STANBUL TEKNK NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

MOR HAVU, KONSANTRES, ALGAM SUYU, NAR SUYU VE NAR EKS RNLERNDE ANTOKSDAN AKTVTES TAYN VE FENOLK MADDE PROFLNN BELRLENMES

YKSEK LSANS TEZ

Kimyager Tuba ZTAN

Anabilim Dal: Gda Mhendislii Program: Gda Mhendislii

Tez Danman: Do.Dr. Beraat ZELK

EKM 2006

STANBUL TEKNK NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

MOR HAVU, KONSANTRES, ALGAM SUYU, NAR SUYU VE NAR EKS RNLERNDE ANTOKSDAN AKTVTES TAYN VE FENOLK MADDE PROFLNN BELRLENMES

YKSEK LSANS TEZ Kimyager Tuba ZTAN (506031515)

Tezin Enstitye Verildii Tarih : 26 Ekim 2006 Tezin Savunulduu Tarih : 3 Kasm 2006

Tez Danman: Dier Jri yeleri:

Do.Dr. Beraat ZELK Prof.Dr. Artemis KARAAL (.T.) Prof.Dr. Gldem STN (.T.)

EKM 2006

NSZ Meyve ve sebzeler insan sal zerine yaral etkilerde bulunan antioksidanlarca zengin gdalar olarak bilinmektedir. Antioksidan zellik tamas ile ilgili olarak ise en iyi bilinen maddelerden biri fenolik maddelerdir. Bu Tez almasnda, yksek fenolik ierikleri ile ilgili olarak, taze olarak sklm nar suyu, ticari nar suyu, nar ekisi, mor havu, mor havu suyu konsantresi ve algam suyu gdalar ele alnmtr. Tez almam sresince desteini grdm herkese, ncelikle, danmanlm stlenerek, deerli fikirleri ile beni ynlendiren, ilgi ve desteini esirgemeyen sayn hocam Do.Dr. Beraat ZELKe sayglarm ve teekkrlerimi sunarm. almay destekleyen FLORA projesine (EU 6th Framework Strep Project, Flavonoids and Related Phenolics for Healthy Living Using Orally Recommended Antioxidants) ve bu projenin yrtcs sayn Prof. Dr. Artemis KARAALye teekkrlerimi sunarm. Deneysel almalarm srasnda yardmlarn esirgemeyen Uzman Yksek Gda Mhendisi Nalan DEMR e, arkadam Yksek Gda Mhendisi Seda ERUARa, Ara.Gr. Dilara NLFERe ve Ara.Gr. Nee AHNe teekkrlerimi sunarm. Ayrca, manevi desteini grdm tm dostlarma teekkr bir bor bilirim. Destekleri ve sevgileri ile her zaman yanmda olan, varlklar ile bana gven veren, bugnlere gelmemde byk emek sahibi olan canm anneme, canm babama ve ok sevdiim aabeyim E. Koray ZTANa sonsuz teekkrlerimi sunarm. Ekim, 2006 Tuba ZTAN

NDEKLER

KISALTMALAR TABLO LSTES EKL LSTES ZET SUMMARY 1. GR 2. LTERATR BLGS 2.1. Antioksidanlar 2.1.1. Antioksidanlar ve etki mekanizmas 2.1.2. Antioksidan trleri 2.1.3. Antioksidan aktivitesi lm yntemleri 2.1.3.1. Oksijen radikali absorplama aktivitesi 2.1.3.2. Toplam radikal kapan antioksidan parametresi 2.1.3.3. Toplam oksidan yakalama aktivitesi 2.1.3.4. Kemiluminesans 2.1.3.5. Krosin veya beta karoten aartma metodu 2.1.3.6. Dk younluklu lipoprotein oksidasyonu 2.1.3.7. Demir(III) indirgeyici antioksidan aktivite 2.1.3.8. Bakr(II) indirgeyici antioksidan aktivite 2.1.3.9. TEAC veya ABTS metodu 2.1.3.10.DPPH metodu 2.1.3.11.ndirgeme potansiyeli metodu 2.1.3.12.Linoleik asit emulsiyonu veya demir tiyosiyanat metodu 2.1.3.13.Metal elatlama aktivitesi 2.1.3.14.Folin ciocalteu metodu 2.2. Fenolik Maddeler 2.2.1. Fenolik asitler 2.2.2. Flavonoidler 2.2.2.1. Flavonoidlerin yap zellikleri ve snflandrlmas 2.2.2.2. Antosiyaninler 2.2.2.3. Flavonoidlerin antioksidan aktivitesi 2.2.2.4. Flavonoidlerin gdalarda dalm ii

v vi viii x xii 1 3 3 4 6 6 7 8 9 9 9 10 10 11 11 12 13 13 14 15 18 19 20 21 22 26 26

2.3. Kullanlan Hammaddeye likin Literatr Bilgisi 2.3.1. Mor havu 2.3.2. Mor havu suyu konsantresi 2.3.3. algam suyu 2.3.4. Nar 2.4. Analiz Yntemleri 2.4.1. Flavonoidlerin ekstraksiyon yntemleri 2.4.2. Spektrofotometrik yntemler 2.4.3. Kromatografik yntemler 3. MALZEME VE YNTEM 3.1. Malzeme 3.1.1. Analizlenen gdalar 3.1.2. Kullanlan ekipman ve kimyasallar 3.2. Yntem 3.2.1. rneklerin Hazrlanmas 3.2.2. Ekstraksiyon 3.2.3. Kompozisyon analizi 3.2.4. Toplam fenolik madde analizi 3.2.5. Toplam flavonoid analizi 3.2.6. Toplam antosiyanin analizi 3.2.7. Antioksidan aktivitesi tayin yntemleri 3.2.7.1. DPPH radikali yakalama aktivitesi 3.2.7.2. ABTS radikal katyon yakalama aktivitesi 3.2.7.3. Metal elatlama aktivitesi 3.2.7.4. Linoleik asit emlsiyon sistemi veya demir tiyosiyanat metodu 3.2.7.5. ndirgeme gc 3.2.7.6. Fenolik madde profillerinin belirlenmesi 3.2.8. statistiksel Analiz 4. BULGULAR VE TARTIMA 4.1. Kompozisyon Analizi 4.2. Toplam Fenolik Madde Analizi 4.3. Toplam Flavonoid Analizi 4.4. Toplam Antosiyanin Analizi 4.5. Antioksidan Aktivitesi Analizi Sonular 4.5.1. DPPH radikali yakalama aktivitesi 4.5.2. ABTS radikal katyon yakalama aktivitesi

27 27 28 29 31 32 32 33 33 35 35 35 35 36 36 36 37 37 38 39 39 39 39 40 40 41 42 43 44 44 44 47 49 51 51 53

iii

4.5.3. Metal elatlama aktivitesi 4.5.4. Linoleik asit emlsiyon veya demir tiyosiyanat metodu 4.5.5. ndirgeme gc metodu 4.6. rneklerin Fenolik Madde Profilleri 4.7. Antioksidan Aktivitesi ve Fenolik Madde erii Arasndaki liki 5. SONULAR KAYNAKLAR EKLER ZGEM

55 57 59 61 70 73 76 86 93

iv

KISALTMALAR ABAP ABTS AOA AOK ABS ANT BHT BHT CE CL CUPRAC DPPH EK EGCG FC FRAP GA GAE GC HAT HPLC LDL LPI KMBA ORAC PG SET QE TBHQ TE TEAC TFM TM TOCS TRAP TROLOX TPTZ UV : [2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihidroklorr] : [2,2-azonobis(3-etilbenzothiazoline-6-sulfonat] : Antioksidan aktivitesi : Antioksidan kapasietsi : Absorbans : Antosiyanin : Butillendirilmi hidroksianisol : Butillendirilmi hidroksitoluen : Katein edeeri : Kemiluminesans : Bakr(II) ndirgeyici Antioksidan Aktivitesi : 2,2-Difenil-1-pikrihidrazil : Epikatein : Epigallokatein gallat : Folin-Ciocalteu : Demir(III) indirgeyici antioksidan kapasite Gallik asit : Gallik asit edeeri : Gaz kromatografisi : Hidrojen atom transferine dayanan metot : Yksek performansl sv kromatografisi : Dk younluklu lipoprotein : Lipit peroksidasyon inhibisyonu : Ketomethiobtrik asit : Oksijen radikal absorbans kapasitesi : Propil gallat : Singlet elektron transferine dayanan metot : Kuersetin edeeri : Tersiyer butil hidrokinon : Troloks edeeri : Troloks edeer antioksidan kapasitesi : Toplam fenolik madde : Tanmlanmayan madde : Toplam oksidan yakalama aktivitesi : Toplam radikal kapan antioksidan parametresi : 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil-kroman-2-karboksilik asit : Tripiridiltriazin : Ultraviyole

TABLO LSTES
Sayfa No

Literatrde mevcut baz antioksidan aktivitesi lm yntemlerinin eitli zelliklerine gre snflandrlmas.. Tablo 2.2 Baz meyve ve sebzelerin balca fenolik madde ierikleri....... Tablo 2.3 Baz fenolik maddelerin kimyasal yaps Tablo 3.1 Uygulanan yntemin HPLC koullar......................................... Tablo 3.2 HPLC metodu gradient alama koullar. Tablo 4.1 rneklerin % toplam kuru madde ve % suda znr kuru madde deerleri.. Tablo 4.2 rneklerin pH deeri.................................................................. Tablo 4.3 rneklerin toplam fenolik madde miktar... Tablo 4.4 rneklerin toplam flavonoid madde miktar...... Tablo 4.5 rneklerin toplam antosiyanin madde miktar... Tablo 4.6 rnek ekstraktlarnn EC50 deeri ve Troloks edeeri Tablo 4.7 4.dakikada % ABTS + azalmas ve Troloks edeeri.. Tablo 4.8 10.dakikada % ABTS + azalmas ve Troloks edeeri.. Tablo 4.9 rneklerin metal elatlama aktivitesi.. Tablo 4.10 rneklerin eitli zamanlardaki linoleik asit peroksidasyon inhibisyon yzdesi.. Tablo 4.11 rneklerin askorbik asit edeeri olarak indirgeme gc... Tablo 4.12 Standartlara ait kolonda alkonma sreleri.. Tablo 2.1 Tablo 4.13 Tablo 4.14 Tablo 4.15 Tablo 4.16 Tablo 4.17 Tablo 4.18 Tablo B1 Tablo B2 Tablo B3 Tablo B4 Tablo B5 Tablo B6 Tablo B7 Tablo B8 Mor havu suyu konsantresi ekstraktndaki fenolik bileikler.. Mor havu ekstraktndaki fenolik bileikler. algam suyu ekstraktndaki fenolik bileikler. Taze nar suyu ekstraktndaki fenolik bileikler Ticari nar suyu ekstraktndaki fenolik bileikler... Nar ekisi ekstraktndaki fenolik bileikler... rneklerin fenolik madde varyans analiz tablosu.............. rneklerin fenolik madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas rneklerin flavonoid madde varyans analiz tablosu... rneklerin flavonoid madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas... rneklerin antosiyanin madde varyans analiz tablosu.............. rneklerin antosiyanin madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas.. Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam fenolik madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam flavonoid madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu

16 19 24 42 42 44 44 45 48 49 51 54 54 56 58 60 61 62 64 65 66 68 69 90 90 90 91 91 91 92 92

vi

Tablo B9

Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam antosiyanin madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu

92

vii

EKL LSTES
Sayfa No

ekil 2.1 ekil 2.2 ekil 2.3 ekil 2.4 ekil 2.5 ekil 2.6 ekil 2.7 ekil 2.8 ekil 2.9 ekil 2.10 ekil 2.11 ekil 4.1 ekil 4.2 ekil 4.3 ekil 4.4 ekil 4.5 ekil 4.6 ekil 4.7 ekil 4.8 ekil 4.9 ekil 4.10 ekil 4.11 ekil 4.12 ekil 4.13 ekil 4.14 ekil 4.15 ekil 4.16 ekil 4.17 ekil 4.18 ekil 4.19

: : : : : : : : : : : : : : : : : :

ORAC yntemi ile antioksidan aktivitenin hesaplanmas... Fe(III)- TPTZ + indirgen antioksidan Fe(II) TPTZ... Cu(II)nin antioksidan madde ile Cu (I) e indirgemesi . ABTSnin kimyasal yaps...... DPPH radikalinin kimyasal yaps...... Fenolik asitlerin kimyasal yaps...... Flavonoidlerin C6-C3-C6 iskelet yaps................................. Flavonoid alt gruplarnn temel yaps. Alt temel antosiyaninin kimyasal yaps. Mor havu suyu konsantresi retimi Klasik yntem ile algam suyu retimi... Gallik asit kalibrasyon erisi.................................................... rneklerin toplam fenolik madde miktar........ Epikatein kalibrasyon erisi... rneklerin toplam flavonoid madde miktar... rneklerin toplam antosiyanin madde miktar. Troloks edeeri olarak rneklerin antioksidan aktivitesi... Linoleik asit peroksidasyon inhibisyonunun grafiksel Gsterimi.. : Askorbik asitin indirgeme gcne dayanlarak izilen kalibrasyon erisi : Mor havu suyu konsantresi ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram... : Mor havu suyu konsantresi ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram....... : Mor havu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram... : Mor havu ekstraktna ait 520 nm deHPLC kromatogram ... : algam suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram.. : algam suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC Kromatogram. : Taze nar suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC Kromatogram. : Taze nar suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC Kromatogram. : Ticari nar suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram . : Ticari nar suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC Kromatogram. : Nar ekisi ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram... viii

8 10 11 12 12 20 21 21 23 28 30 45 46 47 48 50 52 58 59 62 62 63 64 65 65 65 67 67 68 69

ekil 4.20 ekil 4.21 ekil 4.22 ekil 4.23 ekil A.1 ekil A.2 ekil A.3 ekil A.4 ekil A.5 ekil A.6 ekil A.7 ekil A.8 ekil A.9 ekil A.10 ekil A.11 ekil A.12

: Nar ekisi ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram : Toplam fenolik madde ierii ve DPPH yntemi ile antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii . : Toplam flavonoid madde ierii ve DPPH yntemi ile antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii.. : Toplam antosiyanin madde ierii ve DPPH yntemi ile antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii.. : (-)- Epikatein standard kalibrasyon erisi... : (-)- Epigallokatein gallat standard kalibrasyon erisi... : Ferulik asit standard kalibrasyon erisi. : Gallik asit standard kalibrasyon erisi...... : (-)- Gallokatein standard kalibrasyon erisi. : (+)- Katein standard kalibrasyon erisi... : Kafeik asit standard kalibrasyon erisi.. : Klorojenik asit standard kalibrasyon erisi.... : P-Kumarik asit standard kalibrasyon erisi... : irinjik asit standard kalibrasyon erisi. : Rutin standard kalibrasyon erisi... : 3,4 dihidroksi benzoik asit standard kalibrasyon erisi....

69 71 71 72 86 86 86 87 87 87 88 88 88 89 89 89

ix

MOR HAVU, KONSANTRES, ALGAM SUYU, NAR SUYU VE NAR EKS RNLERNDE ANTOKSDAN AKTVTES TAYN VE FENOLK MADDE PROFLNN BELRLENMES

ZET Meyve ve sebzeler besleyici olan ve besleyici olmayan kompleks karmlardan oluur. erdikleri yksek fenolik ierie bal olarak meyve ve sebze tketimi ile kanser ve eitli kronik hastalklarn oluumunun azald grlmtr. Fenolik bileiklerin bu yararl etkileri serbest radikalleri yakalamalarndan kaynaklanmaktadr. Son yllarda diyetle alnan antioksidan fenoliklere kar artan bir ilgi grlmektedir. Bu almada yksek fenolik ierikleri ile ilgili olarak, taze olarak sklm nar suyu, ticari nar suyu, nar ekisi, mor havu, mor havu suyu konsantresi ve algam suyu gdalar ele alnmtr. lk olarak fenolik madde ierikleri ve antioksidan aktiviteleri eitli metotlar ile tespit edildikten sonra fenolik madde profilleri HPLC metodu ile belirlenmitir. almada incelenen nar suyu bilinen en iyi doal antioksidanlardan biridir. Antioksidan zelliine olan ilginin artmas ile son zamanlarda nar suyu olduka nem kazanmtr. Literatrde mevcut almalara bakldnda nar suyunun fenolik maddelerden olan hidrolize tanenler ve antosiyaninler asndan olduka zengin olduu bilinmektedir. Bu almada ise taze sklm nar suyu, ticari nar suyu rnekleri, ticari nar ekisi rnei antioksidan aktivite ve fenolik maddeler asndan birbirleri ile karlatrlmtr. almada incelenen mor havucun ise fenolik asitler ve antosiyaninler ierdii bilinmekle birlikte literatrde mor havu ile ilgili mevcut almalar olduka snrldr. Bu almann mor havucun ve algam suyunun antioksidan aktivitesi ve fenolik madde profili ile ilgili olan boluu doldurmak adna faydal olaca dnlmtr. Toplam fenolik madde miktarnn belirlenmesinde Folin-Ciocalteu metodu kullanlmtr. Ayrca flavonoid miktar, kolorimetrik flavonoid analizi ile ve toplam antosiyanin miktar pH-diferansiyel metodu ile belirlenmitir. Antioksidan aktivitesinin belirlenmesinde ise eitli metodlardan yararlanlmtr. DPPH radikal yakalama metodu, ABTS radikal katyonu yakalama metodu, Redktif potansiyel metodu, Linoleik asit emlsiyon sistemi metodu ve Metal elatlama aktivitesi metodlar kullanlmtr. rneklerin fenolik madde profilleri ise HPLC yntemi ile belirlenmitir. rneklerin toplam fenolik madde miktar 1,052-15,5 mg GA/g aralnda bulunmutur. En yksek fenolik madde miktar, mor havu suyu konsantresinde grlrken en dk fenolik madde miktar algam suyunda grlmtr. Toplam flavonoid madde miktar ise 0,05-1,5 mg EK/g aralnda bulunmutur. En yksek flavonoid miktar mor havu suyu konsantresinde grlrken, en dk miktar ise nar ekisinde grlmtr. Toplam antosiyanin madde miktar ise 0,022-7,5 mg

Ant/g aralnda bulunmutur. En yksek antosiyanin madde miktar mor havu suyu konsantresinde grlrken en dk miktar nar ekisi rneinde grlmtr. Toplam fenolik, flavonoid ve antosiyanin miktarlar belirlenen rneklerin bir sonraki aamada farkl metodlar uygulanarak antioksidan aktivitesi belirlenmitir. Toplam fenolik madde miktar olduka yksek olan mor havu suyu konsantresinin antioksidan aktivitesi de llen tm metodlarda olduka yksek gzlenmitir. Bunun yan sra fenolik madde miktar olduka yksek olan taze sklm nar suyu rnei de antioksidan aktivitesi lm metodlarna gre olduka iyi aktivite gstermitir. Ayrca taze sklm nar suyu rneinin ticari nar suyuna gre daha yksek aktivite gsterdii gzlenmitir. Bu durumun nedeni olarak ise ticari nar suyuna uygulanan sl ilemler sonucu fenolik maddelerdeki kayplar ve hammadde farkll ne srlebilir. Son aamada ise rneklerin fenolik madde ierikleri HPLC metodu ile kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmitir. Klorojenik asit, mor havu suyu konsantresinde ve algam suyunda baskn fenolik maddelerden birisi olarak gzlenirken, 3,4 dihidroksi benzoik asit ise mor havu ve mor havu suyu konsantresinde baskn fenolik maddelerden birisi olarak gzkmektedir. Taze sklm nar suyu, ticari nar suyu ve nar ekisi rnekleri ise nemli miktarda (-)- gallokatein, (+)- katein ve kafeik asit iermektedir.

xi

ANTIOXIDANT ACTIVITIES AND PHENOLIC SUBSTANCE PROFILE OF PURPLE CARROT, ITS CONCENTRATE, SHALGAM BEVERAGE, POMEGRANATE JUICE AND SOUR POMEGRANATE CONCENTRATE PRODUCTS

