolasyon srasnda kullanlan fenoln varlnda 1.8in altnda, RNA varlnda ise stnde bir oran elde edilir. Saf RNA rneklerinde A260/A280 oran (2)ye olduka yakndr.

Spektrofotometrik yntem ile enzim aktivitesinin belirlenmesi

Enzimler biyolojik materyalde ok dk konsantrasyonlarda bulunduklarndan aktivitelerinin llmesi tercih edilir. Enzim aktivitesinin llmesiyle ilgili metotlarda genellikle fotometrik olarak artm rn konsantrasyonu, azalm substrat veya koenzim konsantrasyonu, ya da deiime uram koenzim konsantrasyonundaki art llr. Laboratuarda enzim aktivitesinin llmesi; ortamda fazla miktarda substrat ve koenzim varlnda yani sfrnc derece kinetikte gerekleir. Bu durumda enzim tarafndan katalizlenen reaksiyonun hz dorudan enzim aktivitesine baldr. NADH, laboratuarlarda en sklkla llen koenzimdir. NADH 340 nmde maksimum absorbans yapt halde, NAD bu dalga boyunda absorbans yapmaz. Enzim aktivitesi lineer fazda (ilk 6-8 dakikalk zaman) llrken yntemde nerilen sabit scaklk ve pH deerleri salanmaldr. Spesifik koullar altnda (sabit scaklk,pH, substrat,aktivatrler) dakikada 1 mol substrat rne dntren enzim miktarna bir internasyonal nite (U) ad verilmektedir. Genellikle U/L olarak ifade edilir. Enzim aktivitesinin SIdeki karl ise kataldir. Katal saniyede bir mol substrat rne dntren enzim miktardr. 1 U = 16.7 nkatdir Biyokimyasal redoks sistemlerinde, enzimler tarafndan katalizlenen reaksiyonlar NAD+ + (NADP ) nin ve NADH (NADPH)n birbirlerine dnm ile gzlemlenebilir. 260 nm dalga boyunda her iki koenzimin de ykseltgenmi ve indirgenmi formlar absorblarken, 340 nm dalga boyunda piridin nkleotid yapsndaki bu koenzimlerin sadece indirgenmi ekilleri absorbe eder. NADHn 340 nmdeki molar ekstinksiyon katsays = 6.22 x103 mol-1 x L x cm-1 deerine sahiptir. Absorbans deiikliini internasyonal niteye evirmek iin aadaki formlden yararlanlr. U/L=mo/dk/L= A/min x Vt x 106 (mol/mol) / x Vs x l
33

A/min=Dakikadaki absorbans deiimi, Vt=Toplam reaksiyon hacmi = rnek + Reaktif + Dilent Vs=rnek hacmi = ekstinksiyon katsays

Spektroflorometri
Spektrofotometrede absorbans llecek zelti iine giren k; zeltiden dorudan geebildii gibi, kullanlan n dalga boyuna ve madde konsantrasyonuna bal olarak ksmen ya da tamamen absorbe edilebilir. In zelti tarafndan absorbsiyonu ile birlikte ortamdaki molekllere enerji transfer edilir. Foton (kuantum) enerjisinin molekldeki elektronlar tarafndan absorbsiyonu ile birlikte, moleklde titreim, dnme veya floresans gibi enerji deiimleri meydana gelir. Normal durumdaki, dier bir deyile temel enerji dzeyindeki molekllerde elektronlar zt spinlidir. Singlet durum ad da verilen zt spinli durumda elektronlar en dk vibrasyon (titreim) dzeylerinden birinde bulunur. Foton enerjisinin molekldeki elektronlar tarafndan absorpsiyonu ile birlikte elektronu daha yksek bir vibrasyonal enerji seviyelerinden birine uyarlma (eksitasyon) sonucunda srar. Uyarlm bu yksek enerjili elektron fazla enerjisini dier molekller ile arparak ya da kendi titreim ve dnme hareketleri ile dar vererek dk titreim dzeyli temel enerji dzeyine dner. Temel enerji dzeyindeki elektronu uyarabilmek iin gerekli enerji, bu enerji dzeyindeki elektronun enerjisinden daha yksektir. Uyarlm durumdaki elektron 10-9 veya 10-5 saniye iinde emisyon ad verilen bir olayla foton enerjisi salvererek temel enerji dzeyinde bulunan dk titreimli enerji dzeylerden birine dner. Bu emisyona floresans ad verilmektedir. Floresans olay ile dar verilen foton enerjisi uyarlma iin gerekli olana gre daha dktr ve dolaysyla daha uzun dalga boyunda bir n ortama salnr. ift ba ya da konjuge ift ba ieren molekller ortama floresans verme zelliindedir. Uyarlma ve emisyonun maksimum dalga boylar arasndaki farka Stokes kaymas ad verilir. Her molekl iin spesifik bir uyarlma ve emisyon dalga boyu vardr. Belirli konsantrasyondaki standartlar ve rlatif floresanslar arasnda standart bir eri izilerek, rnein vermi olduu floresanstan konsantrasyonu hesaplanabilir. Floresans zellii gsteren bileiin artan konsantrasyondaki standartlar ile floresans iddeti arasnda doru bir orant vardr. Lineerite korunduu srece tek bir standart kullanlarak rnein floresansndan konsantrasyonu aada verilen eitlikle hesaplanabilir. rnein floresans / nternal standartn floresans=rnein konsantrasyonu/ nternal standartn konsantrasyonu Floresans iddeti konsantrasyon dnda pH, scaklk, viskozite ve dier bileiklerin interferanslarndan etkilenir.

Sorular ve cevaplar:
Soru 1: 550 nm dalga boyundaki n frekansn ve bu dalga boyundaki bir fotonun enerjisini volt olarak hesaplaynz. c= 3 x 108 m/sn, h=6.62 x 10-34 J. Sn. Cevap: 1 m = 109 nm 550 nm=5.5 x 10-7 m = c / = 3 x 108 / 5.5 x 107 = 5.45 x 1014 s-1 E= h = 6.62 x 10-34 x 5.45 x 1014 = 3.62. 10-19 J/foton Bir elektronun yk=Faraday sabiti(F) / Avogadro says (N) 1.602 x 10-19 J V-1 =9.6485 x 104 J V-1 / 6.023 x 1023 foton/mol 3.62. 10-19 J/foton / 1.602 x 10-19 J V-1 = 2.260 V

34

Soru 2: 5 g/L konsantrasyonundaki absorbe etme zelliindeki, molekl arl 410 mol/g olan A maddesini ieren zelti, 2 cm k yolu uzunluundaki kvete konuluyor. Kvet spektrofotometreye yerletirildiinde dalga boyundaki n zeltiden gemesi salanyor. Spektrofotometrede okunan transmisyon deeri %80 olarak kaydediliyor. zeltinin absorbansn ve A maddesinin molar ekstinksiyon katsaysn hesaplaynz. Cevap: Transmisyon (T)=%80=100 x It / Io Io=%100 olduuna gre, It=%80 olarak ifade edilebilir It / I0=80 / 100=0.8 Absorbans=A=log (1 / T)=log(1 / 0.8)=log (1.25)=0.0969 A= x l x c = x 2 x 5 eitliinden, ekstinksiyon katsays, = 0.0969 / 10 = 9.69 x 10-3 g-1 L cm-1 olarak hesaplanr. Ekstinksiyon katsays genel olarak molar ekstinksiyon katsays olarak ifade edilir. Bu nedenle, m= x 410 =9.69 x 10-3 x 410 = 3.973 mol-1 L cm-1 olarak hesaplanabilir. Soru 3: ATP zeltisinin absorbans 1 cmlik kvette, 0,17 olarak okunuyor. ATPnin molar ekstinksiyon katsays 1.54 x 104 mol-1 x L x cm-1 olduuna gre, ATP zeltisinin konsantrasyonunu, 1 cmlik kvetten geen n transmisyonunu, ve 4 cmlik kvetteki 2.5 x 102 mMlk zeltinin absorbansn hesaplaynz. Cevap: Lambert-Beer kanunundan yararlanlarak konsantrasyon hesaplanabilir. A= log (I0 / It)= x c x l 0.17 = 1.54 x 104 x c x 1 c=[ATP]= 0.17 / 1.54 x 104 x 1 = 1.104 x 10-5 mol /L A= log (I0 / It)= log (1/T) 0.17 = log (1/T) 1/T=antilog (0.17)=1.4791 T=0.676 veya %67.6 Verilen konsantrasyonu mol/Lye (M) evirmemiz gerekir. 2.5 x 10-2 mM = 2.5 x 10-5 M A= 1.54 x 104 (mol-1 x L x cm-1) x 2.5 x 10-5 (mol/L) x 4 (cm) = 1.54 Birimler birbirini gtrdnden absorbansn biriminin olmad grlmektedir. Soru 4: Biyokimyasal redoks sistemlerinde, enzimler tarafndan katalizlenen reaksiyonlar NAD+ (NADP+)nin ve NADH (NADPH)n birbirlerine dnm ile gzlemlenebilir. 260 nm dalga boyunda her iki koenzimin ykseltgenmi ve indirgenmi formlar absorblarken, 340 nm dalga boyunda koenzimlerin sadece indirgenmi formlar ultraviyole n absorbe eder. 1 cmlik kvette NAD+ ve NADH birlikte ieren bir rnee ilikin veriler aada verilmitir, NAD ve NADH konsantrasyonlarn hesaplaynz. 260 nmde NADH ve NAD+ iin molar ekstinksiyon katsaylar (mol-1 x L x cm-1) srasyla, 1.5 x 104 ve 1.84 x 104tr. 340 nmde sadece ortamdaki NADH absorblar NADH= 6.22 x 103 mol-1 x L x cm-1. Nukleotid karmn ieren zeltinin absorbanslar 260 nmde 1.362, 340 nmde ise 0.382 olarak saptanmtr.

35

Cevap: 340 nmde karmn verdii absorbansn tm NADH kaynakldr. ANADH = x l x c 0.382 = 6.22 x 103 x l x c c=[NADH]=0.382 / 6.22 x 103 x l = 6.141 x 10-5 mol/L NADHn 260 nmdeki konsantrasyonu deimez, dier taraftan bu dalga boyunda NAD+ de absorblar. ANADH = 1.5 x 104 x 6.141 x 10-5 x 1 = 0.9212 260 nmde NAD+ ve NADH iin toplam absorbans deneysel olarak At = 1.362 gzlemlenmiti . Buradan, ANAD+ = At - ANADH (260 nm) =1.362 0.9212 =0.4408 Buradan okside formun konsantrasyonu Lambert-Beer kanunundan hesaplanabilir. c=[NAD+]=0.4408 / 1.84 x 104 x 1 = 2.40 x 10-5 mol/L Soru 5: Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzimi Mg2+ ve NADP+ varlnda glukoz-6-fosfatn, 6fosfoglukonik asid- -laktona dnmn katalizler. Glukoz 6-fosfat ieren 1 mLlik rnek zerine, fazla miktarda NADP+ ve MgCl2 ieren zeltiden 1 mL pipetlenir. 1 cmlik kvette 340 nmde absorbans deiimi, glukoz-6-fosfatn tamamnn tketilmesi ile 0.61 deerine ular. rnekteki Glukoz-6-fosfat konsantrasyonunu hesaplaynz. NADPH iin 340 nmde molar ekstinksiyon katsays, 6.22 x 10-3 mol-1L cm-1 deerine sahiptir Cevap: Fazla miktarda koenzimin varlnda reaksiyon, rnlerin oluumu ynnde, yani saa doru ilerler. 340 nmde maksimum absorbans veren NADPHn son konsantrasyonunun hesaplanmas stokiyometrik olarak Glukoz-6-fosfatn tketimiyle ilikilidir. A=xlxc 0.61 = 6.22 x 10-3 x l x c c= 0.61 / 6.22 x 10-3 x 1 = 98.07 mol/L Orijinal konsantrasyonu hesaplamak iin kan sonucu dilusyon faktrn gz nne alarak 2 ile arpmamz gerekir. Cori = 196.14 mol/L Soru 6: 1 molarlk bilirubin standart nce 1:60700 ve daha sonra 1:2 orannda sulandrdmzda son dilsyonu 1/121400 olur. 1 cmlik kvette final dilsyondaki bilirubin standartnn absorbans 0.495 okunduuna gre, bilirubin standartnn molar ekstinksiyon katsaysn hesaplaynz. Cevap: = 0.495 (121400) / 1 mol/L (1cm) =60093 L mol-1 cm-1. Soru 7: B ve C biyokimyasallarn ieren bir karmn 1 cmlik kvette, 460 ve 500 nm dalga boylarndaki absorbanslar srasyla 0.63 ve 0.52 olarak okunmutur. 460 nmde Bnin molar absorbans 1.03 x 103, Cnin 4.57 x 103, 500 nmde ise B iin 7.12 x 103, C iin 1.43 x 103 olarak verilmektedir. Absorbans deerlerinin toplanabilir olduunu gz nne alarak B ve C maddelerinin konsantrasyonlarn hesaplaynz. Cevap: 0.63 = 1.03 x 103 x 1 x [B] + 4.57 x 103 x 1 x [C] (460 nm) 0.52= 7.12 x 103 x 1 x [B] + 1.43 x 103 x 1 x [C] (500 nm) Eitliklerin sa tarafndaki 103 ler sadeletirildiinde eitlikler aadaki gibi yazlarak iki bilinmeyenli bir denklem sistemi elde edilir. 0.63 = 1.03 x [B] + 4.57 x [C] 0.52= 7.12 x [B] + 1.43 x [C]

36

stteki denklem -7.12, alttaki 1 ile arplarak denklem sistemindeki bilinmeyen says bire indirilir ve [C] hesaplanr. -7.12 / 0.63 = 1.03 x [B] + 4.57 x [C] 1/ 0.52= 7.12 x [B] + 1.43 x [C] -4.49 = -7.33 [B] - 32.54 [C] 0.54 = 7.33 [B] + 1.47 [C] -31.07[C] = -3.95 [C]= 0.125 mM Bulunan [C] deeri yukardaki denklemlerden birinde yerine konularak [B ]= 0.125 mM olarak bulunur. Soru 8: Kabaca bir yaklamla 1 mg/mLlik bir protein zeltisinin 280 nmdeki absorbansnn 1 absorbans nitesi kadar olduu sylenebilir. Eer deney absorbans 280 nmde 2.0dan yksekse altmz protein zeltisini dile etmemiz gerekir. Saflatrlm bir protein zeltisinin 0.2 mLsi 1 cm k yoluna sahip bir kvet ierisinde 1mLye dile ediliyor. Spektrofotometredeki absorbans deeri 0.75 olarak okunduuna gre protein konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: Dile rnekteki protein miktar= 0.75 Ab. x 1 mg/mL / 1 Ab. = 0.75 mg/mL Orijinal rnekteki protein miktar = 1 mL x 0.75 mg/mL / 0.2 mL = 3.75 mg/mL Soru 9: Nkleik asitler 260 nmde maksimum absorbans verdikleri gibi, 280 nmde de yksek absorbans verirler. Nkleik asitleri ieren saflatrlmam protein ekstrelerinde protein konsantrasyonu, 260 nmdeki dzeltme faktr gz nne alnmad takdirde hatal bir ekilde yksek olarak hesaplanr. Bu iliki aadaki eitlikte verilmitir. Protein konsantrasyonu (mg/mL)=(1.55 x A280) (0.76 x A260) Aratrmac 10 L ekstrakt 1cm k yoluna sahip kuartz kvette tampon zeltiyle 1 mL son hacme tamamlyor, 260 nmde spektrofotometreyi tampona kar sfrladktan sonra ekstrenin A260 deerini 0.075 olarak okuyor. Ayn ilemi A280 iin tekrarladnda absorbans 0.25 olarak okuyor. Protein ekstresindeki yaklak protein konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: mg/mL = (1.55 x 0.25) (0.76 x 0.075)=0.39-0.06=0.33 mg/mL Bir mL kvetteki yaklak protein konsantrasyonu 0.33 mg/mLdir. 10 L ekstrakt 1000ye tamamlamakla rnei 1000 L / 10 L = 100 kez dile etmi olduundan, sonu 33 mg/mL olarak hesaplanr. Soru 10: Standart koullar altnda bir mol substrat rne dntren enzim miktarna 1 internasyonal nite (U) ad verilmektedir. Absorbans deiikliini internasyonal niteye evirmek iin aadaki forml kullanlmaktadr. U/L=mol/dk/L= A/min x Vt x 106 (mol/mol) / x Vs x l A/min=Dakikadaki absorbans deiimi Vt=Toplam reaksiyon hacmi = rnek + Reaktif + Dilent Vs=rnek hacmi = ekstinksiyon katsays 106 mol/mol faktr sonucu mo/dk/L cinsinden hesaplayabilmek iin gereklidir. Alkalen fosfataz aktivitesini belirlediimiz serum rneinden elde edilen deerler aadaki gibidir. Enzim aktivitesini hesaplaynz. A= 0.070 (p-nitrofenol)=50,000 L / mol . cm t= 15 dk Vt = 5.5 mL Vs = 0,005 mL

37

Cevap: U/L = 0.070 (106 mol/mol) (5.5 mL) / 15 dk (50,000 L / mol . cm) (0.005 mL) (1cm) U/L =0.070 x 5.5 x 1000 / 50 x 0.075 = 103 U/L Soru 11: Enzim reaksiyonu sonucu dakikada meydana gelen absobans deiimi A=0.250 llmtr. Reaksiyon sonucu oluan rnn 425 nmde 30 oC deki molar absorbtivitesi 12.2 x 103 olarak verilmektedir. Enzim aktivitesi llrken ortamn scakl 30 oC de korunmutur. Deneyde 1 mL reaktif, 0.050 mL rnek kullanldna gre enzim aktivitesini internasyonal nite olarak hesaplaynz. Cevap: c= (0.250) (106) (1.050 mL) / (12.2 x 103) (0.050 mL) (1cm) =615 U Soru 12: Laboratuar teknisyeni 10 mg/mL konsantrasyonunda 50 mL NADH (MW=663.44) zeltisi hazrlamay istemektedir. Bu zeltiyi doru olarak hazrlayabilmek iin 50 mg/mL konsantrasyonunda stok bir zelti hazrlamas gerekmektedir. Stok zeltinin 1: 1000 orannda dile edilmesiyle elde edilen zeltinin 340 nm dalga boyundaki absorbans llerek ve 340 nm = 6.22 x 103 kullanlarak aktel konsantrasyon hesaplanr. Bu prosedr izleyen teknisyen absorbans 0.562 olarak okuyor. Stok zeltideki NADH konsantrasyonunu mmol/L ve mg/L olarak hesaplaynz. 10 mg/mLlik NADH zeltisi hazrlamak iin hangi oranda bir dilsyon yapmak gereklidir. Cevap: Absorbans=0.562 x dilsyon faktr (1:1000)=562 562 = 6.22 x 103 x l cm x c c=0.09035 mol/L=90.35 mmol/L 663440 mg x 0.09035 / 1 mol = 59942 mg /L V1 x C1 = V2 x C2 50 mL x 10 mg/mL = V2 x 59942 mg/mL V2 =0.00834 mL (8.34 L) alnr, 50 mLye tamamlanr ve 10 mg/mLlik zelti elde edilir. Soru 13: Biyolojik bir kaynaktan saflatrlan nkleik asitlerdeki protein kontaminasyonu hakknda bir fikir elde edebilmek iin 260 nmdeki absorbansn, 280 nmdeki absorbansa oranna baklr. Protein kontaminasyonu iermeyen saf DNA rneklerinde A260/ A280 oran 1.8 civarndadr. Ortamda protein ya da fenol kontaminasyonu varsa bu oran 1.8in altnda, RNA varlnda ise 1.8in stndedir. Saflatrlm RNA ieren rneklerde A260/ A280 oran 2.0 deerine ok yakndr. 260 nmde 2 g/mL kadar dk DNA konsantrasyonlar tespit edilebilir. ift zincirli DNAda 1 absorbans birimi (A260) 50 g DNA / mL deerine karlk gelmektedir. 50 Llik DNA sspansiyonunun 20 Lsi distile su ile 1000 L son hacme tamamlanyor. Dile rnee ait absorbans deerleri A260 =0.550 ve A280 = 0.324 olarak saptanyor. a) 50 Llik DNA sspansiyonundaki DNA konsantrasyonunu hesaplaynz b) A260/ A280 orann bulunuz. Cevap: a) DNA (mL) = 0.550 A x 50 g DNA / mL / 1 A = 27.5 g DNA / mL DNA (50 L) = 50 L x 27.5 g / 20 L = 68.75 g DNA b) A260/ A280 = 0.550 / 0.324 = 1.697