SUMMARY Fruits and vegetables provide a complex mixture of nutrients and nonnutrients. Consumption of fruits and vegetables with the high phenolic content is associated with a decreased of cancer and other chronic diseases. Phenolic compounds may produce their beneficial effect by scavenging free radicals. In the past few years there has been an increasing interest in determining relevant dieatry sources of antioxidant phenolics. In this study, freshly squeezed pomegranate juice, commercial pomegranate juice, sour pomegranate concentrate, purple carrot, purple carrot juice concentrate and shalgam beverage were dealt with their high phenolic content. Firstly, the phenolic contents and antioxidant activity potential were determined by different methods. Then, their phenolic substance profiles were determined by HPLC method. Pomegranate juice is one of the best known natural antioxidant. By increasing interest its antioxidant property it has been attached more importance. According to studies in the literature, pomegranate juice is a rich source of hydrolyzable tannins and anthocyanins. In this study, freshly squeezed pomegranate juice, commercial pomegranate juice, commercial sour pomegranate concentrate were compared with their phenolic substances and antioxidant activity. Although, it is well known that purple carrot contains phenolic acids and anthocyanins, there are limited studies on literature about purple carrot. It was thought that, this study will be useful to reveal antioxidant activity potential and phenolic profile of purple carrot and shalgam beverage. For determination of total phenolic content Folin-Ciocalteu method is used. Furthermore, total flavonoid amount was determined by colorimetric flavonoid analysis and total anthocyanin amount was determined by pH-differantial method. For antioxidant activities determinations different methods were used. For evaluating antioxidant activities; DPPH radical scavenging activity assay, ABTS radical cation decolorisation assay, Reductive potential, Antioxidant activity in linoleic acid emulsion system and Metal chelating activity methods were performed. For determining phenolic profiles of samples, HPLC method was used. The phenolic contents of sample found between 1,052-15,5 mg GA/g. Highest phenolic content observed in purple carrot juice concentrate and lowest phenolic content observed in shalgam beverage. Total flavonoid content found between 0,051.5 mg EC/g. Highest flavonoid content observed in purple carrot juice concentrate and lowest flavonoid content observed in sour pomegranate concentrate. Total xii

anthocyanin content found between 0,022-7,5 mg Ant/g. Highest anthocyanin content observed in purple carrot juice concentrate and lowest anthocyanin content observed in sour pomegranate concentrate. In the next step, antioxidant activities were evaluated with different methods. Purple carrot juice concentrate which have the highest phenolic content, also found highest antioxidant activity for the all methods used. Beside this, freshly squeezed pomegranate juice which had the highest amount of phenolic substances showed good antioxidant activity. Freshly squeezed pomegranate juice also, showed better antioxidant activity than commercial pomegranate juice. This may be explained by loss of phenolic subtances by heat treatment and differences between raw material. In the last step, the phenolic contents of samples were determined by HPLC method. Phenolic substances were defined quantitatively and qualitatively by HPLC. Chlorogenic acid found as one of the dominant phenolic in purple carrot juice concentrate and shalgam beverage. 3,4 dihydroxy benzoic acid found as one the dominat phenolic in purple carrot and purple carrot juice concentrate. Freshly squeezed pomegranate juice, commercial pomegranate juice and sour pomegranate juice contain important amount of (-)- gallocatechin, (+)- catechin, caffeic acid.

xiii

1.GR Meyve ve sebzeler hcre oksidasyonuna kar koruyucu etkisi olan ve gdalarda oksidatif bozulmay nleyen ya da geciktiren bileikler olan antioksidanlarca zengindir. Bu doal maddeler serbest radikalleri toplayarak antioksidan zellik gstermekte ve insan sal zerine yararl etkilerde bulunmaktadr. Diyetsel bir antioksidan reaktif oksijen ve nitrojen trlerinin etkisini gidererek radikal zincir reaksiyonlarn durdurur yada reaktif oksidanlarn oluumunu engeller (tle ve and, 2005; Huang ve di., 2005). Antioksidan zellik tamas ile ilgili olarak en iyi bilinen maddelerden biri fenolik maddelerdir (Madhavi, 1996). Klinik denemeler ve epidemiyolojik almalar, meyve ve sebze tketimi ile kardiovaskler hastalklar, kanser, yalanmaya bal rahatszlklar gibi eitli hastalklarn grlmesinde ters bir korelasyon olduunu gstermektedir (Huang ve di., 2005). Besinsel fonksiyonlar olmamasna ramen, salk zerine olumlu etkilerinden dolay gdalardaki fenolik maddeler ilgi ekmektedir. Meyve ve sebzelerdeki antioksidatif etkiye sahip olan maddeler; polifenoller, flavonoidler, lif, linoleik asidin konjuge izomerleri, gallat, epigallokatein, soya proteini, isoflovononlar, A, B, C, E vitaminleri, tokoferoller, Ca, Se, klorofil, slfitler, kateik, rik asit ve proteaz inhibitrleridir. Fenolik bileiklerin antioksidan etkileri serbest radikalleri balamalar, metallerle elat oluturmalar, baz enzimleri inaktive etmeleriyle aklanmaktadr (tle ve and, 2005; Yang ve Tsao, 2003). lkemizde olduka nemli retim kapasitesine sahip olan mor havu ve nar gibi bitkisel gdalar ve bunlardan elde edilen baz ticari rnler fenolik madde ierii ve antioksidan aktivite asndan olduka nem tamaktadr. Orta Asya orijinli bir bitki olan mor havu, lkemizde ukurova yresinde

kullanm yaygn olan algam suyunun hammaddesidir. Bilimsel olarak da kantlanm faydalarnn en nemli kayna mor havua rengini veren fenolik

maddelerden

antosiyanin pigmentlerinin antioksidan zelliinden gelmektedir

(Krca ve di., 2005). Nar ise Trkiye, ran, Amerika, Ortadou, Akdeniz ve Arap lkelerinde yetien gney dou asya orijinli bir meyvedir. Yenilebilir ksm nemli miktarlarda, asit, eker, polisakkarit, vitamin ve polifenol iermektedir. Nar suyunun potansiyel antioksidatif zellikte olduu rapor edilmitir (Maskan, 2004). Floridada yaplan kardiyoloji konferansnda narda bol miktarda, C vitamini demir ve potasyum olduu ve 1 bardak nar suyunun antioksidan zelliinin 10 bardak yeil ay ile ayn seviyede olduu rapor edilmitir. Ayrca nar suyunun antioksidan zelliinin narda bulunan polifenol, tanen ve antosiyanin gibi fenolik maddelerden ve ierdii C vitamininden kaynakland belirtilmitir. Antioksidan miktarnn krmz arap, kzlck ve portakal suyuna gre kat daha fazla olduu ve bir bardak nar suyunun, iki kadeh krmz arap, 10 bardak yeil ay ve drt bardak kzlck suyu ile ayn seviyede olduu belirtilmitir (Anon 1, 2006). Bu almann amac mor havu, mor havu suyu konsantresi, algam suyu, nar

suyu ve nar ekisi gibi fenolik maddelerce zengin olan bu geleneksel gdalarmz da antioksidan aktivitesinin ve fenolik madde profilin belirlenmesidir. alma temel olarak iki blmden olumaktadr ilk ksm toplam olarak fenolik maddelerin miktar tayini ve farkl metotlar uygulanarak antioksidan aktivitesinin belirlenmesi ikinci ksm ise yksek basnl sv kromatografisi (HPLC) yntemi ile rneklerin ierdii fenolik maddeleri tek tek tanmlamaya almak ve bunlar kalitatif ve kantitatif olarak incelenmekten olumaktadr. alma; giri blmn takiben, antioksidanlar, fenolik maddeler, kullanlan hammadde ve analiz yntemlerini kapsayan literatr bilgisi, kullanlan malzeme ve yntemler, bulgular ve tartma, sonular, kaynaklar listesi ve son olarak ekler eklinde hazrlanmtr.

2. LTERATR BLGS 2.1. Antioksidanlar Geleneksel tanm olarak antioksidan oksidasyona kar koyan, oksijen yada peroksitlerle ilerleyen reaksiyonlar engelleyen maddedir. Bu maddelerin ou eitli rnlerde koruyucu olarak kullanlmaktadr. Daha biyolojik olarak ise antioksidan madde, havann oksijeni ile bozulan rnlere ilave edilerek bu bozulmay engelleyen veya geciktiren sentetik veya doal madde olarak tanmlanmaktadr. Gda endstrisinde antioksidanlar geni bir alana sahiptir. Oksijen ve nitrojen gibi reaktif trlerin insanlardaki normal fizyolojik fonksiyonlar zerindeki ters etkilerini olduka nemli ekilde azaltan diyetsel antioksidanlardan, yalarn bozunmasn engelleyen maddeler ieren antioksidanlara kadar geni bir kullanma sahiptirler (Huang ve di., 2005). Temel antioksidan kaynaklar drde ayrlmtr (Prior ve di., 2005). 1- Enzimler; Speroksit dismutaz, peroksidaz, katalaz 2- Byk molekller; Albumin, Ferritin ve dier proteinler 3- Kk molekller; Askorbik asit, urik asit, tokoferol, karetonoidler, polifenoller (Epigallokatein, epigallokateingallat, epikatein, katein, kafeik asit, klorojenik asit, gallik asit, ferulik asit, kumarik asit vb) 4- Baz hormonlar; strojen, melatonin vb Antioksidanlarn yks serbest radikallerle balamaktadr. Serbest radikaller ve reaktif karakterli maddeler ile bu maddeleri reten tm faktrler oksidan veya prooksidan olarak tanmlanmaktadr (zyurt, 2005). Serbest radikaller ve oksidanlar ise yle tanmlanmaktadr; d orbitallerinde bir ya da daha fazla elememi elektron bulunan, ksa mrl, reaktif atom veya molekllerdir. Serbest radikaller, radikal olmayan bir atom veya moleklden bir

elektron kmasyla veya radikal olmayan bir atom veya molekle bir elektron ilavesiyle oluurlar (Karafakolu, 2004). Radikaller elektrik yk olarak; pozitif, negatif ya da ntr olabilirler. Bir serbest radikaldeki elenmemi elektron, herhangi bir kimyasal ba iinde bir baka elektronla spin paylamadndan, radikaller, ekstra elektronlar baka atomlara lokalize oluncaya yada elektron alncaya dek olduka reaktiftir. Ar reaktif bu maddeler dier atom ve molekllerle elektron alveriine girerek, onlarn kimyasal yaplarn deitirip kararsz (reaktif) bir atom haline getirme eilimindedirler (Karafakolu, 2004). Oksijenden treyen baz reaktif oksijen trleri ise O2-. (Speroksit) radikali, H2O2 (Hidrojen peroksit), HO. (Hidroksil) radikali, HOCl (Hipoklorz asit), Singlet O2 (O2), R. (Alkil radikali), ROO. (Peroksil radikali), RCOO. (Organik peroksit radikali), eklinde sralanabilmektedir (Huang ve di., 2005; 2005; Prior ve di., 2005; Naczk ve Shahidi, 2004). Hcre ii ortamda oluan serbest radikaller, nemli hcresel yap ve bileiklere etki ederler. Proteinler ve DNA; hcrede zarar gren nemli hedeflerden bazlar gibi gzkmektedir. Biyolojik sistemlerde, serbest radikalin saldraca dier bir hedef de hcre membranndaki lipitlerdir (Naczk ve Shahidi, 2004). 2.1.1. Antioksidanlar ve Etki Mekanizmas Antioksidanlar hidrojen atomu verme kabiliyetine sahip kimyasal bileenlerdir.

Bylelikle, birincil radikalleri radikal olmayan kimyasal trlere evirerek, okside olmu antioksidan radikallere dnrler. Antioksidanlarn molekl yaps sadece hidrojen atomu verme asndan deil, ayn zamanda radikalleri dk reaktiviteli hale getirip lipitler ile reaksiyona girmesini engellemesi asndan da olduka uygundur (Madhavi, 1996). Antioksidan etki mekanizmas basite aada gsterildii gibidir. Balama: Gelime: Sonlanma: ROO + AH ROOH + A ROO + A ROOA A + A A-A

Sistemdeki etkin mekanizma antioksidan yaps, zellikleri ile znrlk partisyon katsays ve sistemde kullanlan zgen gibi etkenlerle belirlenir. Ba disosiyasyon enerjisi (BDE) ve iyonizasyon potansiyeli (IP) mekanizmay ve antioksidan etkinliini belirleyen en nemli iki faktrdr (Prior ve di., 2005). 4

Her bir oksidan ve antioksidan farkl kimyasal ve fiziksel karaktere sahiptir. Her bir antioksidan reaksiyon sistemine bal olarak oklu mekanizmalar ile yada farkl bir tekli mekanizma ile rol alr. Ayrca antioksidanlar, farkl radikal yada oksidan kaynana kar farkl karlk verirler. rnein; Karotenoidler, fenoller ile kyaslandnda peroksil radikallerine kar iyi radikal yakalaycs deildirler. te yandan singlet oksijene kar fenolik ve dier antioksidanlar neredeyse etkisiz kalrken karotenoidler iyi bir radikal giderici etkiye sahiptir (Prior ve di., 2005). Antioksidanlar iki tiptedir; 1- Birincil veya zincir krc antioksidanlar 2- kincil veya nleyici Eser miktarlarda bulunan birincil antioksidanlar, peroksil radikalleri ile reaksiyona girerek bunlarn doymam lipit moleklleri ile reaksiyona girmesini engeller ve bylelikle daha kararl rnlere dnmesini salar. kincil antioksidanlar ise eitli mekanizmalar ile zincir balatc reaksiyonlar geciktirir. Lipit otooksidasyon orann azaltan ikincil antioksidanlarn etkisi metal iyonlarn balama, oksijen yakalama, UV absorblama ve singlet oksijeni inaktif hale getirme eklindedir. Etkili olabilmeleri iin, genellikle metal iyonlar, indirgenme ajanlar, tokoferoller, veya dier fenolikler gibi ikincil bir komponentin varlna ihtiya duyarlar (Madhavi, 1996). kincil oksidanlar antioksidan sinerjistleridir. Bu antioksidanlarn sinerjistik etkileri ortamda bulunan dier birincil antioksidanlara baldr. Ortamda primer antioksidanlar bulunmad durumda antioksidan aktiviteleri ok dktr veya antioksidan aktivite gstermezler. rnein askorbik asit, ortamda fenolik maddelerin bulunmas ile sinerjistik etki gsterir (Hudson, 1990). Antioksidan aktivitesi fiziksel faktrler, substrat faktrleri, gda maddesinin fizikokimyasal durumu gibi eitli faktrlere bal olarak deiklik gsterir. Fiziksel faktrler; oksijen, scaklk ve konsantrasyondur. Yksek oksijen basnc, oksijenle temas yzeyinin genilii, stma ve nlama gibi durumlar zincir reaksiyonunun balama ve yaylma basamaklarn hzlandrdndan antioksidan aktivite azalacaktr. Farkl scaklklarda ise antioksidan aktivitesi deiiklik gsterir. Antioksidan aktivitesi konsantrasyonun ykselmesi ile artar. Oksidasyonun yeterli bir derecede engellenebilmesi iin konsantrasyon belli bir kritik deerin zerinde olmaldr (Pokorny ve di., 2001).

2.1.2. Antioksidan Trleri Antioksidanlar doal ve sentetik olmak zere iki gruba ayrlmaktadr. ou sentetik antioksidan fenolik yapdadr. Antioksidan aktivitesi arasndaki farkllk kimyasal yap ile alakaldr. Ticari olarak mevcut olan ve gnmzde kullanlan sentetik antioksidanlar butillendirilmi hidroksianisol (BHA), butillendirilmi hidroksitoluen (BHT), tersiyerbutil hidrokinon (TBHQ) ve propil gallat (PG) dir. Doal antioksidanlar, bitki ve hayvan dokularnda bulunan ve ekstrakte edilebilen yada gdann ilenmesi srasnda aa kan bileenlerdir. En nemli doal antioksidanlar, tokoferoller, flavonoidler, fenolik asitler, vitamin C, karotenoidler, polifenoller ve selenyumdur. Son zamanlarda gda kimyas ve koruyucu tbbn bitki kaynakl doal antioksidanlara kar ilgisi artmaktadr. Bunu nedeni sentetik antioksidanlarn (BHA, BHT, gibi) kanserojen olduklarnn dnlmesidir (Madhavi, 1996). 2.1.3. Antioksidan Aktivitesi lm Yntemleri Antioksidanlarla ilgili yaymlanan bilimsel makalelere bakld zaman antioksidan kapasitesini tarif etmek iin farkl aratrmaclar tarafndan bir ok farkl terim kullanld grlr. Toplam antioksidan kapasitesini ieren bu terimler, etkinlik, g parametre, potansiyel ve aktivite gibi terimlerdir. Kimyasal aktivite spesifik reaksiyon koullarndaki basn, scaklk, reaksiyon ortam gibi etkenlere baldr. Bu nedenle antioksidan aktivitesi o reaksiyon koullarndaki lm yanstr. Yukarda belirtilen dier terimler ise spesifik reaksiyondan daha bamszdr (Huang ve di., 2005). Antioksidan aktivitesi ise bir bileenin Lissi, 2005). Gnmzde antioksidan aktivitesi lmleri iin birok farkl yntem mevcuttur. Bu yntemler genellikle serbest radikalleri iermektedir. Reaktan olarak kullanlan serbest radikalin zelliine bal olarak farkl sonular elde edilebilmektedir (Prakash, 2001). Gda bileimlerinin karmak yapsndan dolay her bir antioksidan bileeni ayrmak ve zel olarak bu bileenle almak hem yeterince etkili deildir hem de olduka oksidatif degredasyonu (rnein; lipit peroksidasyonunu) nleme kabiliyeti olarak tanmlanr (Roginsky ve

masrafl bir yntemdir. Tm bu nedenlerden tr, hzl ve uygun bir antioksidan tayin yntemi bulma almalar olduka nem kazanmtr (Huang ve di., 2005). Antioksidan aktivitesi analizleri iin literatrde mevcut almalara bakldnda kullanlan radikal kaynana, reaksiyon mekanizmasna vb zelliklere gre eitli gruplandrmalar grlmektedir. Balca antioksidan aktivitesi analizleri, kimyasal reaksiyon mekanizmasna gre kabaca iki kategoriye ayrlabilir. 1-Hidrojen Atom Transferine Dayanan Metot (HAT): Antioksidan kapasitesi (AOK), Serbest radikallerin antioksidan maddenin hidrojeni ile etkisiz hale gelmesinin llmesi ile tayin edilir 2- Singlet Elektron Transferine Dayanan Metot (SET): Potansiyel antioksidanlarn elektron transfer etmesi ile metal, karbonil ve radikal ieren bileiklerin indirgenmesine dayanan metotdur (Prior ve di., 2005). 2.1.3.1. ORAC: Oksijen Radikali Absorplama Aktivitesi (Oxygen Radical Absorbance Capacity) Bu metot Cutler ve Cao tarafndan gelitirilmitir (Huang ve di., 2005). ORAC ynteminde oksidasyon sonucu oluan peroksil radikallerinin, antioksidan madde tarafndan inhibe edilmesi llr. Klasik radikal zincir krma reaksiyonlarndan oluur. Hidrojen atomu antioksidan madde tarafndan radikale transfer edilir. Bu yntemde AOK yle llr: Peroksil radikalleri floresans bir madde (prob) ile reaksiyon vererek floresans zellikte olmayan bir rn oluturur. rnn orannda ve miktarndaki azalma ile belirlenir (Prior ve di., 2005). ROO + Prob ROOH + okside olmu prob (floresans iddetini kaybetmi) ROO + AH ROOH + A ROO + A ROOA ORAC ynteminde antioksidan kapasitesi blank ve rnek arasndaki floresans iddeti farkndan (net alandan) yararlanarak hesaplanmaktadr. ekil 2.1de antioksidan aktivitesinin nasl hesapland gsterilmitir. Floresans spektrofotometre ile miktar tayini yaplr. Antioksidan kapasitesi zamanla bu oluan

ekil 2.1: ORAC yntemi ile antioksidan aktivitenin hesaplanmas ORAC metodu gda ve fizyolojik sistemlerde peroksil radikalinin kontroln salar. Metot zgen ve radikal kayna deitirilerek hidrofilik ve hidrofobik sistemlere uyarlanabilir. Ancak analiz sresinin uzun olmas (yaklak 1saat) metot seiminde snrlayc etkenlerden biridir (Prior ve di., 2005). 2.1.3.2. TRAP: Toplam Radikal Kapan Antioksidan Parametresi (Total Radical Trapping Antioxidant Parameter) Bu metot antioksidan maddenin, AAPH veya ABAP bileeninden oluan peroksil radikalleri ile prob madde arasndaki reaksiyona engel olmasna dayanr. Reaksiyon gzlemlenerek bileenin antioksidan kabiliyeti belirlenir. Oksijen kayna olarak farkl metotlar kullanlabilir. R-phycoerythin floresans veya ABTS absorbans reaksiyon prob maddesi olarak kullanlr (Prior ve di., 2005). R-PE ve AAPH arasndaki reaksiyonun ilerlemesi florometrik olarak 495 ve 575 nm de izlenir (Huango ve di., 2005). Antioksidan aktivitesi; zamanla antioksidanlarn tkenmesi yani okside olmu prob maddenin grlme sresinin uzamas veya reaksiyon yzdesinin azalmas ile belirlenir. TRAP genellikle Troloksa tekabl eden sre ile karlatrlarak verilir. TRAP metodu glutathione, askorbik asit, tokoferol, beta karoten gibi enzimatik olmayan antioksidanlar ltnden ounlukla serum ve plazmada in vivo olarak antioksidan kapasitesini lmek amac ile kullanlr (Prior ve di., 2005).