Soru 14: Domuz kalp dokusundan hazrlanan doku homojenatnda ilk basamak aspartat aminotransferazn (AST) hazrlanmasdr. Hcre kalntlarnn filtrasyonla, nkleik asitlerin ise polietilenimin muamelesi ile uzaklatrlmas sonucunda 2 L hacminde total ekstre elde edilir (Solsyon A). Bu ekstrenin 50 Llik bir ksm 1 cm k yoluna sahip kvete aktarldktan sonra zerine 3 mL tampon eklenir. rnein absorbans 280 nm dalga boyunda 1.7 olarak okunduuna gre;

38

a) b)

c) Cevap: a)

Ekstrenin protein konsantrasyonunu hesaplaynz. Bir nite AST; 260 nm dalga boyunda, dakikada, 3 mL substrat zeltisi iinde, 0.1 absorbans deiimine yol aan enzim miktar olarak tanmlanmaktadr. Enzim aktivitesini belirlemek amacyla 100 L ekstrenin zerine 3 mL substrat zeltisi ilave edilir, absorbans deiimi 0.08 dk-1 olarak kaydedilir. Ekstrenin 1 mLsindeki enzim nitesini ve ekstredeki toplam enzim nitesini hesaplaynz. Enzimin spesifik aktivitesini (nite / mg protein) hesaplaynz. 1 mg/mLlik protein zeltisinin, 1 cm k yoluna sahip kvette, 280 nmdeki absorbansnn 1 olduunu kabul edersek; kvetteki protein konsantrasyonu 1.7 mg/mL olarak bulunur. 50 L rnek zerine 3 mL (3000 L) tampon eklendiine gre rneimiz 3050/50=61 kez dile olmutur. zelti Ann protein konsantrasyonu= 1.7 mg/mL x 61 = 104 mg/mL zelti A daki total protein miktar = 104 mg/mL x 2000 mL = 208000 mg 1 nite enzim dakikada 0.1 absorbans deiimine yol atna gre Kvetteki enzim nitesi= 0.08 / 0.1=0.8 0.8 enzim nitesi kvete pipetlenen 100 L ekstreden gelmektedir. 1 mL ekstrede= 8.0 U 2000 mL ekstraktda= 2000 x 8.0 =16000 U bulunur. Spesifik aktivite= 8.0 U / 1,7 mg/mL = 4.72 U/mg protein

b)

c)

Soru 15: M metaboliti beyin omurilik svsndan (BOS) izole ediliyor =280 nmdeki eksitasyonu takiben =360 nmde emisyon veriyor. (i) (ii) (iii) (iv) Metabolitin iinde znd tamponla cihazn skalas sfrlanr. Daha sonra 100 ng/dLlik saf haldeki M standart ile floresans skalada %100e ayarlanr. M metaboliti dndaki bileenleri ieren kr zeltisinin toplam floresans %11.2 olarak okunuyor. M metabolitini ieren ekstrenin floresans %67 olarak okunuyor. Saf haldeki M metabolitin ekstreye katlmasyla hazrlanan internal standartn konsantrasyonu 1 g / L ( 100 ng/dL), floresans %92dir.

BOS rneindeki M metabolitinin konsantrasyonunu g / L olarak hesaplaynz. Stokes kaymas ne kadardr? Cevap: rnein floresans / nternal standartn net floresans=rnein konsantrasyonu/ nternal standartn konsantrasyonu I standart = %100 55.8 / 25 = rnein konsantrasyonu/ 1 g / L Ikr = %11.2 rnein konsantrasyonu=55.8 / 25=2.34 g / L Itoplam=%67 Stokes kaymas= 2 1=360-280=80 nm = Iinternal st %92 Irnek = Itoplam - Ikr =67-11.2=%55.8 Inet internal = Iinternal st - Itoplam = 92-67=%25

39

STANDART ER DEN YARARLANILARAK YAPILAN KONSANTRASYON HESAPLAMALARI

Genel prensipler
Beer kanununa uyan yntemlerde; analiz boyunca k yolu uzunluu ve absorbe eden reaksiyon rnnn molar absorptivitesi deimedii srece, absorbans konsantrasyon ile doru orantldr. Laboratuar otomasyon sistemlerinde Beer kanununa uygunluun kontrol edilmesi; test ynteminin dorusallnn geni bir konsantrasyon aral boyunca sklkla denetlenmesi esasna dayanr. Manuel almalarda konsantrasyon sonular standart grafik olarak da bilinen, Beer kanunu grafii kullanlarak hesaplanabilir. Grafik belirli konsantrasyondaki standartlara karlk gelen absorbans deerlerinden yararlanlarak izilir. Pekok spektrofotometrik deneyde reaktif kr kullanlarak balang absorbans sfra (0) ayarlandndan, grafiin balang noktas sfrdr. Yatay eksen x eksenini, dikey eksen ise y ekseni ifade eder. Genellikle x ekseninde konsantrasyonlar, y ekseninde ise ilgili absorbans deerleri bulunur. Standart grafikte ise sadece standart konsantrasyonlar ve ilgili absorbanslar yer alr(ekil 6.1).

Sorular ve cevaplar
0.1 mL tampon zeltisi iinde 10-100 g arasnda sr serum albumini (BSA) ieren bir seri standart zelti hazrlanr. Her tpe 5er mL Bradford boya reaktifi eklenip kartrldktan sonra, standartlar 2 dakika sreyle karanlkta bekletilir ve absorbanslar 595 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur. Elde edilen absorbans deerleri aadaki gibi bulunur. Tablo 6.1: BSA standartlar ve 595 nmdeki absorbanslar

mg BSA
10 20 30 40 50 60 75 100

A 595
0.11 0.21 0.30 0.39 0.48 0.58 0.71 0.88

Soru1: Konsantrasyonu bilinmeyen saflatrlm proteinin 2 Lsi son hacim 100 L olacak ekilde dile ediliyor ve protein standartlarnda olduu gibi Bradford reaktifi ile reaksiyona sokuluyor. 595 nmdeki absorbans 0.44 olarak okunuyor. Orijinal rnekteki protein miktarn mg/mL olarak bulunuz. Cevap: Tablo 6.1deki verilerden yararlanlarak standart bir eri izilir (ekil 6.1). y ekseni zerindeki 0.44 absorbans deeri x eksenindeki 46 g deerine karlk gelmektedir. 46 g proteinin 2 L rnek iinde temsil edildii dnlebilir. Buradan aadaki hesaplamalar yoluyla mg/mL olarak protein miktar hesaplanabilir.

40

ekil 6.1. BSA standartlar ve 595 nmdeki absorbanslar (46 g . 1000 L) / 2 = 23000 g/mL=23 mg/mL Soru 2: Serum protein konsantrasyonunun belirlenmesinde kullanlan biret yntemi olduka stabil olup, Lambert-Beer kanununa uygunluk gsterir. ok sayda standart alp lineer bir standart eri oluturmak yerine, 6 g/dLlik tek bir standart allyor ve standartn absorbans spektrofotometrede 0.400 olarak okunuyor. Serum rneinin, biret reaksiyonunu takiben spektrofotometrede okunan absorbans 0.350 olduuna gre rnekteki protein konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: Standart konsantrasyonu (Cs) / Standart absorbans (As) = rnek konsantrasyonu (Cu) / rnek Absorbans (Au) Cu = (0.350) (6 g/dL) / (0.400) =5.25 g/dL Cihaz, ya da reaktifin lot numaras gibi sistem unsurlar deimedike bu tip hesaplamalar kabul edilebilir bir zellik tar. Herhangi bir sistem deiikliinde ise mutlaka yeni bir standart eri oluturulmaldr.

41

Soru 3: rneklerdeki AOPP (Advanced Oxidation Protein Products) konsantrasyonunu hesaplayabilmek iin molekl arl 281.69 g/mol olan Kloramin-T kullanlarak aadaki tabloda grlen standartlarn her birinden 1000 mL stok zelti hazrlanyor. Stok zeltiler son hacmi 10 mL olacak ekilde 1/100 orannda dile edildikten sonra absorbans deerleri spektrofotometrede okunuyor. Standartlarn stok ve 1/100 oranndaki dile zeltilerinde bulunan Kloramin-T konsantrasyonunu hesaplaynz Tablo 6.2: Kloramin-T standartlar ve 340 nmdeki absorbanslar Kloramin-T (mol/L) 15 30 40 55 70 85 100 Absorbans 0.144 0.449 0.555 0.850 0.880 1.183 1.280

Cevap: 281.69 g/mol = 281690 mg / 106 mol 15 mol/L = 15 x 281690 / 106 = 4.23 mg/L 4.23 mg tartmak iin ok kk bir miktar olduundan 423 mg tartlarak 1 litreye tamamlanr ve bylelikle 100 kez konsantre 1500 mol/L konsantrasyonunda bir zelti hazrlanr. M1 x V1 = M2 x V2 1500 mol/L x V1 = 15 mol/L x 10 mL V1 = 0.1 mL stok zeltiden alnr, 10 mL son hacme deiyonize su ile tamamlanr. Bylelikle stok zelti 1/100 orannda dile edilmi olur. 0.1 mL zelti iindeki madde miktar 10 mL son hacim ierisinde temsil edildiinden. 1/100 dile zeltideki madde miktar (15 mol/L) =0.1 x 423 / 1000 = 0.0423 mg Dier standartlar iin de ayn yolla hesaplama yaplarak aadaki deerler bulunur. Tablo 6.3: Stok ve dile edilmi Kloramin-T zeltilerinin konsantrasyonlar Stok (mg/L) 423 845 1127 1549 1922 2395 2817 1/100 dile (mg/10 mL) 0.0423 0.0845 0.1127 0.1549 0.1922 0.2395 0.2817

Soru 4: 6250 U/ mL aktivitesindeki SOD (Speroksid dismutaz) standartndan 20 L alnarak zerine 1.98 mL dilsyon tamponu ilave ediliyor. Elde edilen bu SOD stok solsyonundan Adan Gye kadar sralanan 7 tpe aadaki tabloda grlen hacimlerde pipetlendikten sonra, zerine dilsyon tamponu ilave ediliyor. Tplerin her birinin iindeki SOD aktivitesini hesaplaynz. (Speroksit radikalini %50 orannda dismutasyona uratan enzim miktar 1 SOD nitesi olarak tanmlanmaktadr).

42

Tablo 6.4: Standart eriyi oluturmak zere SOD standartlarnn hazrlan Tp A B C D E F G Cevap: SOD standart (20 L)= (20 L x 6250 nite) / 1000 L =125 nite SOD standartnn dilsyon oran =20 L / 1980 L = 1/ 100 125 U 100 kez dile edildii iin SOD stok zeltisinin aktivitesi = 125 / 100 =1.25 U olarak bulunur A tpndeki son SOD aktivitesi, 20 / 980 = 1 /50 dilsyona karlk gelir Aktivitenin dilsyon oranna blnmesiyle, A tpndeki final SOD aktivitesi 1.25 / 50 =0.025 U/mL deerine eittir. SOD stok zeltisinden pipetlenen miktarlar birbirinin kat eklinde olduundan, dier tplerdeki SOD aktiviteleri kolaylkla hesaplanabilir. Soru 5: MDA ( Malondialdehit) standart olarak kullanlan 1,1, 3, 3- tetrametoksipropandan (04mol) konsantrasyon aralnda standartlar hazrlanp, 586 nm dalga boyunda absorbanslar okunuyor. MDA standart erisinin lineer regresyon denklemi y=0.1200x + 0.0038 olarak bulunduuna gre, absorbans 0.420 olarak okunan rnein konsantrasyonunu hesaplaynz. SOD stok solsyonu (L) 0 20 40 80 120 160 200 Dilsyon tamponu (L) 1000 980 960 920 880 840 800 SOD aktivitesi (U/mL) 0 0.025 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

ekil 6.2. Malondialdehit (MDA) standart erisi

43

Cevap: y =ax + b = 0.1200x + 0.0038 a = regresyon katsays b = intercept (Standart erinin grafik eksenini kestii nokta) A586=rnein absorbans y=rnein konsantrasyonu [MDA] = a [MDA] + b a [MDA] = [MDA] b [MDA] =[MDA] b / a [MDA] = [ A586] b / a = (0.420 0.0038) / 0.1200 =3.47 mol

Homodimerik flavoprotein yapsndaki glutatyon redktaz (GR) hcredeki indirgenmi glutatyon ( GSH) konsantrasyonunun optimum dzeyde korunmasn salar. GR kofaktr olan NADPH varlnda, okside glutatyonun (glutatyon dislfit, GSSG) indirgenmi glutatyona (GSH) dnmn katalizler (ekil 6.3).

ekil 6.3. Glutatyon dislfitin (GSSG), Glutatyon redktaz ve NADPH tarafndan indirgenme reaksiyonu 1 U GR, standart koullarda (pH 7, 25 oC), 1 dakikada 1 mol GSSG indirgeyen, 1 dakikada 1 mol NADPH tketen veya 1 mU GR dakikada 1 nmol NADPH tketen enzim

44

miktar olarak tanmlanabilir. NADPH iin molar ekstinksiyon katsays, 340 nmde, = 6220 M-1 cm-1 deerine eittir rneklerdeki GR aktivitesi standart eriden ya da NADPHn molar ekstinksiyon katsays kullanlarak hesaplanabilir. Reaksiyon ortamna NADPH zeltisinin pipetlenmesiyle reaksiyon balar. rnek, standart ve kr absorbanslar be dakika sreyle her 60 saniyede bir 340 nm dalga boyunda okunur. Deney sonucu standartlarn dakikadaki ortama absorbans deiimi (A340/ dk; y ekseni) ve GR aktivitesi (1,3,5,7,10 mU/mL; x ekseni) deerlerinden yararlanlarak GR standart erisi elde edilir (ekil 6.4).

ekil 6. 4. Glutatyon redktaz enziminin standart erisi Soru 6: 200 L hacmindeki eritrosit hemolizatnn 1/50 orannda dilsyonu sonucunda aada verilen ortalama ve net absorbans deiimi deerleri elde ediliyor. 200 L dile rnek iin kullanlan toplam reaktif hacmi 800 L olduuna gre GR aktivitesini standart eriden ve molar ekstinksiyon katsaysn kullanarak hesaplaynz. rnein ortalama absorbans deiimi A340/ dk = 0.0325 A340/ dk Krn ortalama absorbans deiimi A340/ dk = 0.0005 A340/ dk Net absorbans deiimi A340/ dk = 0.0320 A340/ dk (0.0325-0.0005) Cevap: Standart eriden hesaplama: Standart eriden (ekil 6.4) GR aktivitesi 5.14 mU/mL olarak bulunur. 200 L dile rnek iin kullanlan reaktif hacmi 800 L olduuna gre; Deneyin dilsyon dorulamas= 1000 L / 200 L x 5.14 = 25.7 mU/mL 1/50 orannda dile edilmi orijinal rnekteki dilsyon dorulamas sonucu rnekteki GR aktivitesi aadaki ekilde hesaplanr GR= 50 x 25.7 =1285 mU/mL Molar ekstinksiyon katsaysndan hesaplama: =6220 M-1 cm -1 = 6.22 x 10-3 mL/nmol Net absorbans deiimi A340/ dk = 0.0320 GR aktivitesi=A340/ dk / 6.22 x 10-3 mL/nmol = 0.0320 / 6.22 x 10-3 mL/nmol =5.14 mU/mL olarak bulunur. Dilsyon oranlarndan hemolizattaki orijinal GR aktivitesi yukardaki gibi hesaplanabilir.
45

pH ve TAMPONLARLA LG L HESAPLAMALAR
Genel tanmlamalar
Tamponlarla ilgili aklamalara ve rnek problemlere gemeden nce asit, baz, pH ve pKa gibi temel tanmlamalara ksaca gz atmann gerekli olaca kansndayz. Suda znd zaman (H+) iyonu veya hidronyum iyonu veren maddeler asit, (OH-) iyonu verenler ise baz olarak tanmlanmaktadr. Matematiksel olarak pH (power of Hydrogen), hidrojen iyonu molar konsantrasyonunun negatif logaritmasdr. pH = log (1 / [H+]) pH = -log [H+] Su molekl; hidronyum (H3O+) ve hidroksil (OH-) iyonlarna ayrr. Hidronyum iyonunu basit olarak H+ iyonu olarak gstererek aadaki ayrma reaksiyonunu yazmak mmkndr. H2O [H+] + [OH-] Suyun ayrma sabiti (Kd) aadaki eitlikte verilmitir. Keli parantez iindeki terimler molar konsantrasyonu ifade etmektedir. (1000 g /18 g=55.6 M) suda 25 oCde, 10-7 mol [H+] iyonu ve 10-7 mol [OH-] iyonu bulunur. Kd = [H+] [OH-] / [H2O] Suyun konsantrasyonu (55.6 M) iyonizasyon ile ok az deitiinden yukardaki eitlii aadaki ekilde basitletirerek yazmak mmkndr. Eitlikteki Ksu ifadesine suyun iyon rn ad verilmektedir. Ksu = [H+] [OH-] =1.0 x 10-14 M2 H+ ve OH- konsantrasyonlar birbiri ile ilikilidir; biri artarken, dieri azalr. [H+]=10-2 olduu durumda [OH-]=10-12 dir. Bu nedenle pH skalas 0-14 arasnda dzenlenmitir. Alttaki eitlik pH ve pOH arasndaki ilikiyi gstermektedir. pH + pOH =14 Asit ve bazlarn greceli kuvvetleri kadar, suda znebilirlik zellikleri de derecelendirilebilir. znrlk sabiti (Kd deeri, iyonizasyon sabiti) tablolarn pek ok biyokimya kitabnda bulmak mmkndr. Yksek K deerine sahip asitler sulu zeltilerinde daha yksek oranda iyonlarna ayrlrlar. pK; proton alcs ve proton vericisi formlarn eit konsantrasyonlarda bulunduu pH deerindeki iyonizasyon sabitinin (K) negatif logaritmasdr. Kuvvetli asitlerin pK deerleri 3.0n altnda, kuvvetli bazlarn pK deerleri ise 9.0n stndedir. Asitler kendi pK deerlerinin stnde bir pHda H+ iyonu vererek iyonlarna ayrlrlar. Bazlar ise