2.1.3.3. TOCS: Toplam Oksidan Yakalama Aktivitesi (Total Oxidant Scavenging Capacity) Bu metot hidroksil- peroksil ve peroksinitril radikallerine kar antioksidan reaksiyonunun absorbans lmne dayanr. Keto-&-methiobtrik asit (KMBA) substrat okside olarak etilen oluturur. Oluan etilen ise GC head space analizi ile belirlenir. Antioksidan kapasitesi ise; antioksidan maddenin etilen oluumunu inhibe etmesi ile llr. Burada kontrol reaksiyonuna kar greceli olarak antioksidan maddenin etilen oluumunu inhibe etmesine baklr (Prior ve di., 2005). 2.1.3.4. CL: Kemiluminesans (Chemiluminescence) Bu metot radikal oksidanlarn iaretleyici bileenlerle reaksiyon vererek uyarlm duruma gemesi ve bylelikle kemiluminesans yaymasna dayanr. Balatc radikallerle reaksiyona giren herhangi bir molekl k oluumunu engeller. Antioksidan kapasite k emisyonunun zamanla azalmasna dayanlarak llr. kemiluminesans ok dk emisyon iddeti ile karakterize edilir. aretleyici olarak ise en yaygn olarak kullanlan bileik luminoldr (Prior ve di., 2005). 2.1.3.5. Krosin veya Beta Karoten Aartma Metodu (Crocin or -karotene Bleaching Methot) Beta karoten renk kayb, linoleik asitin s etkisi ile otooksidasyonu sonucu oluan hidroperoksitlerin meydana getirdii bir serbest radikal reaksiyonudur. Bu yntemde, linoleik asit, karoten ve antioksidan ieren bir sistem oluturulur. Is veya k etkisi ile oksidasyon yada otooksidasyona urayan karotenoidlerin renginde aarma gzlenir. Oksidasyon sonucunda peroksil radikali oluur. Bu sistemdeki karotenin oksidatif ykm sonucu oluan renk kayb kolorimetrik olarak 470 nm de llr. Karotenodilerdeki bu renk almas antioksidan maddenin hidrojeninin, radikali yakalamas ile azalabilir yada nlenebilir (Prior ve di., 2005; Hudson, 1990). ounlukla hedef olarak -karoten kullanlmasna karn 470 nm de -karoten dekolarizasyonu bir ok aamadan getiinden sonularn yorumlanmas komplike olabilir. Buna karn Krosin doruca reaksiyona girer ve sadece radikal oksidasyonu ile dekolarize olur. Bu nedenle reaktant olarak -karotene tercih edilebilir (Prior ve di., 2005). Krosinin serbest radikal oluturucu AAPH tarafndan rengi alr. Antioksidan

madde ise serbest radikal ile reaksiyona girerek bu renk deiimini engeller. 9

Reaksiyonun ilerleyii UV-Vis spektrofotometre ile 443 nm de izlenir (Huang ve di., 2005). Krosin-H (portakal rengi) + ROO Krosin(aarm)+ROOH

Krosin-H (portakal rengi)+ROO + AH Krosin + ROOH+A 2.1.3.6. LDL: Dk Younluklu Lipoprotein Oksidasyonu (Low Density Lipoprotein Oksidasyonu) Antioksidan lm iin LDL nin ex vivo (canl dnda) oksidasyonunu lmeye dayanan, bu metot lionelik asit veya LDL otooksidasyonunu Cu(II) veya azo bir balatc ile suni olarak azaltlmasn ler (Huang ve di., 2005). Ayn zamanda LDL oksidasyonu uygulamalar ile fizyolojik sistemlerdeki antioksidan kapasitesi hakknda deer biilebilir. Bu metotda grlen oksidatif reaksiyonlar canlda grlen oksidatif reaksiyonlarla ilikilidir (Prior ve di., 2005). Otooksidasyon 234 nm de UV absorbans ile izlenir (Linoleik asit oksidasyonu ile oluan konjuge dien peroksitler 234 nm de maksimum absorbansa sahiptir) (Huang ve di., 2005). 2.1.3.7. FRAP: Demir (III) ndirgeyici Antioksidan Aktivite (Ferric Reducing Antioxidant Power) Bu metotda Fe(III) tripiridiltriazin (TPTZ) kompleksinin antioksidanlar varlnda renkli Fe(II) elatna indirgenmesinden yararlanmaktadr (ekil 2.2) (Apak, 2005). Reaksiyon bileenleri 0-7 V redoks potansiyelde dedekte edilir. 0.7 V= ( Fe+3-TPTZ redoks potansiyeli) (Prior ve di., 2005).

ekil 2.2: Fe(III)- TPTZ + indirgen antioksidan iddetli mavi renk)

Fe(II) TPTZ (595 nm de

10

Reaksiyon sresi ksadr (yaklak olarak 4 dk) ancak baz polifenoller daha yava reaksiyon verebilirler. FRAP sadece ferrik iyonlar indirgeyebilen maddeleri ler. (Prior ve di., 2005). 2.1.3.8. CUPRAC: Bakr(II) ndirgeyici Antioksidan Aktivitesi FRAP metodunda kullanlan demir yerine burada bakr metali kullanlr. Bu metot antioksidan maddenin Cu(II)yi Cu (I)e indirgemesine dayanr (ekil 2.3) (Prior ve di., 2005).

ekil 2.3: Cu(II) nin antioksidan madde ile Cu (I) e indirgemesi Bathocuprione ve Neocuproine Cu(I) ile 2:1 orannda birleerek renkli bir

kompleks oluturur. Bathocuprione (2,9-dimetyl-4,7-diphenyl-1,10 phenanthroline) ve Cu (I) ile 490 nm de gzlenen bir kromofor oluturur. Neocuproine (2,9dimethyl-1,10 phenanthrolin) de 450 nm de lara yakn olan pH=7 ortamnda yrtlmesi gzlenen bir kromofor absorbans dolays ile fizyolojik koullar llr (Prior ve di., 2005). Metodun en nemli avantajlarndan biri fizyolojik pH yanstma olaslnn daha fazla olmasdr (Apak, 2005). 2.1.3.9. TEAC veya ABTS Metodu TEAC analizi ilk olarak Miller ve Rice-Evans tarafndan 1993 te rapor edilmitir. Daha sonralar ise bu metot gelitirilmitir (Huang ve di., 2005). Bu metotta ABTS [2,2-azonobis(3-etilbenzothiazoline-6-sulfonat] peroksil veya

dier oksidanlara okside olur ve ABTS+ radikal katyonu oluur. Oluan ABTS radikal katyonu olduka iddetli bir renge sahiptir. Antioksidan kapasite, test bileeninin ABTS+ radikal katyonu ile direkt olarak olarak reaksiyona girmesi ile renk iddetindeki azalma llerek belirlenir (Prior ve di., 2005). 1 mM deneysel rnein absorbansta yapt deiim kadar deiim yapan Troloks konsantrasyonu

11

TEAC (Troloks edeer antioksidan kapasite) (Huang ve di., 2005).

deeri olarak

tanmlanmaktadr

ekil 2.4: ABTS nin kimyasal yaps ABTS+ radikal katyonundaki azalma denklem 2.1de verilmitir (Wettasnghe ve di., 2002). % ABTS+ azalmas = [(Absbalang-Absson)/ Absbalang] x 100 (2.1)

ABTS + radikal katyonu 415, 645, 734, 815 nm de maksimum absorpsiyona sahiptir. Bunlardan 415 ve 734 nm bir ok aratrmac tarafndan ABTS+ radikal katyonu ve antioksidan arasndaki reaksiyonu spektrofotometrik olarak gzlemlemek iin seilmitir (Prior ve di., 2005). TEAC yntemi kullanlmas basit ve kolay ve hzl olduundan bir ok labaratuarda AOK tayininde yntemdir (Huang ve di., 2005). 2.1.3.10. DPPH Metodu DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) serbest radikal yakalama ynteminde, kararl ve sentetik bir radikal olan DPPH kullanlr ve antioksidann bu serbest radikali yakalama yetenei llerek antioksidan aktivite tanmlanr (Pokorny ve di., 2001) sklkla tercih edilen bir

ekil 2.5: DPPH radikalinin kimyasal yaps Antioksidan-DPPH radikali reaksiyon mekanizmas aada olduu gibidir. DPPH . + Antioksidan-H DPPH-H + A.

12

DPPH, koyu mor renkte bir radikaldir. Antioksidandan bir proton alarak renksiz ,difenil--pikrilhidrazil moleklne dnr. Antioksidan madde tarafndan indirgenmesi sonucu rengi alr. En yaygn olarak kullanlan dekolarizasyon test metodu 515-517 nm de DPPHin antioksidan madde ile reaksiyonunun absorbansnn llmesidir (Pokorny ve di., 2001; Huang ve di., 2005). DPPH analizinde genellikle belirli miktarda DPPH zeltisi ve rnek zeltisi kartrldktan 30 dk yada absorbans sabit oluncaya kadar geen sre sonra 515 nm de absorbans okunur. ndirgenme reaksiyonu boyunca devam eder (Huang ve di., 2005). Kalan DPPHin hesaplanmas denklem 2.2de verilmitir. %DPPH kalan=100 X [DPPH] / [DPPH] to (2.2) zeltinin rengi solmaya

Kalan DPPH antioksidan konsantrasyonu ile orantldr ve balang DPPH konsantrasyonunun yarya indii durumdaki antioksidan konsantrasyonu EC50 olarak verilir DPPH metodu basit ve hzl olduundan antioksidan aktivitesi belirlemede sklkla kullanlr (Prior ve di., 2005). 2.1.3.11. ndirgeme Potansiyeli Metodu Serbest radikalleri yakalama aktivitesi esasna dayanan dier yntemlerden biri olan indirgeme potansiyeli metodunda yksek absorbans, yksek indirgeme potansiyelini gsterir. Bu metotda antioksidan maddenin Fe(III) iyonlarnn indirgeme gcne bal olarak antioksidan aktivite belirlenir. Potasyum ferrisiyanid [K3Fe(CN)6] maddesindeki antioksidan reaksiyon sistemi iersinde Fe(II) iyonlarna indirgenmesi 700 nm de llerek antioksidan aktivite belirlenir. Yksek absorbans deeri yksek indirgeme potansiyelini gsterir. Sonular askorbik asit edeeri olarak verilir (Mathew ve Abraham, 2006 ). 2.1.3.12. Linoleik Asit Emlsiyonu veya Demir-Tiyosiyanat Metodu Oksijenin alkil radikallerle reaksiyonu sonucu oluan peroksil radikalinin olduka iyi bir oksidasyon ajan olduu bilinmektedir. Bu radikal dk redksiyon potansiyeli sayesinde hidrojeni dier molekllerden eker ve reaksiyon genellikle lipit peroksidasyonunun ilerleme safhasnda grlr. Hcre membranlar ise lipit peroksidasyonunun direkt hedefidir. Linoleik asit emlsiyonuna kar antioksidan

13

zellii gsteren maddeler lipit peroksidasyonunu belirli oranlarda inhibe edebilmektedirler (Siddhuraju ve Becker, 2006). Bu metot ile linoleik asitin antioksidan madde varlnda ve antioksidan madde olmad durumda okside olma derecesi belirlenerek antioksidan aktivitesi llr. Linoleik asit ve antioksidan madde ieren bir sistem oluturulur ve antioksidan maddenin lipit peroksidasyonunu inhibe etme derecesi (LPI) antioksidan aktivitesinin bir gstergesi olarak kabul edilir. Lipit peroksidasyonunu inhibe etme yzdesi denklem 2.3de verilmitir (Mathew ve Abraham, 2006). %LPI= 100 -[Absrnek / Abskontrol) x 100] 2.1.3.13. Metal elatlama Aktivitesi Yaamamz iin temel elementlerden biri olan demir, ayn zamanda lipit, protein ve dier bileenlerle istenmeyen oksidatif reaksiyonlara neden olabilmektedir. Ayrca demir fenton reaksiyonlar sonucunda serbest radikal oluturma kabiliyetindedir. Bu nedenle Fenton reaksiyonlarondaki Fe+2 konsantrasyonunun azalmas ile oksidatif hasara kar koruyucu etki grlmektedir (Rival ve di., 2001). Gei metalleri ierisinde Fe+2 iyonlarnn yksek reaktivitesinden dolay lipit oksidasyonuna yol aan en nemli pro-oksidan olduu bilinmektedir (Glin, 2005). Fenton reaksiyonu: Fe+2 + H2O2 Fe+3 + HO . + HOMetal elatlama zellii olan antioksidan maddeler serbest demiri balamak suretiyle onu etkisizletirler ve bylece fenton reaksiyonlar sonucu oluan hidroksil ve peroksit gibi radikal oluumunu inhibe ederler. Bu nedenle metal elatlama zellii antioksidan aktiviteyi belirlemede nemli rol oynamaktadr (Arora ve di., 1998). Bir baka deyile, metal elatlama aktivitesi, ortamda bulunan Fe2+ iyonlarnn inhibisyonuna dayanr. Aktivite kendini elat ajanlarnn demir iyonlarn elatlamas sonucu krmz renkteki azalmayla gsterir. Metal elatlama aktivitesi lipit peroksidasyonundaki katalize olmu gei metallerini indirgedii iin nem tamaktadr. elatlama ajanlar redoks potansiyelini indirgeyerek metal iyonlarnn oksidasyonunu stabilize edebilirler. Bu nedenle elatlama ajanlar ikincil (2.3)

14

antioksidanlardr. Yzde elatlama aktivitesi denklem 2.4de verilmitir (Mathew ve Abraham, 2006). % elatlama Aktivitesi= [1- Absrnek / Abskontrol] X100 2.1.3.14. Folin Ciocalteu (FC) Metodu: Toplam Fenol Metodu Gdalarn ieriinde bulunan toplam fenolik madde miktarnn belirlenmesi, antioksidan aktiviteyi salayan hidroksil gruplar hakknda fikir vermesi asndan nemlidir. FC metodu doal rnlerde toplam fenolik madde lm iin kullanlmaktadr. Ancak ayn zamanda temel mekanizma oksidasyon redksiyon reaksiyonlarna dayand iin dier bir AOK metotlarndan biri olarak kullanlabilir. Genellikle toplam fenol ierii ve antioksidan aktivitesi arasnda olduka iyi bir lineer korelasyon grlr (Huang ve di., 2005; Prior ve di., 2005). FC reaktant ile fenolik maddelerin okside olmas sonucu 745-765 nm de gzlenebilen renkli bir rn oluur (Prior ve di., 2005). Fenolik olmayan maddeler tarafndan da indirgenebilen FC reaktant sadece (2.4)

fenoliklere kar spesifik deildir. Fenolik bileenler FCR ile baz artlar altnda reaksiyon verirler sodyum karbonat ile pH yaklak 10 a ayarlanr. Fenolik protonlarn disosiyasyonu ile fenolat anyonu oluur ve buda FCR yi indirgeyebilme zelliine sahiptir. Fenolat anyonu ve FCR reaksiyonundan oluan mavi renkli bileen fenolik maddenin yapsndan bamszdr (Huang ve di., 2005). Bu metot basit, duyarl ve kesinlii yksek bir metotdur. Ancak reaksiyon asidik pH ta yavatr ve spesifikliini kaybeder. Metodun en nemli dezavantaj, ortamda bulunan ekstrakte edilebilir proteinleri de ekstrakte etmesidir. Bu nedenle spesifik bir metot olarak kabul edilmemektedir. Ayrca metodun dier bir dezavantaj da analiz srasnda ortamda bulunan askorbik asit gibi indirgen maddelerle etkileime uramasdr (Huang ve di., 2005). Fenol referans standart olarak gallik asit kullanlr. Fakat baz kaynaklarda farkl standartlara da rastlanmtr (Prior ve di., 2005). Burada bahsedilen yntemlerden farkl olarak hidrojen peroksit yakalama, hidroksil radikali yakalama, sper oksit anyon yakalama gibi yntemlerde mevcuttur (Prior ve di., 2005).

15

Standart bir analizin eksikliinden dolay, farkl aratrma gruplar tarafndan rapor edilen sonular karlatrmak zordur. En nemli problem gdalardaki ve biyolojik rneklerdeki antioksidan aktiviteyi gvenilir ekilde len analiz metotlarnn validasyon eksikliidir (Huang ve di., 2005; Prior ve di., 2005). Antioksidan aktivitesi lm metodlarn standartlatrmak anlaml karlatrmalar yapabilmek asndan olduka nemlidir. Standartlatrlm bir metot; 1- Potansiyel uygulamalardaki kimyasal olaylar nlemelidir. 2- Biyolojik olarak alakal bir radikal kayna iermelidir. 3- Basit olmaldr. 4- Metot belirli bir son nokta ve kimyasal mekanizmaya sahip olmaldr. 5- Enstrmanlar kolaylkla temin edilebilmelidir. 6- Tekrarlanabilirlik iyi olmaldr. 7- Metot farkl radikal kayna kullanlarak lipofilik ve hidrofilik antioksidanlara uyarlanabilmelidir (Prior ve di., 2005). Tablo 2.1: Literatrde mevcut baz antioksidan kapasitesi lm yntemlerinin eitli zelliklerine gre snflandrlmas (Huang ve di., 2005; Roginsky ve Lissi, 2005; Prior ve di., 2005).
Yntem ORAC Radikal kayna Peroksil (ROO) Biyolojik ilgisi Direkt Reaksiyon mekanizmas HAT lm prensibi
Peroksil radikalleri floresans bir madde ile reaksiyona girerek floresans olmayan bir madde oluturur. Antioksidan maddenin peroksil radikalini inhibe etmesi sonucu bu maddedeki azalma miktar floresans iddetine baklarak llr Peroksil radikalinin antioksidan madde tarafndan inhibe edilmesi optik olarak yada floresans iddetine baklarak llr KMBA substrat radikal madde ile etilen olutur. Antioksidan madde radikal ile reaksiyona girerek etilen oluumunda deiiklie yol aar. Etilen inhibasyonu llr Radikal maddenin iaretleyici bileenlerle verdii CL emisyon iddetinin antioksidan madde tarafndan azaltlmas llr

Gerekli cihaz Floresans spektrofotometre LC-MS

TRAP

Peroksil (ROO)

Direkt

HAT

Floresans spektrofotometre

TOCS

Hidroksil, peroksil, peroksinit ril Peroksil (ROO)

Direkt

HAT

GC Head space

CL

Direkt

HAT

CL dedektr

16

PCL

Sper oksit (O2-.)

Direkt

Belirtilmemi

Beta karoten veya Krosin aartma

Peroksil (ROO)

Direkt

HAT

LDL oksidasyonu FRAP

Peroksil (ROO) -

Direkt Dolayl

HAT SET

CUPRAC

Dolayl

SET

TEAC veya ABTS

ABTS+

Dolayl

SET&HAT

DPPH

DPPH

Dolayl

SET&HAT

Speroksit radikali fotokimyasal olarak oluturulur ve CL ile kombine edildikten sonra antioksidan madde tarafndan CL emisyon iddetinin azaltlmas llr Radikal madde ile karoten reaksiyonu sonucunda renk almas gzlenir. Antioksidan madde radikal ile reaksiyona girerek bu renk almasn engeller ve 470 nm de karoten veya 443 nm de krosin absorbsiyonundaki deiim llr Lipit peroksidasyonu sonucu oluan konjuge dien yada peroksitler 234 nm de llr 0.7 V redoks potansiyelde Ferrik TPTZnin indirgenmesi ile reaksiyon bileenleri llr ngirgenme sonucu oluan renkli rn spektrofotometrik olarak llr.Polifenoller 593 nm de llr Cu (II) nin antioksidan madde ile indirgenmesi sonucu oluan Cu(I)in bathocuproine veya neocuproine ile oluturduu kromoforun absorbsiyonu llr. Bathocuproine-Cu kompleksi 490 nm de Neocuproine-Cu kompleksi 450 nm de llr Antioksidan madde ile reaksiyonu sonucu ABTS+ radikalinin renk iddetinin azalmas 415,645, 734, 815 nm lerin birinde llr. Antioksidan maddenin DPPH radikalini indirgemesi ile DPPH renk iddetindeki azalma 515-517 nm de llr. Antioksidan madde tarafndan hidrojen peroksit (H2O2) oksidasyonunun engellenmesi llr H2O2 nin fenton reaksiyonlar sonucunda oluturduu hidroksil (HO)radikalilin antioksidan madde tarafndan yakalanmas llr Speroksit (O2-.) radikalinin enzimatik antioksidanlar tarafndan yakalanmas llr

Photo sensitizer CL dedektr

UV-Vis spektrofotometre

UV-Vis spektofotometre UV-Vis spektrofotometre

UV-Vis spektrofotometre

UV-Vis spektrofotometre

ESR yada UV-Vis Spektofotometre UV-Vis spektrofotometre UV-Vis spektrofotometre

H2O2 yakalama

H2O2

Direkt

Belirtilmemi

HOyakalama

HO

Direkt

Belirtilmemi

O2-. yakalama

O2-.

Direkt

Belirtilmemi

UV-Vis spektrofotometre

17

2.2. Fenolik Maddeler Fenolik bileikler bitkinin normal geliimi srasnda sentez edilen ikincil metabolitlerdir. Fenolik maddeler; genellikle bir veya birden fazla hidroksil grup ieren bir aromatik halkaya sahip, farkl yap ve fonksiyonlardaki metabolitlerdir (Naczk ve Shahidi, 2004; Robards ve di., 1999). Gdalarda bulunan fenolik bileikler en sklkla meyvelerde gzkmekle birlikte meyvenin eidine bal olarak farkllklar sz konusudur. Ayrca ayn meyve trnde; byme mevsimi, cins, evresel ve iklimsel koullar, bitki hastalklar, toprak eidi, corafik blge, olgunluk gibi etkenler fenolik bileik ieriini etkilemektedir (Sellapan ve di., 2002). Gdalarda bulunan fenolik maddeler; renk, aclk, burukluk, tat, koku ve rnn oksidatif stabilitesine etki edebilmektedir (Naczk ve Shahidi, 2004). Besinsel fonksiyonu olmamasna ramen gdalardaki fenoliklerin salk zerine olumlu etkileri vardr. Flavonoidler ve dier bitki polifenolleri yksek redoks potansiyelleri ile nemli antioksidanlardr. Fenolik bileiklerin antioksidan etkileri serbest radikalleri balamalar, metallerle elat oluturmalar, baz enzimleri inaktive etmeleriyle aklanmaktadr (Yang ve Tsao, 2003). Doal olarak oluan fenolik maddelerin en yaygn grubu flavonoidlerdir. Flavonoidlerin dnda bitki fenolleri; basit fenolleri, fenolik asitleri (benzoik ve sinnamik asitler), kumarinleri, stilbenleri, hidrolize ve kondense tanenleri, lignan ve ligninleri iermektedir (Naczk ve Shahidi, 2004). Fenolik maddeler, bitkilerde homojen olarak dalmamaktadr. Suda znmeyen fenolikler hcre duvarnn bileeni iken, suda znenler bitki hcresinin iinde yer alrlar. Bitkisel dokuda bitkinin d tabakas i tabakadan daha fazla fenolik madde iermektedir. Lignin ve hidroksi sinnamik asitler gibi hcre duvarnda bulunanlar, eitli hcresel bileenlerle balantldr. Bu maddeler; hcre duvarnn mekanik gcne katkda bulunur ve bitki geliiminde dzenleyici rol oynarlar (Naczk ve Shahidi, 2004).

18

Tablo 2.2: Baz meyve ve sebzelerin balca fenolik madde ierikleri

Meyve Fenolik madde Turungiller Sinamik asit, kumarin, hesperidin, naringin, neohesperitin, eriositrin Elma Kafeik asit, p-kumarik asit, kuersetin, klorojenik asit, dihidrokalkonlar, floretin, epikatein Armut p-kumarik asit, kuersetin, lkoantosiyanidin, proantosiyanidin, klorojenik asit, epikatein Brtlen Elajik asit, gallik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, siyanidin-3-glikozit zm Mirisetin, kuersetin, kaempferol, isohamretinin siyanidin, delphinidin, petunudin, malvidin, rutin ilek Elajik asit, Siyanidin-3-glikozit, pelargonidin3-glikozit, hidroksisinnamik asit, hidroksibenzoik asit, klorojenik asit, kuersetin, kaempferol Kiraz Neoklorojenik asit, hidroksisinnamik asit, hidroksibenzoik asit, p- kumarilkuinik asit, klorojenik asit Erik hidroksisinnamik asit, neoklorojenik asit, klorojenik asit, rutinozit glikozitleri Nar Elajik asit, delphinidin, pelargonidin, siyanidin, hidrolize taninler, punicalagin, katein, epikatein, gallokatein Havu Domates Hidroksisinnamik asit trevleri, Phidroksibenzoik asit, irinjik asit, kafeik asit, isoklorojenik asit, klorojenik asit, Kuersetin Kaynak (Ortuno ve di., 1997; Naidu ve di., 2000) (Naidu ve di., 2000; Salces ve di., 2001; Uzelac ve di., 2005; Karadeniz, 1994) (Schieber, ve di., 2001; Tanrven, 1997) (Sellappan ve di., 2002) (Lee ve di., 2004; Naidu ve di., 2000; Espada ve di; 2004). (Seram ve di., 2004; Hakinken ve Trrnen, 2000) (Gonalves ve di., 2004) (Kim ve di., 2003) (Amakura ve di.,2000; (Noda ve di., 2002; Gil ve di.,2000; de Pascual-Teresa ve di., 2000) (Babic ve di., 1993; Alasalvar et al., 2001) (Dewanto ve di., 2002; Stewart ve di., 2004)

2.2.1. Fenolik Asitler Fenolik asitler; sinamik ve benozik asitler olmak zere iki gruptan olumaktadr. Fenol karbon asitleri ile de anlan fenolik asitlerden sinamik asitlerin yaps C6-C3 iskeletine dayanmaktadr. Meyvelerde en fazla grlen sinamik asitler, kafeik asit, kumarik asit ve ferulik asittir. Sinamik asitler meyvelerde esterlemi halde de bulunabilmektedir. Kafeik asitin kuinik asit ile yapt ester olan klorojenik asit en yaygn grlen sinamik asit trevidir (Belitz ve di 2002; Naczk ve Shahidi, 2004). Benzoik asitler ise C6-C1 iskeletine dayal bileiklerdir. Meyvelerde benzoik asit trevleri genellikle ester halinde bulunur. En nemli benzoik asit trevleri, salisilik asit (2-hidroksibenzoik asit), p-hidroksibenzoik asit (4-hidroksibenzoik asit),

19

protokateik

asit

(3,4-dihidroksibenzoik

asit),

vanilik

asit

(3-metoksi-4-

hidroksibenzoik asit), gallik asit (3-4-5-trihidroksibenzoik asit) dir. ekil 2.6da benzoik asit ve sinnamik asit iskelet yaps gsteren fenolik maddelerin temel kimyasal yaps gsterilmitir (Belitz ve di; Naczk ve Shaidi, 2004).

Benzoik asit

Sinnamik asit

ekil 2.6: Fenolik asitlerin temel kimyasal yaps Lifli materyaller zengin bir flavon ve fenolik asit kaynadr. kumarik asit ve ferulik asit gibi baz yaygn fenolikler dk antioksidan aktivitesi gstermelerine ramen kafeik asit ve klorojenik asit gibi molekllerinde daha fazla fenolik hidroksil tayan maddelerde antioksidan aktivitesi daha yksektir. Gallik asit ve esterleri ise bilinen en iyi gl antioksidanlardandr (Hudson, 1990). 2.2.2. Flavonoidler Flavon ismi Latince flavus (sar) kelimesinden gelmektedir. Bitkilerden elde edilen ve genellikle sar renkli olan bu bileikler flavonoid olarak isimlendirilmitir. Gnmze kadar yaplan almalarn sonucunda bitkilerden 4000den fazla flavonoid izole edilmi ve yaplar aydnlatlmtr. Hepsi antioksidan aktivite gstermekte ve bunlardan yaklak 50 tanesi gdalarda bulunmaktadr. ou flavonoid polifenolik bitki pigmentidir ve meyve ve sebzelere krmz, turuncu, sar, mavi ve mor renk verirler. Bilinen flavonoidlerden yeil ayda bulunan EGCG (epigallokatein gallat) en umut vaad edici antikansorejen (Naczk ve Shahidi, 2004). maddelerden biridir

20

2.2.2.1. Flavonoidlerin Yap zellikleri ve Snflandrlmas Genellikle tm flavonoidler; fenolik halkaya sahip ve hidroksil ile metil grubuna gre deien 2-fenilkromonun trevleridirler. Kimyasal yaplar (C6-C3-C6) iskelet yapsna dayanr (ekil 2.7). (Madhavi, 1996; Shahidi, 1997).

ekil 2.7: Flavonoidlerin C6-C3-C6 iskelet yaps C halkasndaki sbsitye gruplara ve B halkasnn pozisyonuna bal olarak flavonoidler eitli alt gruplara snflandrlmtr Doal olarak meydana gelen flavonoidler, kimyasal yaplarna gre alt gruba ayrlabilirler; flavanon, flavonlar, izoflavonoidler, flavanlar (flavanoller), antosiyaninler ve flavonoller (ekil 2.8) (Madhavi, 1996; Peterson ve Dwyer, 1998).

ekil 2.8: Flavonoid alt gruplarnn temel yaps Pratt ve Hudson bu bileenlerin genel mekanizmalarn incelemi ve yap ve

antioksidan aktivitesi arasndaki ilikiyi gzlemilerdir. Flavonoidlerin antioksidan aktivitesi genellikle trl olmaktadr. Flavonoidler ya birincil antioksidan olarak, 21

ya da elatlayc olarak ya da speroksit anyon yakalaycs olarak serbest radikallerin etkisini giderirler. B halkasndaki 3-4-5 pozisyonlarndaki hidroksil gruplarn varl tek hidroksil ieren gruplara kyasla antioksidan aktiviteyi arttrmaktadr. Ayn zamanda C halkasndaki 3- hidroksil gruplar ve 2-3 ift balar antioksidan zellik zerinde etki yapmaktadr (Madhavi, 1996). Flavonoidlerin yap eitlilii, difenilpropan iskeletinin (C6-C3-C6) farkl yaplarda dzenlenme zelliinin yan sra, her snf iinde, molekln aromatik halkalarna balanan sbsitent says, zellii ve balanma pozisyonlarna gre ortaya kar. Hidroksil gruplar, flavonoid yaplarnda bulunan en yaygn sbstitentlerdir. Doal flavonoidlerin yapsnda en fazla yedi hidroksil grubunun bulunduu bilinmektedir. Flavonoidlerin yapsndaki hidroksil gruplar, reaktif zelliklerinden dolay kolaylkla alkillenir veya glikozillenirler. Bu nedenle, flavonoidlerin metoksi ve glikozil trevlerine bitkilerde ska rastlanr (krk, 2005). 2.2.2.2. Antosiyaninler Antosiyaninler zm, ilek, kiraz, vine gibi meyvelere rengini veren (krmz, mor, pembe, mavi) ayrca eitli iekler ve bitki kklerinde de bulunan, en iyi doal renklendiricilerdir. (alml, 2003; Villers ve di; 2004). Antosiyaninlerin yapsnda hetorosiklik bir halka olan pirilyum katyonu

bulunmaktadr. Pirilyum ise yapsnda pozitif ykl bir oksijen bulunan bir oksonyum iyonudur. Antosiyaninler bu eksik elektrondan tr olduka aktif niteliktedir. Antosiyaninler kimyasal olarak 2-fenilbenzopirilinin polihidroksi ve polimetoksi trevlerinden oluan glikozitlerdir. Bu yap, eker gruplarnn (mono-ditri sakkaritler), eker olmayan (aglikon) maddelerle birlemesi ile olumaktadr. Antosiyaninlerin eker olmayan ksm, fenolik maddelerden antosiyanidinler (C6C3-C6) olarak adlandrlmaktadr. Her bir antosiyanidinin farkl eker yada asitlerle, farkl pozisyonlarda balanmas ile ok sayda antosiyanin oluabilmektedir. (Jamet ve Ebeling, 2002; alml, 2003). Dephinidin, siyanidin, pelargonidin, malvidin, peonidin ve petunidin gsterilmitir (Naczk ve Shahidi, 2004). bilinen en

yaygn antosiyanidin trleridir. ekil 2.9da 6 temel antosiyaninin kimyasal yaps

22

3 Pelargonidin Siyanidin Delphinidin Peonidin Petunidin Malvidin H OH OH OMe OMe OMe

4 OH OH OH OH OH OMe

5 H H OH H OH OMe

ekil 2.9: Alt temel antosiyaninin kimyasal yaps Doada antosiyaninler antosiyanidinlerin glikozitleri halinde bulunmaktadrlar ve bu glikozit yapya bal aromatik veya alifatik asitler bulunabilir. P-kumarik asit, kafeik asit, ferulik, sinapik asit, gallik veya p-hidroksibenzoik asitler gibi asitler (Trker ve di., 2004). Antosiyanin flavonoidleri, pigment olarak rengin oluumunda nemli etkiye sahiptirler. Bu bileenler, taze yapraklarda ultaviyole nlarnn neden olduu zarara kar koruyucu etki gstermekte, patojenlere direnci artrmaktadrlar. Ayrca antosiyaninler antioksidan enzim inhibitr olarak da rol oynayabilmektedirler. Buna ilaveten flavonoidler fotosentez ve enerji transfer bileenleri olarak da fonksiyon gsterebilir ve bitkinin geliiminde etkili olabilirler (Naidu ve di., 2000). Antosiyaninlerin renkleri molekler yaplarna ve bulunduklar ortamn pH derecesine gre deiim gstermektedir. rnein hidroksil gruplarnn says arttka renk pembeden maviye dnr. Metoksil gruplar ise bu dnm tersine evirir. Asidik sulu zeltide krmz renge sahip olan bu renk maddeleri pH > 4,5 olduunda tamamen renksizleir. Bu maddelerin renklendirici olarak kullanmnda gdann ve 23 ile aillenme antosiyaninlerin stabilitesi asndan olduka nemli etkiye sahiptir

rnn pH < 3,5 deerinde olmas gerekmektedir. Antosiyaninler dk pH da kararldrlar ve etkin bir krmz renk olutururlar (alml, 2003). Antosiyaninlerin stabilitesini etkileyen fakrler; pH, scaklk, k, kopigmentler, metalik iyonlar, oksijen, askorbik asit, eker, degredasyon rnleri eklinde sralanabilir. Bu faktrlerin yan sra aillenme gibi antosiyanin yapsn etkileyen durumlar da stabiliteyi etkilemektedir (Trker ve di., 2004). En nemli antosiyanin kaynaklar, zm suyu ve arap yapmnda atk olarak ele geen posalar, baz zm eitleri, kuburnu,(0.6-0.8 mg/g meyve ) mrver aac meyvesi (2-10 mg/g meyve) kiraz (43,6 mg/100 g) ve vine (35-82 mg/100 g meyve) eklinde belirtilmitir (alml, 2003). Genel olarak antosiyaninler doal renklendirici olarak kullanlmaktadrlar. zmden elde edilen antosiyanin ticari amal mor ve krmz renklendiriciler olarak alkolsz iecekler, meyve uruplar, konserve meyveler, arap, alkoll iecekler, tatl ve yourtlarda kullanlmaktadr (alml, 2003). Antosiyaninlerin zc yntemiyle ekstraksiyonu ile ilgili yaplan aratrmalarda, ku burnu ve zm suyu ya da arap retiminde atk olan posalardan antosiyaninlerin elde edilmesinde asit-alkol ekstraksiyonu uygulanmtr. Bu amala genelde etanol0.1 N HCl kullanlrken, kuburnu posasnda metanol- %0,03 HCl ile ekstraksiyon yaplmtr (alml, 2003). Tablo 2.3: Baz fenolik maddelerin kimyasal yaps Fenolik madde Kimyasal yaps

(-)- Epigallokatein gallat

(-)- Epigallokatein

(-)- Gallokatein

24

(-)- Epikatein

(+)- Katein hidrat

Rutin hidrat

3,4- Dihidroksibenzoik asit

Kafeik asit

Klorojenik asit

Gallik asit

Ferulik asit

P-Kumarik asit irinjik asit

25

2.2.2.3. Flavonoidlerin Antioksidan Aktivitesi Flavonoidlerin yaps; fizyolojik aktivitelerine dair birok hipotezin ortaya kmasna neden olmutur. Flavonoidler ierdikleri hidroksil yaplarna gre gl zincir kran antioksidanlar olarak hareket edebilmektedirler. Kimyasal olarak flavonoidlerin gl antioksidan zellikleri zellikten kaynaklanr; hidrojen vererek redoks reaksiyonlarna girebilirler. Flavonoidlerin yapsnda bulunan, B halkasndaki (ekil 2.7) oksijen atomunun bulunduu yerden alarak kolayca okside olabilmekte (aromatik halka yaplarndaki hidroksil gruplar sayesinde) ve bu sayede serbest radikalleri yok edebilmektedir. Flavonoidler, aromatik heterosiklik ve oklu doymam balardan oluan yaplaryla dayankl bir kimyasal yap olutururlar. Metal elatlama kapasitesine sahip yapsal gruplar vastasyla OH- ve O-2 gibi reaktif oksijen trlerinin oluumunu engelleyebilirler (Cam ve Hl, 2003; Naczk ve Shahidi, 2004). Antioksidan aktivitesi belirlemede hidroksilasyon derecesi ve pozisyonu en nemli parametrelerdir. Genellikle kabul gren gre gre B halkasnn ortohidroksilasyonu nemli lde gze arpacak ekilde flavonoidlerin antioksidan aktivitesine katkda bulunur (Hudson, 1990). Meta konfigrasyonunda antioksidan aktivitesi olmad durumda ise B halkasnn para yaps antioksidan aktivitesine daha ok katkda bulunmaktadr. Ancak para ve meta hidroksilasyonu doada sklkla rastlanan bir durum deildir. Btn flavonoidler 3,4 dihidroksi konfigrasyonlarnda antioksidan aktivitesine sahiptirler. Bunlardan iki tanesi (Robinetin ve mirisetin) 5 pozisyonunda ekstra hidroksil grubuna sahiptir. Bu durumda antioksidan aktivite fisetin ve kuersetin gibi 5 pozisyonunda hidroksil grup tamayanlara kyasla daha yksektir. Naringenin ve hesperitin adl iki flavonon B halkasnda sadece tek bir hidroksil grubuna sahiptir. Bu nedenle dierlerine gre daha dk antioksidan aktiviteye sahiptir. Ksaca, B halkasndaki hidroksilasyon durumu antioksidan aktiviteyi belirlemede gz nnde bulundurulmas gereken balca etkenlerden biridir (Hudson, 1990). 2.2.2.4. Flavonoidlerin Gdalarda Dalm Flavonoidler gdalarda genellikle glikozit halinde bulunurlar, suda znr ve dayankldrlar. Gdalarda bulunan flavonoidler; genellikle renk, tat, yalarn oksidasyondan korunmas, vitaminlerin paralanmasnn ve enzim inaktivasyonunun

26

nlenmesinden

sorumlu

bileenlerdir.