46

pK deerlerinin altnda bir pHda ortama (OH-) iyonu verirler. Birden fazla pK deerine sahip bileikler ortama birden fazla H+ iyonu verme ya da alma zelliindedir. Biyokimyasal reaksiyonlar her reaksiyona zg sabit bir pH deerinde meydana gelir. Bu bakmdan reaksiyon ortamnn pH deerinin tampon sistemlerle sabit olarak korunmas nem tar. Tamponlar zayf bir asit veya baz ile ilgili tuzundan oluan ve reaksiyon ortamndaki pH deiikliine kar koyan sistemlerdir. Tamponun etkinlii, tampon sistemin pK deeri ile ortamn pH deerine baldr. Tamponun pK deeri ortamn pH deerine ne kadar yaknsa o kadar kuvvetli tamponlama etkisi meydana gelir. Proton alcsnn molar konsantrasyonunun, proton vericisinin molar konsantrasyonuna eit olduu durumlarda, Henderson-Hasselbalch eitliine gre pH=pK olduundan maksimum tamponlama kapasitesi grlr. Genel bir kural olarak, tamponun optimum pHs pH=pK1 snrlar iinde olmaldr. Asetik asit/Asetat tamponunun pH=pK deeri 4.73dr. Yukarda verilen genel kurala uygun olarak Asetik asit/Asetat tamponunun optimum tamponlama kapasitesi 4.0-5.5 deerleri arasndadr. Bu araln altndaki ve stndeki deerlerde tamponlama kapasitesi nemli lde azalr. Kan plazmasnn pHs 7.4; bikarbonat-karbonik asit, laktik asit-laktat, amonyum-amonyak sistemlerinin pK deerleri ise srasyla 6.1, 3.9, 9.4dr. Bu tampon sistemler iinde en yksek tamponlama kapasitesine yukardaki aklamaya bal olarak bikarbonat-karbonik asit sistemi sahiptir.

Henderson-Hasselbalch eitliinin hesaplanmas

Henderson-Hasselbalch eitlii tampon etkisinin ve organizmadaki asit-baz dengesinin anlalmasnda nem tar. Zayf bir asidin (HA) ayrmas ile H+ ve A- iyonlar oluur. HA H+ + AAsidin znrlk sabiti (Ka) aadaki eitlikten hesaplanr. Ka = [H+] [A-] / [HA] [H+] eitliin sol tarafna ekilir. [H+]=Ka [HA] / [A-] Eitliin her iki tarafnn negatif logaritmas alnr. -log [H+] = -log Ka -log [HA] / [A-] -log [H+] yerine pH, -log Ka yerine ise pKa konulur. pH=pKa - log [HA] / [A-] -log [HA] / [A-] ifadesindeki pay ve paydann yer deitirmesiyle (-) iareti (+) ya dnr ve Henderson-Hasselbalch eitlii elde edilir. pH=pKa + log [A-] / [HA+] pH=pKa + log [proton alcs-] / [proton vericisi]

47

Tablo 7.1: Tampon zeltilerde sklkla kullanlan baz asit ve bazlarn pKa deerleri Asit veya Baz Asetik asit Barbiturik asit Karbonik asit Sitrik asit Glisilglisin Hepes* Fosforik asit Fitalik asit Pipes** Sksinik asit Tartarik asit Tris*** pKa (25 oC) 4.75 3.98 6.10, 10.22 3.10, 4.76, 5.40 3.06, 8.13 7.50 1.96, 6.70, 12.30 2.90, 5.51 6.80 4.18, 5.56 2.96, 4.16 8.14

*4(2-hidroksietil)-1-piperazin-etanslfonik asit **1,4-piperazindietanslfonik asit ***2-amino-2-hidroksimetilpropan-1,3-diol

pHmetre ve tampon hazrlanmas

pHmetreler elektrokimyasal esasa gre alan cihazlardr. Tamponun pHs HCl yada NaOH ile ayarlanmadan nce, pHmetrenin kalibrasyon ayar pH 7.0 ve daha sonrada asit ya da alkali pHdaki (pH 4.0 veya 9.0) standart tamponlarla yaplmaldr. pH lmnn kesinlii rnekle temas halindeki cam (indikatr) elektrotun ve ierdii tamponun zelliine, ortam scaklna, kalibrasyon tamponunun doruluuna ve referans elektrot iindeki elektrolitin zelliine baldr. Referans elektrot, referans elektrolit ( 3 M KCl) ile dolu haldedir. Referans elektrolit eksildiinde hazrlanlarak tamamlanmas gerekebilir. Normalde cam elektrotun mr 13 yl arasndadr. Cam elektrot eskidike kalibrasyonu gleir. Sadece hidrojen iyonlarna geirgen olan cam elektrot rejenerasyon amacyla, nce 5 dakika %4lk NaOH iinde, daha sonrada %4lk HCl iinde tutulur. Cam elektrot kullanlmad zamanlar mutlaka deiyonize veya distile su iinde tutulmaldr. pH lm, indikatr elektrotla, referans elektrot arasndaki potansiyel farknn llmesi temeline dayanr. Tamponlar tampon maddenin son miktarnn bir miktar distile suda znmesiyle hazrlanr. Tampon zeltinin pHs duruma gre HCl veya NaOH ile titre etmek suretiyle ayarlanr. stenilen konsantrasyondaki son hacme ise distile su eklenerek ulalr. Henderson-Hasselbalch eitlii gereince distile su eklemekle [proton akseptr-]/[proton donr] oran deimeyeceinden tamponun pHs sabit olarak kalr. Spesifik bir pH deerindeki potasyum (ve sodyum) fosfat tamponlar; K2HPO4 veya KH2PO4 tuzlarndan ayr, ayr hazrlanan belirli konsantrasyonlardaki zeltilerin, yine belirli hacimlerde kartrlmasyla hazrlanr. Tamponlarn hazrlanmasyla ilgili oran ve konsantrasyonlar ieren tablolar deiik bavuru kitaplarnn eklerinde yer almaktadr. pH, scaklk ile ilikili olduundan tamponun pH deeri 25 oC de ayarlanmaldr. Fazla miktarda tampon gerektiinde, konsantre olarak hazrlanan tampondan uygun oranda dilsyon yaplarak arzu edilen konsantrasyonda tampon hazrlanabilir.

48

Sorular ve cevaplar
Soru 1: pH deeri 3.75 olan krmz arabn hidrojen iyonu konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: pH= -log [H+] -log[H+]= 3.75 Eitliin her iki taraf -1 ile arplr. log[H+]= -3.75 Eitliin her iki tarafnn antilogaritmas alnr. [H+] = 1.8 x 10-4 Soru 2: 0.02 Mlk NaOH zeltisinin pHsn hesaplaynz. Cevap: Kuvvetli bir baz olan NaOH sulu zeltilerde tamamyla Na+ ve OH- iyonlarna ayrlr. Dolaysyla OH- iyonu konsantrasyonu, 0.02 M olan Na0H konsantrasonuna eittir. Kuvvetli bazlarla ilgili pH hesaplamalarnda suyun iyonizasyonu ile ortaya kan H+ iyonu konsantrasyonu ok kk olduundan ihmal edilebilir. Problemin zmnde ilk aama pOH deerinin hesaplanmasdr. Daha sonra pOH deeri 14ten karlarak pH deeri hesaplanr. pOH = -log (0.02) = -(-1.7)=1.7 pH + pOH =14 pH= 14 - 1.7=12.3 Soru 3: 0.1 M NaOH zeltisindeki H+ iyonu konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: Kd = [H+] [OH-] =1.0 x 10-14 M2 [H+]= Kd / [OH-]=1.0 x 10-14 M2 / 10-1 M = 10-13 M Soru 4: H+ iyonu konsantrasyonu 0.00013 M olan zeltideki, OH- iyonu konsantrasyonunu hesaplaynz. Cevap: Kd = [H+] [OH-] =1.0 x 10-14 M2 [OH-]= Kd / [H+]= 1.0 x 10-14 M2 / 1.3 x 10-4 = 7.7 x 10-11 M Soru 5: 1 mL 0.1 mol HCl zeltisinin, 10 mL 0.1 M sodyum asetat ve 10 mL 0.1 M asetik asitten oluan tampon zelti zerine ilave edildiini dnelim. Bu durumda yeni karmn pH deeri ne olur? Cevap: 1 mL 0.1 M HCl tampon zeltide bulunan 1 mL 0.1 M sodyum asetat ile reaksiyona girerek asetik asite dnecektir. Bu durumda yeni zeltideki [Tuz] / [Asit] oran 9 / 11 olur. Asetik asidin pKa deeri Tablo 1den bulunur. zeltinin pH s aada grld gibi hesaplanr. pH= 4.73 + log 9/11 = 4.73 + log 9 log 11=4.73 + 0.9542 1.0414 = 4.64 olarak hesap edilir. 1 mL 0.1 mol HCl ilavesinden nce zeltinin pH s pH= 4.73 + log 10/10= 4.73 + 0 = 4.73 pH deiimi =4.73 4.64 =0.09