Ancak

lipitlerdeki

olduka

dk

znrlkleri genellikle dezavantajdr (Justesen ve di., 1998; Peterson ve Dwyer, 1998; Hudson, 1990). Doal rnlerde, zellikle bitkisel kaynakl bir ok gdada iki veya bileenin etkileimi ile bu bileenlerin ayr ayr toplamndan (sinerjistik etki) (birincil antioksidanlar), fosfolipitler (proton donor), salamak amac ile bir araya getirilir (Hudson, 1990). 2.3. Kullanlan Hammaddeye likin Literatr Bilgisi 2.3.1 Mor havu Mor havu (Daucus Carota) zellikle ukurova yresinde kullanm yaygn olan algam suyunun hammaddesidir. Bilimsel olarak da kantlanm faydalarnn en nemli kayna mor havuca rengini veren antosiyanin pigmentinin antioksidan zelliinden gelmektedir. Mor havu antosiyanin pigmentleri asndan olduka zengindir. Mazza ve Miniati (1993) taze mor havuta antosiyanin ieriininin 1750 mg/kg kadar olabileceini rapor etmilerdir. Mor havu olduka yksek miktarlarda aillenmi antosiyaninler ierir. Mor havu ekstraktnda drt temel antosiyanin tanmlanm ve bunlarn % 41i aillenmi formda olduu belirtilmitir. Mor havuta antosiyanin olmayan fenolikler daha dk miktarda bulunur. Mor havuta fenolik asitlerden p-kumarik, kafeik asit ve ferulik asit bulunur. Ayrca eit hidroksibenzoik asit trevide grlmtr. kk ksmnda 657 mg/kg ve konsantresinde 5815 mg/kg olmak zere klorojenik asit (5-O-kafeoilquinik asit) en baskn fenolik bileendir (Kammerer ve di., 2004). Mor havu antosiyaninleri asidik pH da olduka parlak krmz renktedir. Bu nedenle mor havu suyu meyve sular, nektar, marmelat, konserve, ekerleme gibi rnleri renklendirmede tercih edilir. Mor havu suyu gdalara renklendirici ingrediyent olarak eklenmektedir. Yksek miktarlarda nutrasetik komponentler ierdiinden mor havu ile renklendirilmi gdalar salk asndan olumlu yararlar salamaktadr (Krca ve di., 2005). 27 daha fazla koruyucu etkiye sahip bir antioksidan aktivitesi elde edilir. rnein tokoferoller askorbik asit (oksijen yakalayc), flavonoidler (birincil antioksidan ve metal elat) daha gl bir koruma

2.3.2. Mor Havu Suyu Konsantresi Mor havu ve preperatlar (z, konsantre, toz vs.) pH deeri 5.5 den kk

gdalarda kullanldnda kiraz rengi ile bordo arasnda ok ho ve parlak krmz tonlar elde edilmektedir. Daha yksek pH deerlerinde ise leylak rengi ile mavi tonlarnda gz alc renkler elde edilmektedir. Konsantre olarak yiyecek iecek sektrnde doal renklendirici ve katk maddesi olarak kullanlabilir. Konsantre mor havu kullanmnn avantajlar yle sralanabilir; -Dier - Krmz antosiyaninlere rengini daha gre yksek daha pH yksek deerlerinde performans de gsterir eder.

muhafaza

-Is ve k karsnda daha az hassasiyet gsterir (Anon 2, 2006). Havu besleme

Havu ykama durulama

Seme, ayklama, tme

Maye stma minimum 70 C

Maye tank

Presleme

Ham meyve suyu balans tanklar

Pastorizasyon (90-100 C)

Soutma (45-55 C)

Enzimasyon (Pektolitik enzim)

Tambur filtre

Evaporasyon

Konsantre soutma maksimum 20C

Dolum

Etiketleme, kapakalama, emberleme, paletleme

Souk depolama (0-4C ) ekil 2.10: Mor havu suyu konsantresi retimi

28

Bu almada kullanlan mor havu suyu konsantresinin 1 kilogram yaklak olarak 9 kg mor havutan elde edilmitir. ekil 2.10da mor havu suyu konsantresi retimi ak emas gsterilmitir (Asparuk, 2006). 2.3.3. algam Suyu algam suyu mor havutan laktik asit fermantasyonu ile elde edilen morumsu

krmz renkte ekimsi bir iecektir. algam suyu el ve Hatay illeri ile bunlara bal ilelerde retilmekle beraber, en yaygn olduu yre Adana ve yakn evreleridir. Ancak, son yllarda Ankara ve stanbul gibi byk illerimizin marketlerinde de rastlanmaktadr. tah ac zellii ve sindirim sistemi zerinde yapt olumlu etki nedeniyle de nem tamaktadr. Adn retiminde kullanlan algam yumrusundan, rengini ise mor havutan alan algam suyunun retiminde baz yrelerde bu hammaddelere ek olarak krmz pancar da kullanlmaktadr. Bu fermente rnn morumsu krmz rengi mor havuta bol miktarda bulunan ve bir ok meyve ve sebzenin krmz, mavi, ve mor renginden sorumlu olan antosiyanin pigmentlerinden kaynaklanmaktadr (zler, 1995; Erginkaya ve Hammes, 1992; Trker ve di; 2004). algam suyu retiminde laktik asit bakterileri ile direkt olarak fermente edilen mor havuca tuz, krmz biber ve 2004). algam suyu retiminde fermantasyon iki aamada gerekletirilmektedir. lk aama bulgur unu, eki hamur, tuz ve su karmndan oluan hamurun fermantasyonu, ikinci aama ise hamurun bez torbalar iine alnarak, salamura ilavesinden sonra mor havu ve algam ile birlikte gerekletirilen fermantasyondur (zler, 1995). ekil 2.11de klasik yntem ile algam suyu retimi gsterilmektedir. algam turpu ilave edilir. Bu karma laktik asit bakterileri ile n fermantasyona uram bulgur unu kartrlr. (Trker ve di.,

29

Hamur fermantasyonu

Ekmeklik hamur 28-30 C de 1-8 saat fermentasyon

Bulgur unu, tuz, su ilavesi ile yourarak hamur haline getirme

Elde edilen hamurun 25-30 C de 3-5 gn fermentasyonu

Mor havu, krmz pancar ve algamn hazrlanmas

Ykama

Kabuk soyma

Dilimleme

Fermentasyon

Mor havu ve algamn fermentasyon kaplarna yerletirilmesi

Maya ilavesi

% 1 tuz ieren salamura iinde 24 saat n fermentasyon

Su ilavesi ve 20-25 C de 3-7 gn fermentsayon ile toplam asitlik geliimi

Filtrasyon

ieleme

65 C de 30 dk pastrizasyon

Depolama ekil 2.11: Klasik yntem ile algam suyu retimi (zler, 1995; Erginkaya ve Hammes, 1992). algam suyu retimi starter kltr kullanm ile de gerekletirilebilmektedir. Mor havu ve algamlarn zerine hazrlanan starter kltr ilave edilir ve 24 saat kapal bidonda bekletilir. Bu aamadan sonraki ilemler klasik yntem ile algam suyu retiminde olduu gibi devam ettirilir (zler, 1995). Bilim adamlar tarafndan gelecein besini olarak deerlendirilen fermente bitkisel rnlere, zellikle fermantasyon sonucunda meydana gelen laktik asitten dolay artan 30

bir ilgi gsterilmektedir. Laktik asidin muhafaza edici zelliinin olduu, bu zelliinden dolay da uzun zaman meyve ve sebzelerin muhafaza edilmelerinde ve dayankl hale getirilmelerinde laktik asit fermantasyonundan yararlanld bilinmektedir (zler, 1995). 2.3.4. Nar Nar (Punica granatum) Trkiye, ran, Amerika, Ortadou, Akdeniz ve Arap lkelerinde yetien gney dou asya orijinli bir meyvedir. Yenilebilir ksm nemli miktarlarda, asit, eker, polisakkarit, vitamin ve polifenol iermektedir. Nar suyunun potansiyel antioksidatif zellikte olduu rapor edilmitir (Maskan, 2004). Nar taze olarak tketilebildii gibi ayn zamanda, nar suyu, surup, reel ve arap eklinde ilenebilir. Meyvenin kimyasal yaps yetitii blge, ekim koullar, iklim, olgunluk ve depolama gibi faktrlerden etkilenmektedir. Bu koullara bal olarak organik asitler, fenolik bileenler, eker, suda znen vitamin ve mineral kompozisyonu asndan nemli varyasyonlar olduu bir ok aratrmac tarafndan bildirilmitir. erdii organik asitler ve fenolik bileenler salk zerine olumlu etki gstermelerinin yan sra duyusal zelliklere de katkda bulunurlar (Poyrazolu ve di., 2002). Nar suyu nemli lde fenolik madde ierir. Delphinidin, siyanidin, pelargonidin 3-glikozit ve 3,5-diglikozit antosiyaninleri bata olmak zere gallil tipi tanenler, elajik asit ve trevleri antioksidan aktiviteye nemli lde katk salayan bileenlerdir (Miguel ve di., 2004). Nar suyunun ierdii bu fenolik maddelerle ilgili yaplan bir almada ise narda bulunan fenolik maddelerden tanenler, antosiyaninler, elajik asit ve trevleri ayr ayr hesaplanmtr. Tanenler 1978 mg/l antosiyaninler 384 mg/l elajik asit 121 mg/ l olarak rapor edilmitir (Aviram ve di; 2005). Narn pembeden mora kadar uzanan renk tonlarn veren maddeler, antosiyanin grubu maddelerdir. Narda en fazla bulunan antosiyaninlerden birisi pelargonidindir. ou antosiyaninlerin rengi, pH derecesine bal olarak adeta bir indikatr gibi deiir. Meyvenin ilenmesi srasnda kolaylkla paralanp, nemli renk kayplar ortaya kmaktadr. Nar suyundaki antosiyanin rengi pH deerinin artmas veya azalmas ile deimektedir. pH deerindeki 0,1 birim art renk younluunda %5 azalmaya sebep olmaktadr (Vardin, 2000). 31

Nar suyu kendine zg buruk bir lezzet tar. Bu buruk lezzet eitli polifenolik maddelerden ve zellikle tanenlerden kaynaklanr. Bu maddeler ayn zamanda nar suyunun bulanklk nedenidir. Fenolik bileikler zamana bal olarak kondenzasyon ve polimerizasyon eilimi gstermekte ve sonuta suda znmeyen nitelikte bileikler olumaktadr (Vardin, 2000). lkemizin gney illerinde eki nar suyu kaynatlp koyulatrlarak nardek veya nar ekisi adyla orba salata ve zel yemeklerde kullanlmaktadr (Vardin, 2000). Nar ekisi retiminde geleneksel metotlar kullanlmaktadr. Nar suyu eker ve dier katk maddeleri kullanlmakszn kaynatlarak konsantre edilir (Kaya ve Szer, 2005).

2.4. Analiz Yntemleri 2.4.1. Flavonoidlerin Ekstraksiyon Yntemleri Antioksidan bileiklerinin yksek verimle eldesinde zgen seimi en nemli faktrlerden birisidir. Fenolik bileikler hidrofiliktir ve alkolde yksek znrle sahiptirler. Fenolik bileiklerin znrl; kullanlan zgenin polaritesine, fenolik bileiklerin polimerizasyon derecesine ve fenolik bileiklerin yapsna baldr. Btn fenolik maddelerin hepsini veya belirli bir snf fenoliklerin hepsini ekstrakte edecek bir tek zgen sistemi yoktur. Fenolik bileiklerin ekstraksiyonunda genellikle metanol, etanol, aseton, su, etil asetat veya bunlarn kombinasyonlar kullanlr (Naczk ve Shahidi, 2004; Wrolstad ve Grete, 2002). Genellikle fenolik madde ieren bir ok bileenin metanol ve etanol ekstraktlarnn antioksidan aktivitesinin dier zgen sistemlerine gre daha yksek olduu grlmtr (Oreopoulou, 2003). Antosiyanin bileenleri polar molekllerdir ve polar zclerde daha iyi znrler. Antosiyaninler bazik veya ntr koullarda stabil deildir. Bu nedenle antosiyaninlerin ekstraksiyonunda asidik ortam kullanlr (Dao ve Takeoka, 2002). Ayrca koullara bal olarak fenolik maddeleri eksrakte ettikten sonra saflatrma ilemi de uygulanabilmektedir. Vakum altnda konsantre edildikten sonra petrol eteri, etil asetat ve dietileter ile ekstrakte edilerek lipitler ve istenmeyen polifenoller uzaklatrlabilir. Ayrca fenolikleri saflatrmak iin sv-kat veya sv-sv faz

32

prosedr de uygulanabilmektedir. Sv - kat faz prosedrnde amberlit paracklar yardm ile eker yada baz istenmeyen polar bileenler fenolik maddelerden ayrlr. Sv-sv faz prosedrnn temeli ise birbiri ierisinde karmayan iki sv ile ayrm yntemine dayanr. Fazlardan birisi hareketli dieri ise hareketsiz faz olarak kullanlr ve bylelikle farkl iki faz yardm ile istenmeyen maddelerin ayrm salanr (Naczk ve Shahidi, 2004). Bunlardan baka, doal antioksidan maddelerin ekstraksiyonunda yeni bir prosedr olan sperkritik karbondioksit yntemi kullanlarak dk scaklkta ekstraksiyon salanabilmektedir. rnein, baz bitkisel gdalar 30 MPa ve 40Cde sperkritik karbondioksit ile ekstrakte edildiinde antioksidan aktivitesinin ayn bitkinin aseton ekstraktndan daha yksek yada ayn olduu grlmtr. Ancak genellikle sper kritik karbondioksit ile ekstraksiyon veriminin daha dk olduu grlmtr. 31 MPa ve 60C de yeil ayn sperkritik karbondioksit ekstraksiyondan elde edilen katein veriminin etanol, yada sokselet cihazndaki sulu ekstraksiyondan daha dk olduu grlmtr. Sulu etanol zgeninin yardmc zgen olarak ilave edilmesinin ise ekstrakte edilen katein verimini arttrd grlmtr (Oreopoulou, 2003). 2.4.2. Spektrofotometrik Yntemler Fenolik maddelerin miktarn belirlemek iin bir ok yntem gelitirilmitir. Gdalarda bulunan toplam fenolik madde miktar genellikle Folin Ciocalteau yntemiyle gerekletirilir. Bu yntemlerin seicilii dktr fenolik olmayan bileiklerde ekstrakta bulunduu iin spektrofotometrik yntemler kromatografik yntemlere gre fenolik bileikleri daha fazla lebilmektedir (Escarpa ve Gonzales, 2001). Folin Ciocalteau metodunun yan sra Prussian blue testi, vanilin testi, folindenis testi gibi metotlar nadir de olsa kullanlabilmektedir (Prakash, 2001). UV grnr spesktroskopik teknikler basit fenollerin zellikle flavonoidlerin analizinde ve antioksidan aktivitesi lm metotlarnda sklkla kullanlr (Naczk ve Shahidi, 2004). 2.4.3. Kromatografik Yntemler Fenolik asitlerin, izoflavonlarn, fenolik aldehitlerin ve kondense tanen

monomerlerinin analizinde eitli gaz kromatografisi (GC) teknikleri kullanlabilir. Gaz kromatografisi ile analiz ncesinde; ekstrattan lipit eliminasyonu, tanenlerin 33

enzimatik hidrolizi yada asit depolimerizasyonu gibi n ilemler uygulananmaldr. Kromatografik analizden nce, fenolik maddeler genellikle metilasyon ve trifloroasetilasyon ile daha uucu trevlerine dntrldkten sonra analizlenirler (Naczk ve Shahidi, 2004). HPLC teknikleri ise fenolik maddelerin ayrlmas iin en sk kullanlan metottur. Ters fazl kolon kullanm HPLC ile ayrlmay daha duyarl hale getirmitir. Gdalarda bulunan fenolik maddeler genellikle UV grnr dalga boyunda UV-Vis dedektrleri ile llmektedir (Naczk ve Shahidi, 2004). Polifenolik maddelerin tanmlanmasnda kolonda alkonulma sresi temel alnr. HPLCde bileiklerin kimyasal yaps alkonma sresi zerine etkilidir, hidroksillenmi ve glikozitlenmi fenoliklerin alkonma sreleri ksa iken, metillenmi veya aillenmi fenoliklerin alkonma sreleri ise uzundur (Dao ve Takeoka,2002).

34

3. MALZEME VE YNTEM 3.1. Malzeme 3.1.1. Analizlenen Gdalar almada analizde kullanlmak zere hammadde olarak Konya-Ereli yresinden temin edilen mor havu, TARGD gdadan temin edilen mor havu suyu konsantresi, DOANAY marka algam suyu, taze olarak marketten alnm nar, DMES marka nar suyu ve ARFOLU marka nar ekisi kullanlmtr. 3.1.2. Kullanlan Ekipman ve Kimyasallar almada sartorius TE2145 marka hassas terazi, Universal 32R marka santrifj, Shimadzu UV-1700 spektrofotometre, Grant-SS40-D marka alkalayc, su banyosu, Azakl ultrasonoik banyo, Hevdolph MR3001 marka stcl manyetik kartrc, Biohit proline marka otomatik pipet, IKA MSI marka vorteks, kullanlmtr. Yksek performansl sv kromatografisi olarak ise (Kolon: Supelcosil C18, 5 m, (25 x 4,6 mm) waters 2695 separation module ve 2996 photodiode array dedektr kullanlmtr. Deneylerde kullanlan kimyasallar ise; Etanol, Metanol, Asetonitril, Asetik asit, demir(III)klorr, Triloloroasetikasit, Potasyum hekzasiyanoferrat, tween 20, Amonyum tiyosiyanat Riedel firmasndan, Folin Ciocalteau reaktant, Linoleik asit Sigma firmasndan, Sodyum karbonat, Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil-kroman2-karboksilik asit), DPPH, ABTS, Gallik asit, Beta karoten, Ferrozine Fluka firmasndan, L- askorbik asit, Demir (II) klorr Aldrich firmasndan, Potasyum klorr ve Sodyum asetat trihidrat Merck firmasndan, HPLC iin gerekli standartlar ise Gallik asit ve Ferulik asit Fluka, Rutin (kuersetin-3-rutinosid), Luteolin, Kafeik asit, Klorejenik asit, Kumarik asit, Elajik asit, (-) Epikatein, (-)

Gallokatein, (-)- Epigallokatein gallat, (-) Epigallokatein, irinjik asit, (+)Katein, Sigma, Kuersetin (Aldrich) Firmasndan temin edilmitir.

35

3.2. Yntem alma kapsamnda gerekletirilen deneylerde ama olan mor havu, mor havu suyu konsantresi, algam suyu, taze sklm nar suyu, ticari nar suyu ve ticari nar ekisi gibi fenolik maddelerce zengin olan bu geleneksel Trk rnlerinde toplam fenolik madde ieriinin Folin-Ciocalteu yntemiyle, toplam flavonoid analizinin kolorimetrik flavonoid analizi yntemi ile, toplam antosiyanin ieriinin ise pHdiferansiyel metodu ile toplam antioksidan aktivitesinin ise DPPH radikal yakalama metodu, ABTS radikal katyonu yakalama metodu, metal elatlama, indirgeme potansiyeli ve linoleik asit emlsiyon metodu ile belirlenmesidir. almann dier bir amac ise bu rnlerin ierdii fenolik maddelerin HPLC metodu ile kalitatif ve kantitatif olarak tanmlamaya almaktr. 3.2.1. rneklerin Hazrlanmas Mor havu rnei bakla kk paralara ayrldktan sonra blender ile birka dakika paralanm ve homojen hale getirildikten sonra -18C de dondurularak muhafaza edilmitir. Daha sonra uygun koullarda zndrlerek ekstraksiyon ilemine tabi tutulmutur. Mor havu suyu konsantresi ise ekstraksiyon ileminden nce buzdolab scaklnda muhafaza edilmitir. Analiz ncesi taze olarak alnan ve -18 C de dondurularak muhafaza edilen algam suyu ve ticari nar suyu rnei ise uygun koullarda zndrldkten sonra her hangi bir ileme tabi tutulmadan belirli miktarlarda llerek ekstraksiyon ilemine tabi tutulmutur. Taze nar suyu ise elektirikli skacak ile narn suyu karldktan sonra ekstraksiyon ilemine tabi tutulmutur. 3.2.2. Ekstraksiyon Antioksidan aktivitesi belirlemek amac ile rneklerin ieriindeki fenolik bileiklerin eldesinde etanol zgeni seilmitir. Bugne kadar yaplan almalar incelendiinde zgeninin edilmitir. antosiyaninlerce zengin gdalarn ekstrakte edilmesinde asitlendirilmi etanol zgeninin sklkla tercih edildii grlmtr. Etanol daha az kanserojen olduu bilindiinden metanol zgenine tercih

36

rnekler antosiyanin arlkl fenolik madde ierdiinden antosiyaninlerin hidrolize edilmesi amac ile zgen uygun miktarda asit kullanlarak asidik hale getirilmitir ((%95 etanol:1.5 N HCl (85:15)). rnekler bu asidik zgen ile yatay alkalayc ile orta hzda 30 dk sreyle kartrlarak ekstrakte edilmitir. (Lazcano ve di., 2001). 50 ml zgen alnarak rneklerin bu zgen ierisindeki balang konsantrasyonu mor havu, mor havu suyu konsantresi, nar ekisi, algam suyu, taze nar suyu, ticari nar suyu iin srasyla 200 mg rnek/ml son zelti, 20 mg rnek/ml son zelti, 200 mg rnek/ml son zelti, 0,2 ml rnek/ml son zelti, 0,2 ml rnek/ml son zelti, 0,2 ml rnek/ml son zelti olacak ekilde hazrlanmtr. Folin-Ciocalteu yntemi ve toplam flavonoid analizi ve metal elatlama yntemlerinde ise rnekler %95 lik etanol zgeni asit ile kartrlmadan hazrlanmtr. Tm ekstraktlar Whatman No.4 filtre kad kullanlarak filtre edilmitir. Daha sonra ekstrakte edilmi bu rneklerden toplam fenolik madde analizi ve antioksidan aktivitesi analizleri iin seyreltilmi alt rnekler hazrlanmtr. 3.2.3. Kompozisyon Analizi Toplam Kuru Madde Tayini: rneklerin nem miktarlarn hesaplanmas AOAC 925.45 B atmosferik kurutma koullarnda kuru madde analizine gre 3 tekrarl olarak gerekletirilmitir (AOAC , 2000). Suda znr Kuru Madde Tayini: Suda znr kuru madde analizi iin AOAC 932.12 meyve ve meyve rnlerinde refraktometrik yntem uygulanarak rneklerin % briks deerleri hesaplanmtr (AOAC, 2000) rneklerin asitlii ise pH-metre ile llmtr. 3.2.4. Toplam Fenolik Madde Analizi Toplam fenolik madde analizi yaygn bir metot olan Folin-Ciocalteu yntemine gre yaplmtr. Deneyde Singleton ve Rossi (1965) nin uygulad Folin-Ciocalteu metoduna gre fenolik madde tayini yaplmtr. Bu ynteme gre uygun oranlarda seyreltilmi 300 l ekstrakt zeltisi ve 1,5 ml 2 N Folin-Ciocalteu reaktifi (10 kat seyreltilmi olarak) kartrlmtr. %7.5 (w/v) lik sodyum karbonat zeltisinden 1,2 ml eklendikten sonra tpler vortekste kartrlmtr ve 25 C de karanlkta 90 dk bekletildikten sonra UV-Vis spektrofotometrede 765 nm de absorbans llmtr. Toplam fenol ierii gallik asit kalibrasyon erisinden yararlanlarak