49

Soru 6: 1.025 g anhidrit sodyum asetatn (MW=82) 100 mL 0.25 M asetik asitte znmesiyle hazrlanan tamponun pH sn hesaplaynz. Asetik asit pKa = 4.75 (Tablo 1) Cevap: [Sodyum asetat]=10.25 g/L = 10.25 g/L x 1 mol / 82 g/mol = 0.125 M pH = pKa + log ([Asetat] / [Asetik asit])=4.75 + log (0.125 / 0.250) pH= 4.75 -0.30 =4.45 Soru 7: 1 L, pH=7.1, 0.1 M fosfat tamponu hazrlamak iin, ka g NaH2PO4 ve Na2HPO4 gereklidir. (PKa2=6.8, Na=23 P=31 O=16) Cevap: H2PO4- HPO427.1=6.8 + log ( [HPO42-] / [H2PO4- ]) Eitliin her iki tarafnda 6.8 deeri kartlr. 0.3= log ( [HPO42-] / [H2PO4- ]) Eitliin her iki tarafnn antilogaritmas alnr. 2.0 = ( [HPO42-] / [H2PO4- ]) Yukardaki eitliin sol tarafndaki 2 deeri 1 L zelti iindeki konjuge baz/ konjuge asit molar konsantrasyonunu vermektedir. [HPO42-] =2[H2PO4-] olduuna gre, toplam iyon konsantrasyonunu gsteren aadaki denklemde [HPO42-] yerine 2[H2PO4-] konulur. [H2PO4- ] + 2[HPO42-]=0.1 M [H2PO4- ] + 2[2 H2PO4-] =0.1 M 5 H2PO4- = 0.1 M [H2PO4-] =0.020 Eitlikteki 2 deerini elde edebilmek iin [HPO42-] =0.040 olmaldr. Buradan aadaki miktarlar kolaylkla hesaplanabilir. [HPO42-]=0.040 mol=0.040 x 142=5.68 g [H2PO4- ]=0.020 mol=0.020 x 120=2.40 g Soru 8: 2 L,1 M, pH=8.0 sodyum fosfat tamponu hazrlanmas istenmektedir. 1 M monobazik sodyum fosfat (NaH2PO4) ve 1 M dibazik sodyum fosfat (Na2HPO4) stok zeltilerinden ne kadar alp kartrlarak istenen tampon hazrlanabilir. Cevap: Monobazik sodyum fosfat (NaH2PO4) suda Na+ ve H2PO4- iyonlarna ayrlr. H2PO4(fosforik asit, konjuge asit) daha sonra HPO4 (konjuge baz) ve H+ eklinde iyonize olur. Bileiin 25 oCde pKa deeri 6.82dir. pH ve pKa deerleri Henderson-Hasselbalch denkleminde yerine konulur. pH= pKa + log [A-] / [HA]
= 6.82 + log [HPO4-2] / [H2PO4-]

Eitliin her iki tarafnda 6.82 deeri kartlr. 1.18 = log [HPO4] / [H2PO4-] Logaritmik bir deer olan 1.18in ve log [HPO4-2] / [H2PO4-] antilogaritmas alnr. [HPO4-2] / [H2PO4-] = 15.14 olarak bulunur.

50

15.14 ksm [HPO4-2] 1 ksm [H2PO4-] ile kartrlarak toplam 16.14 ksm tampon elde edilir. 2 L tampon iin [Na2 HPO4-] = 15.14 /16.14 x 2 L = 1.876 L [NaH2PO4] = 1/16.14 x 2 L = 0.124 L Hesaplanan bu iki hacimdeki zeltilerin kartrlmasyla gerekli olan tampon hazrlanr.

51

YEN GEL T R LEN B R B YOANAL T K YNTEM N DENEYSEL GEERL L N N TEST ED LMES

Laboratuvar ortamnda, objektif olarak saptanm kalite kontrol performans verilerine dayanarak yeni bir biyoanalitik yntemin geerliliinin test edilmesi, llecek parametrenin dzeyinin gvenilir olarak belirlenmesinde nem tamaktadr. allmaya balanacak yeni yntemin doruluk accuracy ve kesinlik precision performansnn test edilmesi, yeni yntem zerinde etkili olan analitik faktrlerin yeterli olarak anlalmas ve deerlendirilmesine baldr. Kesinlik ve doruluk sinonim terimler deildir (ekil 8.1). Kesinlik, doruluk ve saptama snr detection limit gibi analitik performans kriterleri byk lde mevcut deney koullarna ve kullanlan analitik sistemin zelliklerine baldr. Hem manuel hem de otomasyon sistemlerinde gerekletirilen analizlerde pipetleme, zaman ve reaksiyon hz gibi faktrlere bal olarak sistematik ya da tesadfi hatalar olusa da, otomasyon yntemlerinde genel olarak kesinlik daha yksektir. Denge durumundaki bir reaksiyonda ileri ve geriye doru olan reaksiyon hzlar birbirine eit olduundan, oluan rnlerin konsantrasyonu denge durumunda llmelidir. Analiz edilecek maddenin dk konsantrasyonda bulunmas, reaktiflerin pipetleme sras, pipetleme teknii, reaksiyon ortamnn scakl, inkbasyon sresi, reaksiyona giren maddelerin karma hz gibi faktrler reaksiyon hzn ve kimyasal dengeyi etkiler. Biyoanalitik yntemler ortaya koyduklar sonularn zelliine gre grupta incelenebilir. Kalitatif yntemler herhangi bir analitin analiz edilecek rnekteki varl ya da yokluunu, kantitatif yntemler ise o rnekteki analit konsantrasyonunu belirlemekte kullanlr. Semikantitatif yntemler llen madde konsantrasyonunun daha nceden belirlenmi olan referans konsantrasyonun altnda ya da stnde olup olmadn gsterirler.

ekil 8.1. ekildeki (x ) rnein test edilen parametre iin gerek accurate deerini ifade etmektedir. A,B ve C dairelerinin iinde grlen noktalar ayn rnein farkl yntem ile allmas sonucu elde edilen deerlerin dalmn gstermektedir. A: Kesin deil fakat doru B: Kesin fakat doru deil C: Kesin ve doru

52

Analitik Kesinlik ve Doruluk

Analitik yntemlerdeki belirsizlik iki byk grup altnda incelenebilir: Tesadfe bal hata random error (RE) tm deneysel verilerde vardr. nceden kestirilmesi veya tamamen ortadan kaldrlmas olanakszdr. Biyokimyasal reaksiyonlarn oluum mekanizmalarnda reaksiyona giren molekller arasndaki arpmalarn tesadfi olmas nedeniyle, ya da lm yaplan cihazdaki kk voltaj oynamalarna bal olarak meydana gelir. Tesadfi hata herhangi bir zaman aralnda gerek deerden pozitif ya da negatif ynde sapmalara neden olur ve sonularn kesinliini etkiler. Sistematik hata systematic error ok veya az sayda sabit hata sonucu oluur. Bu durumda gerek deere gre, llen deerde srekli olarak grlen pozitif ya da negatif ynde bir sapma mevcuttur. Oransal sistematik hata yksek konsantrasyon dzeylerinde, sabit sistematik hata ise analitik lm snrlar iinde grlr. Sistematik hataya, spektrofotometrik lm srasnda rnek absorbansnn analit iermeyen krn absorbansna gre dzeltilmedii durumu rnek olarak gsterebiliriz. Bu durumda hatal olarak analiz edilen rnekte yksek analit konsantrasyonu saptanr. rnek matriksindeki hemoliz gibi interferans oluturan nedenler sistematik hataya neden olur. Sonularn doruluunu etkileyen sistematik hata sertifikal referans (kalite kontrol) materyali kullanlarak gerek deerden sapmann gzlenmesi sonucu, gerekli dzeltici ve nleyici faaliyetlerin yaplmasyla ortadan kaldrlabilir. Sistematik (SE) ve tesadfi hatann (RE) toplam, toplam hatay (TE) verir. TE=SE + RE Deney yntemini kalibre etmekte kullanlan, bilinen miktarda analit ieren zeltilere standart (kalibrant) ad verilir. Deney sonular elde edilen bu kalibrasyon deerlerinden hesaplanr. Deney yntemi bir kez kalibre edildikten sonra, deneyin kesinlik ve doruluu kontroller kullanlarak izlenir. Yntemin kesinlii konsantrasyonla deitiinden; kesinlik lm yaplacak konsantrasyon aralnda, dk, orta ve yksek konsantrasyon dzeylerindeki kontrol materyali kullanlarak test edilmelidir. Kesinlik bir testin ayn sonucu verme yeteneinin, tekrarl lmlerle test edilmesidir. Tekrarl lmler tek bir defada, ya da farkl zaman aralklarnda yaplabilir. Kesinlikle ilgili veri analizi yeni biyoanalitik yntemin geerliliinin test edilmesindeki ilk basamaktr. Eer yntemin kesinlii zayfsa bu durumda yntemin geerliliinin test edilmesiyle ilgili dier deneyler, istenilen kesinlie ulancaya kadar ertelenir. Kesinliin test edilmesinde aadaki eitlikte verilen deiim katsays coefficient of variation %CV deeri kullanlr. Tesadfi hatay (RE) saptamakta kullanlan %CV standart sapmann bykl ile ortalama arasndaki ilikiden etkilenir. Standart sapma (SD) deeri arttka %CV deerinin artt grlr. % CV ve REnin hesaplanmasnda kullanlan eilikler aada verilmitir. %CV=(Standart sapma/ortalama) x 100 RE = 2.58 x SD RE < EA (Allowable error: zin verilebilir hata) durumunda tesadfi hata kabul edilebilir snrlar iindedir Yntemin %CV deeri analizin yapld laboratuardaki ortam koullarndan nemli lde etkilenir. Ortama bal deikenler arasnda reaksiyonun gerekletii scaklk, reaktiflerin kayna, kalitesi ve reaktiflerin pipetlenmesindeki tekrarlanabilirlik saylabilir. Precision almas ayn laboratuarda yaplyorsa intralaboratory study, farkl laboratuarlarda interlaboratory studies yaplana gre daha yksek bir kesinlik deeri beklenir. Laboratuar ii kesinlik almas intraassay (within-run) ve interassay (between-run) olmak zere iki ekilde gerekletirilebilir.