37

gallik asit edeeri olarak verilmitir. Deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. 3.2.5. Toplam Flavonoid Analizi Toplam flavonoid konsantrasyonu Zhinsen ve di., (1999)nin uygulad metoda gre gre kolorimetrik olarak UV spekrofotometre ile hesaplanmtr. Uygun konsantrasyondaki analiz rneinden deney tpne 1 ml alnarak zerine 4 ml distile su ilave edilmitir. Sfrnc dk da 0,3 ml %5 NaNO2 5.dk da %10 AlCl3 ve 6. dk da 2 ml 1 M NaOH ve sonrasnda 2.4 ml distile su eklenerek toplam hacim 10 ml ye tamamlanmtr. Karmn absorbans 510 nm de llm standart flavonoid olarak (+)- epikatein kullanlmtr. Deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. 3.2.6. Toplam Antosiyanin Analizi (pH Diferansiyel Metodu) Antosiyaninlerin kantitatif analizi karakteristik davranlarn gsterdikleri asidik ortamda llr. Asidik ortamda renkli oksonyum iyonu ile renksiz psedobase formu denge halindedir. Antosiyaninlerin kantitatif analizi iin bir ok metot gelitirilmitir. Bu almada Fuleki ve Francis (1968)in gelitirdikleri pH-diferansiyel metot olarak adlandrlan kolorimetrik bir yntem kullanlmtr. Bu metoda gre; antosiyaninler (%95 etanol:1.5 N HCl (85:15) zgeni ile ekstrakte edilir. Daha sonra 1 ml ekstrakt pH =1 olan tampon zelti (0.2 M KCl: 0.2 M HCl= 25:67; v/v) ile absorbans deeri 0.6 ile 0.8 arasnda olacak ekilde seyreltilir. Daha sonra ayn miktar ekstrakt pH s= 4.5 olan tampon zelti (1M sodyum asetat: 1 M HCl:Su= 100:60:90; v/v/v) ile seyreltilir ve seyreltilen rnekler karanlkta 2 saat bekletildikten sonra rnein maksimum dalga boyunda absorbanslar okunur. pH 4.5 ve pH 1.5 arasndaki absorbans fark ortalama rnein ierdii yada temel bir antosiyanin molar ekstinksiyon katsaysna blnerek toplam antosiyanin miktar belirlenir. Antosiyanin miktar denklem 3.1den yararlanlarak hesaplanmtr. Deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. Konsantrasyon (mg Ant/L) = (Abs 510 nm x103 x MW x DF) / ( . L)
: Siyanidin-3-glikozitin molar absorbsivitesi = 29.600 (Abs 510 nm): (ApH 1 - ApH 4.5 ) D.F: Seyreltme faktr L: Kvet uzunluu=1 cm MW: Siyanidin-3-glikozitin molekl arl = 445.2

(3.1)

38

3.2.7. Antioksidan Aktivitesi Tayin Yntemleri rneklerin antioksidan aktivitesi belirlenmesi amacyla 5 farkl
+

yntem radikal

kullanlmtr. Bu yntemler DPPH radikali yakalama aktivitesi, ABTS indirgeme potansiyeli kapasitesi metotlarndan olumaktadr. 3.2.7.1. DPPH Radikali Yakalama Aktivitesi

katyon yakalama aktivitesi, metal elatlama aktivitesi, linoleik asit emlsiyonu

Ekstraktlarn antioksidan aktivitesi hidrojen balama kabiliyeti yada baka bir deyile DPPH radikalini yakalama kabiliyetine dayanlarak llmtr. Analiz, Yu ve di., (2002)nin uygulad metoda gre yaplmtr. Bu ynteme gre, belli bir konsantrasyon aralndaki uygun oranda seyreltilmi rnek ekstratlarndan ve standart madde Trolokstan 0,1 ml alnm ve zerine 3,9 ml DPPH etanol solusyonu (10-4 M) ilave edildikten sonra vortekste kartrlp, reaksiyon stabil duruma gelinceye dek oda scaklnda, karanlkta 2 saat bekletilmitir. Reaksiyon sonucunda oluan rengin absorbans, spektrofotometrede 517 nm de llmtr. DPPH (y=10591x-0,0292 R2= 0,9946) ve Troloks kalibrasyon erisi izilmitir (y=9569,3x+95,196 R2=0,9901). rneklerinin EC50 deerleri DPPH kalibrasyon grafiinden yararlanlarak hesaplanm ve rneklerin gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. 3.2.7.2. ABTS
+

antioksidan aktiviteleri,

Troloksa edeer olarak hesaplanmtr. Yaplan tm deneyler 3 tekrarl olarak

Radikal Katyon Yakalama Aktivitesi

+

Ekstraktlarn antioksidan kapasitesi, ABTS olur ve ABTS+ radikali oluur.

radikal katyon yakalama kabiliyetine

dayanlarak llmtr. Bu metotta ABTS, peroksil veya dier oksidanlara okside

Analiz Wettasnghe ve di, (2002); Mathew ve Abraham (2006)nn uygulad yntemler temel alnarak uygulanmtr. Bu metoda gre ABTS+ radikal katyonu, ABTS zeltisinin perslfat ile oksidasyonu sonucunda oluturulmutur. 7 mmol ABTS suda zlm ve 2.45 mmol potasyum perslfat ile muamele edilmitir. Karm daha sonra oda scaklnda 16 saat koyu mavi renk oluana kadar bekletilmitir. Koyu mavi renkli bu zelti, tampon zelti (pH 7.4) ile absorbans 734 nm de 0.7 olana kadar seyreltilmitir. Daha sonra bu seyreltilmi zeltiden 4 ml (ABTS+ zeltisi ) alnarak 40l uygun oranlarda seyreltilmi rnek ekstrakt

39

ile kartrllm ve 4. ve 10. dk larda

absorbans spektrofotometrede 734 nm de

llmtr. ABTS+ radikal katyonundaki azalma yzde olarak hesaplanm ve sonular TEAC (Troloks edeer antioksidan kapasite) olarak verilmitir. Yaplan tm deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. ABTS+ radikal katyonundaki % azalma denklem 3.1e gre hesaplanmtr. % ABTS+ azalmas = [(Absbalang-Absson)/ Absbalang] x 100 3.2.7.3. Metal elatlama Aktivitesi Metodu Metal elatlama zellii olan antioksidan maddeler serbest demiri balamak suretiyle onu etkisizletirler ve bylece fenton reaksiyonlar sonucu oluan hidroksil ve peroksit gibi radikal oluumunu inhibe ederler. Bu deneyde rneklerin Fe+2 elatlama etkisi incelemitir. Bu amala FeCl2 zeltisi kullanlmtr. Fe+2 iyonu ve ferrozinin oluturduu kompleksin 562 nm de mor renk oluturmasna dayanlarak elatlama aktivitesi belirlenmitir. rneklerin metal elatlama aktivitesi Rival ve di, (2001); Duh ve di, (2001) nin uygulad yntemler temel alnarak uygulanmtr. Uygun oranda seyreltilmi analiz rneklerinin 1 ml si 3.7 ml %95 etanol ile kartrlmtr. Her bir rnek 0,1 ml 2 mM FeCl2 ile 60 dakika inkbe edilmitir. nkbasyondan sonra 0,2 ml 5 mM ferrozine eklenerek 10 dakika oda scaklnda bekletilmitir. Demir iyonlar ve ferrozinin oluturduu kompleksin absorbans rnek madde iermeyen etanol ile 562 nm de llmtr. Kontrol ayn koullarda hazrlanmtr. Yaplan tm 3.1

deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. yzde metal elatlama aktivitesi denklem 3.2ye gre hesaplanmtr. % elatlama Aktivitesi= [1- Absrnek / Abskontrol] X100 3.2.7.4. Linoleik Asit Emlsiyon Sistemi veya Demir-Tiyosiyanat Metodu Bu metotda linoleik asitin antioksidan madde varlnda ve antioksidan madde olmad durumda okside olma derecesi belirlenerek antioksidan aktivitesi llmektedir. Metot oksidasyon sonucu oluan peroksitleri lmeye dayanr (Glin, 2005). Linoleik asit ve antioksidan madde ieren bir sistem oluturulur ve antioksidan maddenin lipit peroksidasyonunu inhibe etme derecesi (LPI) antioksidan aktivitesinin bir gstergesi olarak kabul edilir. Analiz Duh ve di., (1997)nin 3.2

40

uygulad yntemler temel alnarak uygulanmtr. 5 ml belirli konsantrasyondaki rnek ekstrakt alnm ve 155 l linoleik asit ve 160 ml tween 20 ve 0,02 M pH= 7 olan fosfat tampon zeltisinden 45 ml eklenerek iyice kartrlmtr. Daha sonra reaksiyon karm az kapal plastik santrifj tpleri ierisinde 37 C de inkbasyona braklmtr. nkbasyon srasnda eitli zaman aralklarnda 0,1 ml rnek alnnm zerine 5 ml %75 v/v etanol, 0,1 ml %30 w/v amonyumtiyosiyanat ve 0,1 ml 0,02 M (% 3.5 HCl w/v ierisindeki ) FeCl2 eklenmi ve vortekste kartrlmtr. Lipit oksidasyonu sonucu oluan peroksitler Fe+2 iyonlarn Fe+3 ykseltger ve oluan Fe+3 tiyosiyanat ile reaksiyona girerek 500 nm de maksimum renge sahip bir kompleks oluturur. Bu nedenle karmn absorbans 500 nm de llmtr. Ayn koullar antioksidan madde iermeyen kontrol rnei iin de uygulanmtr. Yaplan tm deneyler 3 tekrarl gre hesaplanmtr. %LPI= 100 - [Absrnek / Abskontrol) x 100] 3.2.7.5. ndirgeme Gc (Redktif potansiyel) Metodu Antioksidan aktivite belirleme yntemlerinden biri olan indirgeme gc indirgeme gc Oyaizu (1986)nn uyguladklar yntem temel alnarak belirlenmitir. eitli konsantrasyondaki rnek ve standart (askorbik asit) ekstraktlarnn 1 ml si 2.5 ml 0,2 M fosfat tampon zeltisi (pH=6.6) ile kartrlmtr. Daha sonra 2.5 ml % 1 w/v potasyumferrisiyanid [K3Fe(CN)6] eklenerek 50 C de 20 dk inkbasyona braklmtr. Bu aamadan sonra reaksiyon karmna 2.5 ml trikloroasetik asit (10% w/v) eklenerek 1000 g de 10 dk santrifj edilmitir. Bu zeltinin st ksmndan 2.5 ml alnarak 2.5 ml distile su ve 0.5 ml %0.1 FeCl3 eklendikten sonra 700 nm de absorbans okunmutur. Yksek absorbans deeri yksek indirgeme potansiyelini gstermektedir. EtOH:Su (50:50 v/v) iersindeki askorbik asitin eitli konsantrasyon aralnda (0,005-0.5 mg/ml) hazrlanarak kalibrasyon erisi izilmitir. Sonular askorbik asit edeeri olarak verilmitir. Yaplan tm deneyler 3 tekrarl olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. 3.3 olarak gerekletirilmi ve sonularn ortalamas alnmtr. Lipit peroksidasyonu inhibisyonu; denklem 3.3e

41

3.2.7.6. Fenolik Madde Profillerinin Belirlenmesi rneklerin fenolik profillerini belirlemede baz modifikasyonlar uygulanarak Dragovic-Uzelac ve di., (2005)e ait metot kullanlmtr. rnekler HPLCye algam suyu, taze nar suyu ve ticari nar suyu rnei iin %50lik metanol:su zgeninde 1:1 orannda zndrlerek, mor havu ve nar ekiisi iin %50lik metanol:su zgeninde 10 gr/100 ml olacak ekilde, mor havu suyu konsantresi iin ise %50lik metanol:su zgeninde 1 gr/100 ml olacak ekilde 3 tekrarl olarak enjekte edilmitir. Kullanlan yntemin koullar Tablo 3.1 ve Tablo 3.2de verilmitir. Tablo 3.1: Uygulanan yntemin HPLC koullar
HPLC sistemi: Kolon: Mobil sistem: Mobil faz A: Mobil faz B: Kolon scakl: njeksiyon hacmi: Dalga boyu: Yazlm 280 nm (210-360 nm aras ) ve 520 nm (500-550 nm aras) Empower Build 1154 20 l Waters 2695 Seperation module, Waters 2996 PDA dedektr Supelcosil C18, 5 m, (25 x 4,6 mm) Gradient 3% asetik asit - H2O %3 asetik asit, %25 CH3CN, %72 H2O 20C

Sonular integrasyon alan hesab ile deerlendirilmitir. Alanlar, her standart iin kalibrasyon erilerinden konsantrasyon olarak hesaplanmtr. Standartlara ait kalibrasyon erileri Ek Ada sunulmutur. Tablo 3.2: HPLC metodu gradient alma koullar
Zaman 0-40 dk. 40-45 dk. 45-55 dk. 55-57 dk. 57-75 dk. Balang %A %100 A %30 A %20 A %15 A %10 A Final %A %30 A %20 A %15 A %10 A %10 A Ak Hz 1 ml / dk 1 ml / dk 1.2 ml/dk 1.2 ml/ dk 1.2 ml/dk

42

3.2.8. statistiksel Analiz Her rnek eitinin toplam fenolik madde, flavonoid madde ve antosiyanin madde ierikleri "Minitab for Windows Release 1.12" program ile karlatrlmtr. Varyans analizi (ANOVA) tablosu oluturulmu, genel lineer modelleme yaplmtr ve verilerin istatiksel olarak anlaml olup olmad incelenmitir. Model anlaml bulunduunda, Tukey ikili karlatrma testiyle %95 gven dzeyinde ikili karlatrmalar yaplarak, rnekler arasndaki farkllk incelenmitir. Ayrca DPPH yntemi ile yaplan antioksidan aktivitesi sonular ile tm rnek eitlerinin toplam fenolik madde, flavonoid madde ve antosiyanin madde ierikleri arasndaki iliki yine Minitab program ile regresyon analizi yaplarak incelenmitir.

43

4. BULGULAR VE TARTIMA

4.1. Kompozisyon Analizi: % Toplam kuru madde ve % Suda znr kuru madde deerleri Tablo 4.1de olduu gibidir. Tablo 4.1: rneklerin % toplam kuru madde ve % suda znr kuru madde deerleri
rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi % Toplam kuru madde 13,3 65,64 4,08 15,8 17,6 71,4 %Suda znr kuru madde (Briks) 62,5 4 14,5 12 68

rneklerin asitlii ise sv haldeki rnekler iin direkt olarak llmtr ve daha sonra % (85:15 EtOH: 1.5 N HCl) zgeni ile ekstrakte edilmi asidik hali llmtr ve sonular Tablo 4.2de gsterilmitir. Tablo 4.2: rneklerin pH deeri
rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi pH deeri (direkt lm) 3.45 3 3.75 pH deeri (asitli zgende) 1.45 1.22 1.25 1.52 1.68 1.57

ile

4.2. Toplam Fenolik Madde Analizi Analizlenen rneklerin ierdii fenolik bileiklerin, antioksidan aktivitesinde belirleyici grup olmalarndan dolay, rneklere ilk olarak toplam fenolik madde ve

44

daha sonra ise bu bileiklerin alt grubu olan toplam flavonoid miktar ve toplam antosiyanin madde miktar analizleri yaplmtr. Toplam fenolik madde tayini (TFM) analizinde, rneklerin toplam fenolik madde miktar gallik asit edeeri (GAE) olarak verilmitir. Bu amala ncelikle gallik asit kalibrasyon erisi izilmitir. Gallik asitin etanolik zeltisi kalibrasyon erisinin izilmesinde 0,0075-0,3 7.1de gsterilmitir.
3,5 3
Absorbans
y = 9,4574x + 0,081 R = 0,9978
2

hazrlanm ve

mg/ml konsantrasyon aralndaki

aralndaki gallik asit zeltisi kullanlmtr. Gallik asit kalibrasyon erisi ekil

2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Gallik asit konsantrasyonu (mg/ml)

ekil 4.1: Gallik asit kalibrasyon erisi Gallik asit kalibrasyon erisi izildikten sonra rnek konsantrasyonlarnn

absorbans bu kalibrasyon erisinin iinde okunacak ekilde belirlenmitir. Toplam fenolik madde analizi gallik asit kalibrasyon denkleminden yararlanlarak hesaplanmtr. 3 paralel tekrar yaplm ve ortalama alnmtr. Tablo 4.3: rneklerin toplam fenolik madde miktar rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi Miktar 1.078 mg GA/ g 15.5 mg GA/ g 1.052 mg GA/ g 5.79 mg GA/ g 3.56 mg GA/ g 2.74 mg GA/ g

Sv rnekler iin piknometre yardm ile younluklar algam suyu, taze sklm nar suyu, ticari nar suyu iin srasyla 1.01, 1.04, 1.08 g/cm3 olarak hesaplanm ve tm rneklerin fenolik madde ierii gram ekstrakta mg GAE olarak belirlenmitir.

45

Srasyla mor havu iin, mor havu suyu konsantresi iin, algam suyu iin, taze sklm nar suyu, ticari nar suyu ve nar ekisi iin 1.078, 15.5, 1,052, 5.79, 3.568, 2.74 mg GA/ g rnek olarak bulunmutur ve bu deerler ekil 4.2de gsterilmitir.

ekil 4.2: rneklerin toplam fenolik madde miktar rneklerin toplam fenolik madde miktar en yksek olarak mor havu suyu konsantresinde grlmtr, srasyla taze sklm nar suyu rnei, ticari nar suyu rnei, nar ekisi, mor havu ve algam suyu bunu izlemitir (ekil 4.2). Tek yollu Anova testi sonularna gre rneklerin toplam fenolik madde ierii arasnda farkllk olduu grlmektedir (P<0,05). Tukey testi ile rnekler arasndaki farkllk incelendiinde ise algam suyu ve mor havu rneklerinin fenolik madde ierii arasndaki farkllk istatistiksel olarak nemsiz bulunurken dier tm rneklerin birbiri arasndaki farkllk istatistiksel olarak nemlidir (P<0,05). Varyans analiz sonular ve Tukey testinin detayl sonular EK Bde Tablo B1 ve Tablo B2de verilmitir. Bulunan sonular literatrde mevcut almalarla karlatrdmzda, Kaur ve havu trlerinde fenolik madde

Kapoor (2002) Asya ktasna ait 36 sebze trnde toplam fenolik madde ierii ile ilgili olarak yapm olduklar almada baz ieriini 55 mg/ 100 g ve 115.8 mg/ 100 g olarak bildirmilerdir. Alasalvar ve di., (2001) ise mor havuta toplam fenol ieriini 102 mg/100 g olarak bulduu deer bu almada bulunan sonuca (107,8 mg/100 mg) olduka yakn gzkmektedir. algam suyu ile ilgili olarak ise bu zamana kadar toplam fenolik madde ierii ile ilgili olarak yaplm almaya rastlanamamtr. Bu almada bulunan sonular itibari ile mor havu ve algam suyunun fenolik madde ieriinin olduka yakn olduu grlmektedir. 46

Nar suyunun fenolik ierii ile ilgili

Aviram ve di., (2005)nin

yapt

bir

almada ise narda bulunan fenolik maddelerden tanenler, antosiyaninler, elajik asit ve trevleri ayr ayr hesaplanmtr. Tanenler 1978 mg/L antosiyaninler 384 mg/L elajik asit 121 mg/L olarak bildirilmitir. Gil ve di., (2000) ise nar suyunda bulunan fenolik madde ieriinin 1808-2566 mg/L aralnda olduunu belirtmilerdir. Bu almada ise taze nar suyu iin 6022 mg/L olarak ve ticari nar suyu iin 3824 mg/L olarak bulunan toplam fenolik madde miktarnn literatrde rastlanan deerlerin daha zerinde olduu grlmektedir Dier baz meyvelerin fenolik madde ierii ile ilgili almalar incelendiinde ise, Pantelidis ve di., (2006) brtlende ve ahududu meyvesinde fenolik madde ieriini srasyla 1786-2310 mg GA/100 g ve 1137-2112 mg GA/100 g olarak bildirmilerdir. Zheng ve di., (2005) ilekte fenolik madde ieriini 102 mg GA/100g olarak bildirmilerdir. Roussis ve di., (2005) ise drt eit arap rneininde toplam fenolik madde ieriini 267-1710 mg GA/L arasnda bulmulardr. 4.3. Toplam Flavonoid Analizi Toplam flavonoid analizinde rneklerin flavonoid madde miktar epikatein edeeri olarak verilmitir. Bu amala ncelikle epikatein kalibrasyon erisi izilmitir. Epikateinin etanolik zeltisi hazrlanm ve kalibrasyon erisinin izilmesinde 0,00125-0,1 mg/ml konsantrasyon aralndaki aralndaki epikatein zeltisi kullanlmtr. Epikatein kalibrasyon erisi ekil 4.3de gsterilmitir.
y = 9,6229x + 0,0033 R2 = 0,957 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Absorbans

Konsantrasyon (mg/ml)

ekil 4.3: Epikatein kalibrasyon erisi

47

Toplam flavonoid madde tayini epikatein kalibrasyon denkleminden yararlanlarak hesaplanmtr. 3 paralel tekrar yaplm ve sonularn ortalamas alnmtr. Tablo 4.4: rneklerin toplam flavonoid madde miktar rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi Miktar 0,12 mg EK/g 1,5 mg EK/g 0,205 mg EK/g 0,148 mg EK/g 0,067 mg EK/g 0,05 mg EK/g

Tm rneklerin ierdikleri flavonoid miktarn karlatrmak amacyla sv rnekler iin piknometre yardm ile hesaplanan younluklardan yararlanlarak, flavonoid madde ierii tm rneklerde gram ekstrakta mg EK edeeri olarak belirlenmitir ve bulunan sonular ekil 4.4de gsterilmitir.

ekil 4.4: rneklerin toplam flavonoid madde miktar En yksek flavonoid ierii 1,5 mg EK/g ile mor havu suyu konsantresinde grlmtr bunu srasyla algam suyu, taze nar suyu, mor havu, ticari nar suyu ve nar ekisi rnekleri izlemitir. Tek yollu Anova testi sonularna gre rneklerin flavonoid madde ierii arasnda farkllk olduu grlmektedir (P<0,05). Tukey testi ile rnekler arasndaki farkllk incelendiinde ise mor havu suyu konsantresinin flavonoid madde ieriinin dier tm rneklerden farkl olduu grlmektedir. Ayrca algam suyu rneinin flavonoid madde ierii ticari nar suyu ve nar ekisi rneklerinden istatistiksel olarak farkl bulunmutur. Dier rneklerin birbiri arasndaki fark ise istatistiksel olarak nemsiz bulunmutur (P<0,05).

48

Varyans analiz sonular ve Tukey testinin detayl sonular EK Bde Tablo B3 ve Tablo B4de verilmitir. Literatrde mevcut almalar incelendiinde bu almada analizlenen rnekler ile ilgili olarak toplam flavonoid analizine rastlanamamtr. Benzer baz meyveler ile igili baz almalar ise yledir; Lin ve Tang (2006) eitli meyvelerde toplam flavonoid madde miktarn kuersetin flavonoidi cinsinden hesaplamlar ilek iin 14.6 mg QE/ 100 g, dut iin 250.1 mg QE/ 100 g, ve erik iin 37.6 mg QE/ 100 g olarak bulmulardr. Marinova ve di., (2005) ise katein edeeri cinsinden toplam flavonoid miktarn ahududu iin 26.6 mg CE/100 g, brtlen iin 55.5 mg CE/100 g, ilek iin ise 69,7 mg CE/100 g ve tatl kiraz iin 19.6 mg CE/100 g olarak bulmulardr. 4.4. Toplam Antosiyanin Analizi rneklerin ierdii antosiyanin miktar siyanidin-3-glikozit cinsinden Tablo 4.5de olduu gibi bulunmutur. Tablo 4.5: rneklerin toplam antosiyanin madde miktar rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi Miktar 0,81 mg Ant/ g 7,5 mg Ant/g 0,86 mg Ant/g 0,161 mg Ant/g 0,029 mg Ant/g 0,022 mg Ant/g

Tm rneklerin ierdikleri antosiyanin miktarn karlatrmak amacyla sv rnekler iin piknometre yardm ile hesaplanan younluklardan yararlanlarak, antosiyanin madde ierii tm rneklerde gram ekstrakta mg siyanidin-3-glikozit edeeri olarak belirlenmitir ve bulunan sonular ekil 4.5de mg Ant /g cinsinden gsterilmitir.

49

ekil 4.5: rneklerin toplam antosiyanin madde miktar Analizlenen rneklerin iinde mor havu suyu konsantresinin en fazla miktarda antosiyanin ierdii grlmektedir. Daha sonra sras ile algam suyu, mor havu ve taze sklm nar suyu gelmektedir. Ticari nar suyu ve nar ekisinde ise antosiyaninler sl ilem sonucu degrade olduu dnlmektedir. Krca ve di., (2005) Antosiyaninlerin yksek reaktivitelerinden ve scakla olan dayankszlklarndan dolay renksiz ya da istenmeyen kahverengi bileenlere degrade olduklarn belirtmilerdir. Ancak bunun yan sra Krca ve di., (2005) mor havu antosiyaninlerinin aillenmi yapda olduklarndan tr dier antosiyaninlere kyasla sl ileme daha dayankl olduklarn belirtmilerdir. rneklerin toplam antosiyanin ierii tek yollu ANOVA testi sonularna gre farkl bulunmutur. Tukey testi ile rnekler arasndaki farkllk incelendiinde ise algam suyu ile mor havu rneklerinin antosiyanin ierii ve ticari nar suyu, taze nar suyu ile nar ekisi rneklerinin birbiri arasndaki bulunurken, dier rneklerin birbiri farkllk istatistiksel olarak nemsiz arasndaki fark ise nemli bulunmutur.

(P<0,05). Varyans analiz sonular ve Tukey testinin detayl sonular EK Bde Tablo B5 ve Tablo B6da verilmitir. Bulunan sonular literatrde mevcut baz almalar ile karlatrdmzda Mazza ve Miniati (1993) mor havucun antosiyanin ieriinin taze meyvede 1750 mg/kg kadar olabileceini bildirmilerdir. Krca ve di., (2006) ise mor havu suyunda antosiyanin ieriini 439 mg/L olarak bulmulardr. Bu almada ise mor havu iin antosiyanin miktar 818 mg/kg olarak bulunmutur. algam suyunun antosiyanin miktar ile ilgili olarak ise literatrde her hangi bir bilgiye rastlanamamtr.

50

Nar ile ilgili yaplan almalar incelendiinde; Aviram ve di., (2005)

narda

bulunan antosiyanin miktar 121 mg/L olarak bildirmilerdir. Gil ve di., (2000) ise 161.9 ila 387.4 mg/L arasnda olduunu bildirmilerdir. Bu almada taze nar suyu iin bulunan 174 mg/L deeri yaplan almalara yakn bulunmutur. Benzer gdalar ile ilgili yaplan almalar incelendiinde ise Pantelidis ve di., (2006) ise antosiyanin ieren ahududu ve brtlen gibi baz zms meyvelerde antosiyanin miktarn pH- diferansiyel metodu ile belirlemiler ve siyanidin-3glikozit edeeri olarak en yksek antosiyanin ierii 223 mg/100g ile brtlende grlrken en dk antosiyanin ierii 7.8 mg/100 g ile ku zmnde grlmtr. Zheng ve di., (2005) ilekte antosiyanin ieriini pelargonidin-3-glikozit cinsinden 20.7 mg/100 g olarak bildirmilerdir. Roussis ve di., (2005) 4 eit arap rneinde antosiyanin miktarn malvidin-3-glikozit cinsinden 0-130 mg/L arasnda bulmulardr. Blando ve di., (2004) ise kromatografik analiz sonularna gre eki kiraz eitlerinde antosiyanin ieriini 27.8 ila 80.4 mg/100 g arasnda olduunu bildirmilerdir. 4.5. Antioksidan Aktivitesi Analizleri Sonular 4.5.1. DPPH Radikali Yakalama Aktivitesi DPHH radikali yakalama metodu ile yaplan antioksidan aktivitesi lmnde ilk olarak rneklerin EC50 deeri hesaplanm ve daha sonra Troloks standart iin EC50 deeri hesaplanmtr ve rneklerin antioksidan aktivite deerleri Troloks edeerine evrilerek verilmitir. Toplam antioksidan aktivitesinde hesaplanan EC50 deeri ne kadar dkse rneklerin antioksidan aktivitesi o kadar yksektir. rnek ekstraktlarnn EC50 deeri ve Troloks edeeri Tablo 4.6 da gsterilmitir. Tablo 4.6: rnek ekstraktlarnn EC50 deeri ve Troloks edeeri
rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze nar suyu Ticari nar suyu Nar ekii Troloks EC50 0,57 (mg/ml) 0,064 (mg/ml) 0,000556 (ml/ml) 0,000377 (ml/ml) 0,000441(ml/ml) 0,3447 (ml/ml) 0,00472 (ml/ml) Standart sapma 0,026 0,004 1,271E-05 1,21 E-05 3,61 E-05 0,007 Troloks edeeri 33 mol TE/g 294.64 mol TE/g 33.57 mol TE/g 52.12 mol TE/g 46.24 mol TE/g 54.8 mol TE/g -

51

Deneysel almalar sonucunda elde edilen antioksidan aktiviteleri; mor havu, mor havu suyu konsantresi, algam suyu, taze sklm nar suyu, ticari nar suyu, nar ekisi iin srasyla 33, 294.64, 33.57, 52.12, 46.24, 54.8 mol TE/g olarak bulunmu ve bu deerler ekil 4.6da karlatrmal olarak gsterilmitir.

ekil 4.6: Troloks edeeri olarak rneklerin antioksidan aktivitesi Konsantre edilmi mor havu suyu rneinde antioksidan aktivite en yksek olarak gzlenirken en dk aktivite ise mor havuta grlmtr. Troloks standard mor havu suyu konsantresinden yaklak 14 kat mor havutan ise 121 kat daha yksek aktivite gstermektedir. Yaplan aratrmada mor havu ve konsantresine ait litetarr almalarnn snrl sayda olduu grlmtr. El ve Karakaya (2004) yaptklar almada Troloksun mor havutan 128 kat daha fazla aktivite gsterdiini bulmulardr. Nar suyu ile ilgili olarak ise literatrde mevcut almalardan Gil ve di., (2000) e bakldnda eitli ticari nar suyu rnekleri ile allm ve nar suyunun krmz arap ve yeil ay rneklerinden yaklak 3 kat daha fazla antioksidan aktivite gsterdii DPPH metoduna gre belirlenmitir. Bir baka almada, nar kabuu ve tohumunun ekstraktlarnda in vitro model

kullanlarak DPPH metodu ile aktivite belirlenmitir. 50 ppm de nar kabuunun metanol ekstraktnn antioksidan aktivitesi %81 olarak 100 ppm de nar tohumunun metanol ekstraktnn antioksidan aktivitesi % 23.2 olarak rapor edilmitir (Singh ve di., 2002). Aviram ve di., (1999) ise nar suyunun oksidatif stresi drmesi ile ilgili olarak yapm olduklar almada antioksidan aktivitesini DPPH metodu ile lmler ve 52

nar suyunun antioksidan aktivitesini E vitamini edeeri olarak 50 mmol E vit/L olarak bulmulardr. Troloksun E vitamini analogu olduu dnlecek olursa, bu almada taze nar suyu iin bulunan 52,12 mol TE/g deerinin Aviram ve di., (1999)nin bulduu sonuca olduka yakn olduu grlmektedir. Bu almada ise DPPH metodu ile antioksidan aktivitesi belirlemede rneklerin Troloks standard cinsinden EC50 deerleri karlatrlm ve taze nar suyu rneinin mor havu ve algam suyuna gre yaklak 1.5 kat daha yksek aktivite gsterdii grlmtr. Bulunan sonulara gre nar suyunun iyi bir serbest radikal yakalayc olduu gzlenmitir. Ancak taze nar suyu rneinin Troloks edeerinin ticari nar suyuna gre nispeten daha yksek olduu grlmtr. Ayrca bu yntem ile yaplm literatrde mevcut dier baz almalar incelendiinde, Miller ve di., (2000) eitli meyvelerde DPPH metodu ile antioksidan aktivitesini krmz elma iin 14 mol TE/g, krmz zm iin 17 mol TE/g, muz iin 11 mol TE/g, kivi iin 10 mol TE/g, armut iin 6 mol TE/g, domates iin 2 mol TE/g olarak bulmutur. Buradaki sonular gz nne alndnda, almada analizlenen tm rneklerin krmz zm, krmz elma, kivi, muz, armut ve domatesten daha yksek antioksidan aktivitesine sahip olduu grlmektedir. 4.5.2. ABTS
+

Radikal Katyon Yakalama Aktivitesi

+

Bu metotda rnek ekstraktlarnn antioksidan kapasitesi ABTS yakalama kabiliyetine gre llm ve sonular kyaslanmtr. ABTS
+

radikal katyonunu standard ile

Troloks

ve rnek ekstraktlarnn reaksiyonundan 4.ve 10. dakikalardan sonra 734

nm de spektrofotometrik olarak lm yaplmtr. Ayrca rneklerin belirlenen konsantrasyonlarda TEAC deerlerinin hesaplanmas amacyla 0-3 mM aralnda Troloks iin ayn ilemler uygulanmtr. ABTS (TEAC) ve yzde ABTS
+ +

inhibisyonunun olduka hzl Troloks edeeri

gerekletii gzlenmitir. rneklerin antioksidan aktiviteleri

inhibisyonu olarak Tablo 4.7 ve 4.8de gsterilmitir.

53

Tablo 4.7: 4.dakikada % ABTS rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi
a: mg rnek/ml zgen b: ml rnek/ml zgen

azalmas ve Troloks edeeri

balang

rneklerin

konsantrasyonu

%ABTS + inhibisyonu
92,58 1,7 65,28 5,6 49,69 2,6 100 69,3 3,3 50,56 2 49,36 4,6 30,51 1,3 23,9 4 100 88.5 1,34 62.45 1,5 100 72,28 1,5 51,88 2,5 100 77,17 5,2 43,12 2,49

TEAC

(mM troloks)
2,79 0,05 1,90 0,17 1,33 0,081 3 2,03 0,1 1,43 0,06 1,39 0,14 0,79 0,04 0,58 0,12 3 2,64 0,04 1,83 0,04 3 2,12 0,04 1,46 0,06 3 2,27 0,16 1,22 0,07

200 a 100a 50a 10a 5a 2,5a 0,2 b 0,1 b 0,05 b 0,05 b 0,025b 0,0125 b 0,05 b 0,025b 0,0125b 200 a 100 a 50 a

Tablo 4.8 : 10.dakikada % ABTS rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu
Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu
rneklerin

azalmas ve Troloks edeeri

balang

konsantrasyonu

%ABTS + inhibisyonu
100 71,5 2,1 51,9 2, 6 100 79,8 3,8 53,5 2 55,4 3,6 32,1 1,6 25,9 2,6 100 94,65 2 60 3,5 100 74,48 2,8 42,32 0,3 100 76,7 2 50 4,7

TEAC

(mM troloks)
3 2,1 1,77 3 2,36 1,52 1,59 0,85 0,65 3 2,83 1,73 3 2,2 1,16 3 2,26 1,41 0,06 0,08 0,12 0,03 0,11 0,02 0,08 0,06 0,11 0,09 0,01 0,06 0,14

Nar ekisi
a: mg rnek/ml zgen b: ml rnek/ml zgen

200 a 100a 50a 10a 5a 2,5a 0,2 b 0,1 b 0,05 b 0,05 b 0,025b 0,0125 b 0,05 b 0,025b 0,0125b 200 a 100 a 50 a

54

Belirli konsantrasyondaki rneklerin ABTS radikal katyonu yakalama aktivitesine bakldnda mor havu iin en etkili konsantrasyonun 200 mg/ml olduu ve bu konsantrasyonda ABTS
+

inhibisyonunun % 100 olduu grlmtr. Mor havu

suyu konsantresi ise 10 mg/ml de % 100 inhibisyon salamtr. algam suyunun ise 0,2 ml/ml konsantrasyonda yaklak % 55 lik bir inhibisyon salad grlmtr. Nar suyu rnekleri ise 0,05 ml/ml konsantrasyonda % 100 inhibasyon salamtr. Nar ekisi ise 200 mg/ml de % 100 inhibisyon salamtr. algam suyunun dier rneklere gre daha dk aktivite gsterdii dikkat ekicidir. algam suyu DPPH radikaline kar daha yksek aktivite gsterirken ABTS radikal katyonuna kar daha dk aktivite gstermitir. Buradan kan sonuca gre, rneklerin antioksidan aktivitelerinin farkl yntemlere gre direkt olarak karlatrlamayacadr. Bunun nedeni antioksidan aktivitesini len tm bu metotlarn farkl reaksiyonlara ve koullara bal olmalar olarak aklanabilir. Bu metot ile ilgili literatrde mevcut almalar incelendiinde, Garcia-Alanso ve di., (2003) 28 eit meyvede antioksidan aktivitesini TEAC metodu ile belirlemilerdir. Trabzon hurmas 406 mol TE/g ile en yksek aktiviteyi gsterirken, bunu sras ile 192 mol TE/g deeri ile brtlen ve 163 mol TE/g deeri ile ilek izlemitir. Nar ise yaklak olarak 50 mol TE/g deere sahip grlm, krmz zm ise yaklak 25 mol TE/g ile nar suyundan daha dk aktivite gstermitir. Blando ve di., (2004) eki kiraz eitlerinde TEAC deerini 2000-2600 mol TE/100 g olarak bildirmilerdir. Glin (2005) ise 25 g/ml konsantrasyonundaki kafeik asitte antioksidan aktivitesini % ABTS olarak %92.9 olarak bulmutur. Mor havu ve algam suyu rnekleri ile ilgili olarak ise literatrde mevcut almaya rastlanamamtr. 4.5.3. Metal elatlama Aktivitesi rneklerin metal elatlama aktivitesi sonular Tablo 4.9da gsterilmitir. Bu analizde FeCl2 nin ferrozin ile koyu mor renkli bir kompleks oluturmasna dayanlarak spektrofotometrik olarak lm yaplmtr. Antioksidan maddeler tarafndan elatlanan demir iyonlar ferrozin tarafndan oluacak olan balanamayaca iin mor renk iddeti daha dk olacak ve absorbans daha dk
+

inhibasyonu

okunacaktr. Dk absorbans deeri yksek elatlama aktivitesini gstermektedir.

55

Yaplan n denemelerde rnekler 10 dak, 30 dak ve 60 dak sre ile FeCl2 ile inkbasyona braklmtr. 10. ve 30. dakikalarda elatlama aktivitesinin olduka dk olduu grlmtr. rneklerin FeCl2 ile inkbasyon sresinin artmas ile elatlama etkilerinin artt gzlenmi ve rneklerin elatlama aktivitesi 60 dak inkbe edildikten sonra belirlenmitir. Ayrca tm rneklerin elatlama aktivitesi konsantrasyon iin belirlenmitir. Yaplan n denemelerde konsantrasyon deerinin belli bir deerin zerine kmas durumunda elatlama aktivitesinin artmad aksine azald (pro-oksidan etki) grlmtr. Bu durumda maksimum elatlama aktivitesi 0,1 ml rnek /ml zgen grlmtr. Tablo 4.9: rneklerin metal elatlama aktivitesi rnek
rneklerin balang konsantrasyonu

konsantrasyonundaki

taze nar suyunda (% 60.8)

% elatlama Aktivitesi 48,4 2,7 38,5 0,7 26,3 0,8 53,2 2 43,6 0,7 31 1,3 45,7 0,8 34,4 2,8 26,2 0,9 60,8 0,17 49,8 1,8 20,9 3,5 59,9 0,53 42,8 2,2 11,8 2,1 53,4 1,28 34,4 1,4 26 1,7

Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi
a: mg rnek/ml zgen b: ml rnek/ml zgen

100 a 50 a 25 a 10 a 5a 2,5 a 0,1 b 0,05 b 0,025 b 0,1 b 0,05 b 0,025 b 0,1 b 0,05 b 0,025 b 100 a 50 a 25 a

Metal elatlama aktivitesini etkileyen en nemli zellik, fenolik bileiklerin yapsnda bulunan fonksiyonel gruplara ve bu fonksiyonel gruplarn pozisyonuna ve bulunma miktarna baldr. Yapsnda, -OH, -SH, -COOH, -PO3H2, C=O, -NR2, -Sve O- fonksiyonel gruplarndan en az iki tane bulunduran ve bunlarn uygun yap ve fonksiyonel konfgrasyonundaki fenolik bileiklerin, elatlama zelliklerinin daha iyi olduu grlmtr (Arora ve di., 1998; Glin, 2005). Bu nedenle 56

rneklerin elatlama aktivitesindeki farkllk, fenolik madde miktarlarnn farkl olmasnn yan sra, farkl yap ve pozisyonlardaki fenolik madde gruplarna sahip olmalar ile aklanabilmektedir. El ve karakaya (2004), 200 mg/l konsantrasyonundaki turp ve mor havu iin 60 dk inkbasyon sresinden sonra alnan lmlerde elatlama aktivitesini srasyla %72.8 ve 78.9 olarak bulmulardr. Bu almada ise mor havu iin % 48.4 olarak bulunan elatlama aktivitesi, El ve karakayann almasnda bulunan sonutan daha dk gzlenmitir. almada analizlenen dier rnekler ile ilgili olarak ise literatrde mevcut almaya rastlanamamtr. Karlatrma yapmak amac ile literatrde mevcut dier almalar incelendiinde ise Glin (2005) 10 g/ml konsantrasyonundaki kafeik asit iin elatlama aktivitesini % 53.2 olarak bulurken referans antioksidanlarn ayn konsantrasyondaki elatlama aktivitesini BHA iin, % 72.1, BHT iin % 64.3 tokoferol iin % 21.6 ve Troloks iin % 48.5 olarak bulmutur. Kulkarni ve di., (2004)nin nar suyunda bulunduu bilinen fenolik maddelerden biri olan punikalagin ile ilgili yaptklar almada, metal elatlama aktivitesi punikalagin iin 100 g/ml konsantrasyonda % 1.67 olarak olduka dk miktarda bulunmutur ve yapsnda olduka fazla hidroksil iyonu bulunduran punikalagin maddesinin niin elatlama aktivitesi gstermedii aklanamamtr. Buradan gzlenen sonuca gre, hidroksilasyon saysnn, yan sra fenolik maddelerin yapsal durumun elatlama zerinde olduka etkili bir faktr olduudur. 4.5.4. Linoleik Asit Emlsiyon Sistemi veya Demir tiyosiyanat Metodu Bu almada analizlenen tm rnek ekstraktlarnn linoleik asit emlsiyonun

sistemi iinde iyi bir antioksidan olduu lipit peroksidasyonunu nemli lde inhibe ettii grlmektedir. Tablo 4.10 ve ekil 4.7 rneklerin eitli zaman aralklarnda llen linoleik asit peroksidasyon inhibisyon yzdeleri gstermektedir.