53

Intraassay precision alma ayn lot numarasna sahip reaktifler kullanlarak, kontrol olarak kullanlan rnein analiz sisteminde tek bir kerede allmas esasna dayanr. Interassay kesinlik profili ise kontrol olarak kullanlacak rnein farkl analiz tekrarlarnda, ya da farkl gnlerde allmasyla elde edilir. Interassay kesinlik profili intraassaye gre genellikle daha zayftr. Accuracy (Doruluk) yeni ya da mevcut analitik yntemin doru sonucu verme yeteneidir. Analiz sonucunda gzlenen deer, gerek deere ne kadar yaknsa yntem analitik olarak o kadar dorudur. Yeni yntemin referans yntemle karlatrlabilmesi iin minimun 40 rnekten oluan hasta grubunun her iki yntemle de allmas ve sonularn elendirilmi t-testi ve lineer regresyon analizi gibi istatistiksel metotlarla analiz edilmesi gereklidir. Sabit hata Constant error (CE) bias olarak da adlandrlr. Ayn rnek her iki yntemle alldktan sonra sonular arasndaki fark CE verir. CE=[Y-X] deal olan analitik yntemin interferans ya da apraz-reaktivite olmad takdirde rnekteki analiz edilecek maddenin tamamn %100 verimlilikle saptayabilmesidir. Yntemin doruluunu test etmek iin, standart referans materyal olarak kullanlan rnekteki yksek kesinlik ve doruluktaki analit konsantrasyonlar ile test sonucu elde edilen deerleri karlatrmak gereklidir.

Recovery (Verimlilik)
Recovery almas zerinde allan yntemin, rnekteki analiz edilecek maddenin tamamn lp lmediini anlamak iin yaplr ve yntemin analitik doruluunu anlamamza yardmc olur. rnei oluturan matriksin yapsndaki bileenlerin llecek madde ile oluturduklar kompleksler kimi zaman maddenin tamamnn llmesini engelleyebilir. Standart referans materyal olarak kullanlan rnek yksek derecede saf ve matriks etkisi gstermeyen bir zellie sahiptir. Recovery almasnda hasta rnekleri zerine llecek olan analitten belli miktar ve konsantrasyonda ilave edilir. Baseline (Temel dzeydeki) rnek olarak seilen, llecek olan analiti dk konsantrasyonda ieren hasta rnei zerine saf ve yksek konsantrasyonda bulunan standarttan belli bir miktar ilave edilir. lave edilen hacim hasta rneini 1:10dan daha fazla oranda dile etmemelidir. Aadaki eitliklerden faydalanlarak recovery hesaplamalar gerekletirilebilir. Eklenen konsantrasyon = Standart konsantrasyonu x [mL standart / (mL standart + mL rnek)] Recovery konsantrasyonu = Analit eklenmi rnein konsantrasyonu - Baseline konsantrasyonu % Recovery = (Recovery konsantrasyonu / Eklenen konsantrasyon) x 100 % 95in zerindeki recovery deerleri analitik olarak kabul edilebilir zellik tar. Ortalama recovery hesaplandktan sonra oransal hata proportional error (PE) aadaki eitlikten faydalanlarak hesaplanlabilir. (PE)=[(% Recovery-100) x (Ortalama / 100)]

54

Lineerite (Dorusallk)
Yeni analitik yntemin doruluunun test edilmesindeki ilk basamak lineeritenin kontrol edilmesidir. Lineerite almas istenilen analitik aralk iindeki belirli konsantrasyondaki standartlarn genellikle l olarak allmas esasna dayanr. Grafik gsterim metodunda x eksenine beklenen analit konsantrasyonlar, y eksenine ise gzlenen konsantrasyonlar yerletirilir. Bylelikle analitik araln alt ve st snrlar da belirlenmi olur. Bu noktalardan geen doru eksenlerle 45olik bir a gsteriyorsa yntemin dorusall onaylanr. Matematiksel yntemde ise her standart iin % recovery deeri aadaki eitlikten hesaplanr. % Recovery = (llen konsantrasyon x 100) / Hesaplanan konsantrasyon % recovery %95 deerine eit ya da daha yksek bir deer tayorsa yntemin dorusall kabul edilebilir snrlar ierisindedir.

Sorular ve cevaplar
Soru 1: Gnlk olarak analiz edilen, glukoz iin tansal karar dzeylerindeki kontrol zeltileri A (~120 mg/ dL) ve B ( 300 mg/dL) iin aadaki verileri kullanarak ortalama (X), standart sapma (SD) ve %CV deerlerini hesaplaynz. Tablo 8.1: Kontrol zeltilerinde llen glukoz konsantrasyonlar Kontrol zeltisi A (mg/dL) Kontrol zeltisi B (mg/dL) 118 120 121 119 125 118 122 116 124 123 117 117 121 120 120 119 121 123 120 122 295 308 296 298 304 294 308 310 296 300 295 303 305 300 308 297 297 305 292 300

Cevap: Kontrol zeltisi A __ X= x / n = 2406 / 20 =120.3 ______________ SD= (x xi)2 / n-1 = 2.43 mg/dL
__

%CV=(SD / X) x 100 = (2.43 / 120.3) x 100 = % 2.0 Kontrol zeltisi B

__

X= x / n = 6011 / 20 =300.5 mg/dL _____________ SD= (x xi)2 / n-1 = 5.45 mg/dL

__

%CV=(SD / X) x 100 = (5.45 / 300.5) x 100 =% 1.8 Soru 2: Klinik biyokimya laboratuarnda kullanlacak bir glukoz kitinin prospektsnde yer alan listede 120 mg/dL glukoz konsantrasyonunda standart sapmann (SD) 4e eit olduunu ve farkl glukoz konsantrasyonlarnda SDnin deimedii yazmaktadr. Ayrca bu konsantrasyon

55

deerinde %CVnin %3 olarak hesapland belirtilmektedir. Verilen SD deerinin precision zerine olan etkisini 50 ve 250 mg/dL glukoz konsantrasyonlarnda hesaplayarak aklaynz. Cevap: %CV = (Standart sapma / Ortalama) x 100 %CV = 4 / 50 x 100 = % 1.2 %CV = 4 /250 x 100 = % 6.2 Kitin vermi olduu sonu 50 mg/dL deerinde, %CVnin kk olmas nedeniyle daha yksek bir precision deerine sahiptir. Soru 3: Bir hastaya ait serumun rnei tek bir defada 10 kez allyor. alma sonucu ortalama glukoz konsantrasyonu 119.2 mg/dL, standart sapma ise 2.01 mg/dL olarak hesaplanyor. Intraassay precision ve tesadfi hata deerini hesaplaynz. Glukoz lm iin Clinical Improvement Amendments of 1988 (CLIA-88) izin verilen toplam hata (TE) ya da dier bir ifadeyle izin verilebilen hata (EA) deeri: hedef deer 6 mg/dL deerine eittir. Cevap: %CV = (Standart sapma / Ortalama) x 100 %CV = (2.01 / 119.2) x 100 = 1.7 RE = 2.58 x SD= 2.58 x 2.01 =5.18 RE < EA olduundan tesadfi hata kabul edilebilir dzeydedir. Soru 4: Clinical Improvement Amendments of 1988 (CLIA-88) dzenlemelerine gre potasyum iin izin verilen EA=0.5 mmol/L deerindedir. Kontrol serumu 20 gn sreyle her gn bir kez olmak zere test ediliyor. Elde edilen potasyum sonularnn ortalama ve standart sapma deerleri srasyla 5.5 mmol/L ve 0.07 mmol/L olarak bulunuyor. Tesadfi hatay (RE) hesaplaynz. Bu hata kabul edilebilir snrlar iindemidir? Cevap: RE=2.58 x S=2.58 x 0.07 mmol/L= 0.18 RE<EA olduu iin RE kabul edilebilir snrlar iindedir. Soru 5: Aadaki tabloda verilen recovery verilerinden yararlanarak her bir deney iin ayr, ayr ve ortalama deer olarak % recovery hesaplamasn yapnz. Sonular deerlendiriniz. Deneyler iki farkl konsantrasyon dzeyinde standart kullanlarak, Adan Eye kadar be farkl hasta serumunda gerekletirilmitir. Tablo 8. 2: Recovery deneyi sonular rnek 0.9 mL Serum + 0.1 mL su A B C D E 59 63 76 90 225 0.9 mL Serum + 0.1 mL 500 mg/dL standart 110 112 126 138 270 0.9 mL Serum + 0.1 mL 1000 mg/dL standart 156 160 175 186 320

56

Eklenen konsantrasyon = standart konsantrasyonu x [mL standart / (mL standart + mL serum)] Recovery konsantrasyonu = Analit eklenmi rnein konsantrasyonu Baseline konsantrasyonu % Recovery = (Recovery konsantrasyonu / Eklenen konsantrasyon) x 100 Cevap: Eklenen konsantrasyon = 500 mg/dL x [0.1 mL standart / (0.1 mL standart + 0.9 mL serum)] Eklenen konsantrasyon = 50 mg/dL Recovery konsantrasyonu = Analit eklenmi rnein konsantrasyonu Baseline konsantrasyonu = 110 59 =51 % Recovery = (Recovery konsantrasyonu / Eklenen konsantrasyon) x 100 % Recovery = (51 / 50) x 100=%102 Dier deerler iin % Recovery hesaplamalar benzer ekilde yaplarak aadaki deerler elde edilir. Eklenen konsantrasyon = 50 mg/dL Recovery (%) 102 98 100 96 90 ___ % Recovery %97.2 Ortalama Recovery R=%97 100 mg/dL Recovery (%) 97 97 99 96 95 ___ %96.8

Her iki standart iin ortalama % recovery >%95 olduu iin kabul edilebilir snrlar iindedir. Soru 6: Kalsiyum iin yaplan recovery almasnda rnekler aadaki ekilde hazrlanmtr. rnek 1: 2.0 mL serum + 0.1 mL H2O rnek 2: 2.0 mL serum + 0.1 mL 20 mg/dL kalsiyum standart rnek 3: 2.0 mL serum + 0.1 mL 50 mg/dL kalsiyum standart rnek 1,2 ve 3 iin llen kalsiyum deerleri srasyla 7.50 mg/dL, 8.35 mg/dL, 9.79 mg/dL olarak bulunmutur. % Recovery deerlerini hesaplaynz. Cevap: Eklenen konsantrasyon = 20 mg/dL x [0.1 mL standart / (0.1 mL standart + 2 mL serum)]=0.95 Recovery konsantrasyonu = 8.35 7.50=0.85 % Recovery = (0.85 / 0.95) x 100=%89.47 Eklenen konsantrasyon = 50 mg/dL x [0.1 mL standart / (0.1 mL standart + 2 mL serum)]=2.38 Recovery konsantrasyonu = 9.79 7.50=2.29 % Recovery = (2.29 / 2.38) x 100=%89.47=%96.22

57

Soru 7: Potasyum iin ortalama recovery % 99, ortalama kontrol serumu deeri ise 5.5 mmol/l olarak bulunduuna gre oransal hatay hesaplaynz. EA=0.5 mmol/L Cevap: (PE)= [ (recovery-100) x (ortalama/100)] PE=[ (99-100) x (5.5/100)]=0.05 mmol/L PE < EA olduundan oransal hata kabul edilebilir dzeydedir. Soru 8: Kalsiyum yntemine, ortamdaki magnezyumun interferansn test etmek iin rnekler aadaki ekilde hazrlanmtr. rnek 1: 1.0 mL serum + 0.1 mL H2O rnek 2: 1.0 mL serum + 0.1 mL 10 mg/dL magnezyum standart rnek 3: 1.0 mL serum + 0.1 mL 20 mg/dL magnezyum standart rnek 1,2 ve 3 iin llen kalsiyum deerleri srasyla 9.80 mg/dL, 10.53 mg/dL, 11.48 mg/dL olarak bulunmutur. rnek 2 iin eklenen magnezyumun konsantrasyonunu ve interferans deerini hesaplaynz. Cevap: Eklenen konsantrasyon = standart konsantrasyonu x (mL standart / mL standart + mL serum) Interferans= Analit eklenmi testin konsantrasyonu Baseline konsantrasyonu Eklenen konsantrasyon = 10 mg/dL x (0.1 mL standart / 0.1 mL standart + 1 mL serum)=0.909 Interferans=10.53 9.80 =0.73 Soru 9: Laboratuar yeni glukoz yntemi iin bir dizi lineer standart satn alyor. Standartlar yeni metotla l olarak allyor. Her standart iin almalarn ortalamas alnyor ve sonra % recovery deerleri hesaplanyor. Yntemin dorusalln deerlendiriniz. Cevap: % Recovery aada verilen eitlikten yararlanlarak hesaplanr. % Recovery = (llen deer / Beklenen deer) x 100 Tablo 8.3: Glukoz standartlarndaki llen ve beklenen glukoz deerlerinin recovery zerine etkisi Standart No. Beklenen Glukoz Deerleri llen Glukoz Deerleri % Recovery 1 25 24 96.0 2 60 57 95.0 3 100 96 96.0 4 120 115 95.8 5 250 241 96.4 6 400 390 97.5 Aklama: % Recovery deeri tm standartlar iin %95in stnde olduundan yntem lineerdir.

58

Soru 10: Potasyum iin yntem karlatrma almas yaplyor. Lineer regresyon analizi sonucu elde edilen y=ax + b doru denkleminden y= -0.057 a=1.02 olarak hesaplanlyor. Potasyum iin ortalama kontrol serumu deeri 5.5 mmol/l olduuna gre sistematik hatay hesaplaynz. Toplam hata 0.23 mmol/L olduu durumda, tesadfi hata oran nedir? EA=0.5 mmol/L Cevap: SE=[ (y + a x konsantrasyon) konsantrasyon) ] SE=[ (-0.057 + 1.02 x 5.5) 5.5) ] = 0.053 SE< EA olduundan sistematik hata kabul edilebilir dzeydedir. TE = RE + SE 0.23= RE + 0.053

RE =0.177

59

KAYNAKLAR
Anderson SC, Cockayne S. Clinical Chemistry, Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1993. Bishop ML, Duben-Engelkirk JL, Fody EP. Clinical Chemistry, 4th ed., Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Bisswanger H. Practical Enzymology, 1st ed., Darmstadt: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2004. Burtis CA, Ashwood ER. (eds.) Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1994. Cornish-Bowden A. Basic Mathematics for Biochemists, 2nd ed., Oxford: Oxford University Press, 1999. Kaplan LA, Pesce AJ. Clinical Chemistry Theory, Analysis and Correlation, 5th ed., Missouri: Mosby-ELSEVIER, Inc., 2010. Mikkelsen SR, Corton E. Bioanalytical Chemistry, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., 2004 Pecsok RL, Shields LD. Modern Methods of Chemical Analysis, New York: John Wiley & Sons, Inc., 1968 Pingoud A, Urbanke C, Hoggett J, Jeltsch A. Biochemical Methods,1 st ed., Darmstadt: WileyVCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2002. Stephenson FH. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology, A guide to mathematics in the laboratory, Academic Pres, An Imprint of Elsevier, Amsterdam, 2003. Sutton R, Rockett B, Swindells P. Chemistry for the Life Sciences, 1st ed., London: Taylor & Francis, 2000. Wison K, Walker J. (eds.) Principles and Techniques of Practical Biochemistry, 5th ed., Cambridge: Cambridge University Press, 2000.

60

INDEKS
Absorbans Accuracy Asal hz Aktel kapasite Allowable error Alterrnatif rotor Analit Antibonding molekler orbital AOPP (Advanced Oxidation Protein Products) Avogadro says Basit dilsyon Beer kanunu Beklenen kapasite Berraklatrma faktr Between-run precision Bias Bilimsel sistem Biyoanalitik metot Bonding molekler orbital Coefficient of variation (%CV) Constant error apraz reaktivite znrlk sabiti Dakikadaki absorbans deiimi Dakikadaki dnme says Dalga boyu Dalton Dilsyon faktr Disosiasyon reaksiyonu Disosiasyon sabiti DNA Doruluk Dorusallk Eksitasyon Elektromanyetik dalga Elektromanyetik radyasyon Elektron volt Elementer yk Emisyon Enternasyonal nite Enzim aktivitesi Edeer agrlk Etki deerlilii Faraday sabiti Fiziksel sabitler Flavoprotein Floresans Fotometrik pipet kalibrasyonu

61

Foton Frekans Glutatyon Glutatyon redktaz Greceli santrifj kuvveti Gravimetrik pipet kalibrasyonu Gravitasyon Handerson-Hasselbalch denklemi Hareketli-koval rotor Hemoliz Hidrojen iyonu Hidroksil iyonu Hidronyum iyonu ndikatr elektrot Interassay precision Intercept nterferans Interlaboratory study nternal standart Intraassay precision Intralaboratory study yonizasyon yonizasyon sabiti zin verilebilir hata zopiknik santrifjleme Kalibrant Kalibrasyon Kalitatif metot Kalite kontrol materyali Katal Kesinlik Kloramin-T Koenzim Kristal suyu Kromoforik amino asit bakiyeleri Kuantum Kuvvetli asit Kuvvetli baz Lambert-Beer eitlii Lineerite Lineer regresyon analizi Lineer regresyon denklemi MDA (Malondialdehit) Metrik sistem Molar absorpsiyon katsays Molar ekstinksiyon katsays Molarite Molekl arl NADH NADPH Normalite Ondalk sistem

62

Optimum tamponlama kapasitesi Orijinal rotor Ortalama Ovalbumin zgl arlk Parvalbumin pH pH-metre Pi ba pKa Planck sabiti ppb ppm Precision Promil alkol Protein konsantrasyonu Proton alcs Proton vericisi Random error RCF Reaktif kr Referans elektrolit Referans elektrot Regresyon katsays RNA Rlatif santrifj kuvveti rpm Sabit al rotor Sabit hata Santrifj kuvveti Sedimentasyon Semikantitatif metot Seri dilsyon Sertifikal referans materyali Sr serum albumini (BSA) Sigma ba Singlet durum Sinsoidal dalga Sistem enternasyonal Sistematik hata Spektroflorimetri Spektrofotometri Spesifik absorpsiyon katsays Standart eri Standart konsantrasyonu Standart sapma Stokes kaymas Substrat Speroksit dismutaz Temel enerji dzeyi Tesadfi hata Tetrametoksipropan

63

Tirozin To contain pipetler (TC) To deliver pipetler (TD) Toplam hata Toplam reaksiyon hacmi Triptofan Universal gaz sabiti Vakumdaki k hz Verimlilik Vertikal rotor Within-run precision Yerekimi ivmesi Yzde konsantrasyon Yzde sapma Yzde transmitans Zt spinli durum

64