57

Tablo 4.10: rneklerin eitli zamanlardaki linoleik asit peroksidasyon inhibisyon yzdesi rnek
Mor havu (200 mg/ml) Mor havu suyu konsantresi (20 mg/ml) algam suyu (0,2 ml/ml) Taze nar suyu (0,2 ml/ml) Ticari nar suyu (0,2 ml/ml) Nar ekisi (100 mg/ml)

3. saat
16,90,7 13,42,8 22,60,7 23,53,2 17,9 2,9 131,6

1. gn
81,41,3 76,60,5 76,60,5 772,5 76,93,1 60,92,5

2.gn
81,90,7 78,30,5 83,10,3 841,4 81,70,5 68,22,7

6.gn
852 83,80,8 79,61,8 84 0,7 81,62,2 81,71

10.gn
92,90,5 93,41,2 920,6 95,60,4 91,21 80,90,6

% Lipit peroksidasyonu inhibasyonu

120 100 80 60
algam suyu Mor havu Mor havu suyu kons Nar ekisi

40 20 0 3. saat 1. gn 2.gn 6.gn 10.gn

Taze nar suyu Ticari nar suyu

ekil 4.7: Linoleik asit peroksidasyon inhibisyonunun grafiksel olarak gsterimi Tablo 4.10a ve ekil 4.7ye bakldnda peroksidasyonuna kar olduka yksek tm rneklerin gcne linoleik asit sahip olduu

inhibisyon

grlmektedir. rneklerin lipit peroksidasyonunu inhibe etmesi eitli zaman aralklarnda llm ve inhibisyonun zamanla artt grlmtr. 3. saatte yaplan lmlerde linoleik asitin yeterince okside olmamas nedeni ile antioksidan madde ieren rneklerde absorbans deeri kontrol rneine yakn bulunmutur. Linoleik asitin zamanla okside olmas ile kontrol rneinin absorbans artm ve rneklerin lipit peroksidasyonu inhibe etme yzdesi de zamanla artmtr ve tm rneklerde en iyi inhibisyon 10. gnde grlmtr. Belirlenen konsantrasyon aralndaki rnek ekstraktlarnn lipit peroksidasyonunu inhibe etme dereceleri olduka yakn olarak hesaplanm tm rnek ekstraktlar 6. gnn sonunda %80in zerinde aktivite

58

gstermitir. 10. gnde ise taze nar suyu rneinin % 95.6 ile en yksek aktiviteye sahip olduu grlmektedir. Literatrde mevcut almalar incelendiinde bu almadaki analiz rnekleri ile ilgili olarak bu metot ile yaplm almaya rastlanamamtr. Karlatrma yapmak amac ile Glin (2005)in kafeik asitte antioksidan aktivite belirleme ile ilgili yapm olduu alma incelendiinde 12. saatin sonunda yaplan lmlerde kafeik asitin linoleik asit inhibisyonunu srasyla 20 g/ml ve 10 g/ml konsantrasyonda % 75.8, % 68.2 olduu grlmtr. Referans standart olarak kullanlan BHA, BHT, tokoferol ve Troloks iin ise 20 g/ml konsantrasyonda linoleik asit inhibisyonunu srasyla % 74.4, %71.2, % 54.7, % 20.1 olduu grlmtr. Que ve di., (2006)nin yapm olduu alma incelendiinde ise, linoleik asit sistemi iersinde 100 l olarak bulunan sar renkli arap rneinde, 120 saat sonunda yaplan lmlerde linoleik asit inhibisyonunun % 97.99 olduu grlmtr ayrca ayn almada 1 g/L tokoferol ve 1 g/L BHA referans standart maddelerinin 100 lsi iin linoleik asit inhibisyonu srasyla %77.1 ve % 98.35 olarak bulunmutur. Mathew ve Abraham (2006) ise 48. saat iinde yaptklar lmde 200 g/ml tarn kabuu ekstrakt ve 200 g/ml BHA iin srasyla % 93.3 ve % 89.8 olarak bulmulardr. 4.5.5. ndirgeme Gc Metodu (Redktif Potansiyel) rneklerin demir(III) iyonlarn indirgeme gcne dayanlarak antioksidan aktivitesi belirlemeye dayanan bu yntemde her bir analiz rnei iin uygun olan iki konsantrasyonda allm ve sonular askorbik asit iin izilen kalibrasyon

erisinden yararlanlarak askorbik asit standartna evrilerek karlatrlmtr. ekil 4.8 askorbik asitin indirgeme gcn gstermektedir.
y= 7,1776x+ 0,2618 R2 = 0,9664

4,00 3,50

Absorban

3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6

askorbik asit (m l) g/m

ekil 4.8 : Askorbik asitin indirgeme gcne dayanlarak izilen kalibrasyon erisi

59

Tablo 4.11de rneklerin askorbik asit edeeri gsterilmitir. En yksek deer 10 mg/ml konsantrasyonundaki mor havu suyu konsantresinde grlmtr, ardndan 0,2 ml/ml konsantrasyonundaki taze ve ticari nar suyu rnei gelmektedir. Analizlenen rneklerin ierisinde en dk indirgeme gc ise algam suyunda grlmtr. Yaplan n denemelerde rnek konsantrasyonlarnn bu analiz iin hesaplanm olan konsantrasyon deerlerinin zerine karlmas durumunda indirgeme gcnn artmad grlmtr. Bunun nedeni ise antioksidan maddelerin belirli bir konsantrasyonun zerinde azalma eilimi (pro-oksidan etki) gstermeleri ile aklanabilmektedir. Tablo 4.11: rneklerin askorbik asit edeeri olarak indirgeme gc rnek Mor havu Mor havu suyu konsantresi algam suyu Taze sklm nar suyu Ticari nar suyu Nar ekisi
a: mg rnek/ml zgen b: ml rnek/ml zgen

rneklerin balang konsantrasyonu

100 a 50 a 10 a 5a 0,2 b 0,1 b 0,2 b 0,1 b 0,2 b 0,1 b 100 a 50 a

Askorbik asit edeeri (mg/ml)

0,16 0,01 0,13 0,01 0,25 0,05 0,18 0,07 0,08 0,01 0,05 0,001 0,2 0,05 0,15 0,01 0,20 0,01 0,17 0,01 0,15 0,01 0,14 0,01

Analizlenen rneklerin indirgeme gc ile ilgili olarak literatrde mevcut almaya rastlanamamtr. Liyana-Patrihana ve di., (2005) bir eit kiraz (Laurocerasus officinalis Roem) trnde ve pekmezinde antioksidan aktivitesini indirgeme gc metodu ile belirlemiler ve sonular M askorbik asit cinsinden ifade etmilerdir. Kiraz iin 100 ppm, 200 ppm ve 400 ppm konsantrasyonlarda sras ile 7 0.1 M, 11.8 0.1 M, 20,7 0.1 M olarak, pekmezinde ise 100 ppm, 200 ppm ve 400 ppm konsantrasyonlarda sras ile 6.2 0.2 M , 17.2 0.5 M, 39.3 0.7 M olarak hesaplanmtr. Katein referans ise 100 ppm , 200 ppm ve 400 ppm de 622 M olarak hesaplanmtr. Que ve di., (2006)nin yapm olduu alma incelendiinde ise, 200 l sar renkli arap rnei iin indirgeme gcn yaklak 0,3 Abs deeri olarak bulunmutur.

60

ndirgeme gcn referans standartlardan 200 l ve 1 g/L tokoferol ve 1 g/L BHA iin ise srasyla 1.1 ve 0.7 Abs deeri olarak bulmulardr. 4.6. rneklerin Fenolik Madde Profilleri Antioksidan aktiviteleri eitli metotlar ile ve fenolik madde miktarlar Folin-

ciocalteu metodu ile belirlenmi olan rneklerin, fenolik madde profilleri HPLC sisteminde tanmlanmtr. Standartlara ait kolonda alkonma sreleri Tablo 4.12de verilmitir. Mor havu suyu konsantresi ekstraksiyonuna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.9 ve ekil 4.10da ve deerlendirme sonular Tablo 4.13de, Mor havu ekstraktna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.11 ve ekil 4.12de ve deerlendirme sonular Tablo 4.14de, algam suyu ekstraktna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.13 ve ekil 4.14de deerlendirme sonular Tablo 4.15de, Taze nar suyu ekstraktna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.15 ve ekil 4.16da ve deerlendirme sonular Tablo 4.16 da, Ticari nar suyu ekstraktna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.17 ve ekil 4.18de deerlendirme sonular Tablo 4.17de, Nar ekisi ekstraktna ait HPLC kromatogramlar ekil 4.19ve ekil 4.20de deerlendirme sonular Tablo 4.18 de, verilmitir. Tablo 4.12: Standartlara ait kolonda alkonma sreleri
Alkonma Sresi (dak.) 5.9 8.7 9.2 18.4 20.5 22.6 24.9 26.6 27.1 31.9 36.7 36.8 39.6 56.2 56.8 57.5 Fenolik bileen Gallik asit 3,4 Dihidroksibenzoik asit (-)- Gallokatein (+)- Katein Klorojenik asit Kafeik asit (-)- Epigallokateingallat irinjik asit (-)-Epikatein P-Kumarik asit Sinapik asit Ferulik asit Rutin Kuersetin dihidrat (-)-Katein Luteolin

61

1 9 .9 3 6

0.040

0.030 AU

3 .1 0 3

3 .8 8 8

0.020

0.010

0.000 0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

2 1 .4 8 5 2 2 .3 4 0 2 4 .2 5 5 2 6 .3 8 1 2 7 .2 0 3 2 9 .0 0 2 3 0 .0 1 6

1 0 .0 4 6

25.00

30.00 Minutes

35.00

3 5 .6 0 5
40.00

3 7 .3 8 8 3 8 .4 2 0

0.050

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.9: Mor havu suyu konsantresi kromatogram

ekstraktna ait 280 nm de

HPLC

Tablo 4.13: Mor havu suyu konsantresi ekstraktndaki fenolik bileikler

Alkonma sresi (dak)
3.103 3.888 10.046 19.936 21.485 22.340 24.255 26.381 27.203 29.002 30.016 35.605 37.388 38.420

Fenolik madde Solvent piki TM 3,4 dihidroksibenzoik asit Klorojenik asit Kafeik asit TM (-)-Epigallokateingallat irinjik asit (-) - Epikatein TM TM Antosiyanin Antosiyanin Antosiyanin

Alan
124009 29962 48235

% Alan
2.90 0.70 1.13

Ykseklik
37617 8343 4057 118643 8355 1337 2529 889 2458 4491 1490 6756 80243 24609

Miktar (mg/Kg)
180 5900 186 320 47 355 -

1666160 38.93 189355 18056 36431 12857 57604 98573 24175 379050 355353 4.42 0.42 0.85 0.30 1.35 2.30 0.56 8.86 8.30

1240583 28.98

TM: Tanmlanamayan madde

0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

ekil 4.10 : Mor havu suyu konsantresi ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram

62

30.992

34.688

AU

3.269

0.05

36.320 37.245

Elde edilen kromatogram sonularna gre mor havu suyu konsantresinde

3,4

dihidroksibenzoik asit, klorojenik asit, kafeik asit, (-)- epikatein, (-) epigallokatein gallat ve irinjik asit varl tanmlanmtr. Klorojenik asitin 5900 mg/kg ile mor havu suyu konsantresine ait temel fenolik bileen olduu grlmektedir. Kammarer ve di., (2004)in, mor havu ekstraktnda yaptklar almada p-kumarik, kafeik ve ferulik asit gzlenmi ve ayrca hidroksi benzoik asit trevleri ve kuersetin glikozit de tespit edilmitir. Kammarer ve di yapm olduu almada klorojenik asit mor havuun kklerinde 657 mg/kg ile ve konsantresinde 5815 mg/kg ile en baskn bileen olduu belirtilmitir. Ayrca mor havuun fenolik maddelerden olan antosiyaninlerce zengin olduu bilinmektedir. Mor havuta bulunan antosiyaninler aillenmi yapda olan veya aillenmemi olan siyanidin trevleridir. Bu almada antosiyanin madde varl ayn kromatografik koullarn 520 nm deki dalga boyunda incelenmesi ile belirlenmitir. 280 nm ve 520 nm deki pikler incelendiinde 520 nm deki kromatogramn daha sade olduu grlmektedir. Bunun nedeni fenolik maddelerden antosiyaninlerin grnr 510-535 nm arasnda absorblarken dier fenolik maddelerin bu dalga boyu aralnda renksiz olmalardr. Bu almada Revilla ve Ryan (2000)n zm ve arap ekstraktlarndan HPLC yntemi ile antosiyanin ve dier fenolik maddelerin ayrm iin kullandklar farkl dalga boyu yntemi rnek alnmtr. Sonu olarak 35.6, 37.3, 38.4 daklarda gzlenen piklerin antosiyaninlere ait olduu belirlenmitir. Kromatogram incelendiinde antosiyaninlerin yzde olarak tm fenolik maddelerin iinde yaklak % 47.5 lik alan tarad grlmektedir.
0.050

0.030 AU

3 .2 6 8

0.040

0.010

0.000 0.00

5.00

10.00

15.00

1 5 .5 9 9

1 9 .4 1 8

8 .2 1 0

20.00

2 3 .7 6 5 2 4 .8 0 3 2 6 .8 3 3

4 .0 6 6 5 .0 4 0

25.00

30.00 Minutes

35.00

3 8 .4 6 1
40.00

0.020

3 4 .3 8 3

3 7 .4 2 3

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.11: Mor havu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram 63

Tablo 4.14: Mor havu ekstraktndaki fenolik bileikler

Alkonma sresi (dak) Fenolik madde Alan 129055 29549 51144 59985 15108 17447 22742 33311 114143 172432 592234 26018 % Alan 10.12 2.32 4.01 4.71 1.19 1.37 1.78 2.61 8.95 13.53 46.46 2.04 Ykseklik 40934 7867 4889 2561 1139 1233 1686 2676 3099 6204 40437 1893 Miktar (mg/Kg) 21.47 6 27.46 78.16 -

3.268 Solvent piki 4.066 TM 5.040 TM 8.210 3,4 dihidroksibenzoik asit 15.599 TM 19.418 Klorojenik asit 23.765 TM 24.803 (-)-Epigallokateingallat 26.833 (-)- Epikatein 34.383 Antosiyanin 37.423 Antosiyanin 38.461 Antosiyanin TM: Tanmlanamayan madde

3.119

AU

35.496
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Minutes 35.00

0.020 0.010 0.000 0.00

38.178
40.00

37.230

0.030

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.12: Mor havu ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram Elde edilen kromatogram sonularna gre mor havu ekstraksiyonunda 3,4 dihidroksibenzoik asit, klorojenik asit, kafeik asit, (-)- epigallokatein gallat ve (-)epikatein varl tanmlanmtr. Mor havuun konsantresinde grlen kafeik asit ve irinjik asit dndaki tm fenolikler mor havu ekstraksiyonunda da grlmtr. Ancak klorojenik asit mor havuta ok dk miktarda grlmtr. 3,4 dihidroksibenzoik asit ekstraktnda deeri konsantresinde 180 mg/kg iken mor havu (%88 azalma), (-) epigallokatein gallat deeri 21.47 mg/kg

konsantesinde 320 mg/kg iken mor havu ekstraktnda 27.46 mg/kg (% 91 azalma), (-) epikatein deeri konsantresinde 355 mg/kg iken mor havu ekstraktnda 78.16 mg/kg (%75 azalma) olarak grlmtr. 280 nm ve 520 nm deki her iki kromatogram antosiyaninlere incelendiinde ait olduu 35.4, 37.2, 38.1.daklarda grlen piklerin belirlenmitir. Kromatogram incelendiinde

antosiyaninlerin yzde olarak tm fenolik maddeler iinde yaklak % 69 lk alan tarad grlmektedir.

64

0.10

2 0 .0 1 4

0.08

3 .1 0 9

0.06 AU

0.02

0.00 0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

2 3 .1 4 9

25.00

30.00 Minutes

2 9 .5 1 6

0.04

3 .9 3 3

3 2 .6 6 8
35.00

3 8 .1 9 7 3 9 .3 1 6
40.00 45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.13: algam suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram Tablo 4.15: algam suyu ekstraktndaki fenolik bileikler
Alkonma sresi (dak) Fenolik madde 3.109 Solvent piki 3.933 TM 20.014 Klorojenik asit 23.149 Kafeik asit 29.516 TM 32.668 p- Kumarik asit 38.197 Antosiyanin 39.316 Antosiyanin TM: Tanmlanamayan madde Alan 626999 67013 1686821 61760 215982 1452583 3391016 5162180 % Alan 4.95 0.53 13.32 0.49 1.71 11.47 26.78 40.76 Ykseklik 94975 15866 118699 4376 6583 45451 194965 241723 Miktar (mg/L) 119.4 0.826 30.75 -

AU

0.02 0.00 0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

2 8.7 21

30.00 Minutes

3 1 .5 62

35.00

3 5.5 09

3 .1 1 8

0.04

3 7 .2 05 3 8 .1 56
40.00

0.06

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.14: algam suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram Elde edilen kromatogram sonularna gre algam suyunda klorojenik asitin 119.4 mg/L ile en baskn fenolik olduu grlmektedir. Klorojenik asitin yan sra algam suyunda 30.75 mg/L p-kumarik asit varl tanmlanmtr ayrca ok dk

65

miktarda kafeik asit grlmtr. 520 nm deki kromatogram incelendiinde ise 35.5, 37.2, 38.1 dak larda grlen piklerin algam suyu antosiyaninlerine ait olduu grlmektedir. Antosiyaninlerin ise yzde olarak tm fenolik maddeler iinde yaklak % 65 lik alan tarad grlmektedir.
3 . 8 5 93 . 0 8 8 5 .0 5 0 9 .0 0 2
0.20

1 5 .4 0 1

1 2 .2 7 7

1 8 .2 1 9 1 9 .9 3 9

AU

0.05

0.00 0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00 Minutes

35.00

3 7 .6 5 2 3 9 . 23 084. 4 6 5
40.00 45.00

0.10

5 .4 0 6

2 2 .7 1 4

2 9 .5 1 3 3 4 .7 3 4

0.15

2 1 .3 3 2

50.00

55.00

60.00

ekil 4.15: Taze nar suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram Tablo 4.16: Taze nar suyu ekstraktndaki fenolik bileikler
Alkonma sresi (dak) Fenolik madde 3.088 Solvent piki 3.859 TM 5.050 TM 5.406 Gallik asit 9.002 (-) Gallokatein 12.277 TM 15.401 TM 18.219 (+) Katein 19.939 Klorojenik asit 21.332 Kafeik asit 22.714 TM 29.513 TM 34.734 TM 37.652 Ferulik asit 38.465 TM 39.204 Rutin Alan 8316512 672310 986755 591032 5381890 1714084 8627183 239791 303392 1154236 624244 1122964 827867 351749 403607 118252 % Alan 26.46 2.14 3.14 1.88 17.12 5.45 27.44 0.76 0.97 3.67 1.99 3.57 2.63 1.12 1.28 0.38 Ykseklik 1357418 123567 96057 37280 213195 58268 356779 12975 22344 90451 48162 74771 11984 25200 27294 8083 Miktar (mg/L) 3 162 30 20.6 31.7 15.6 16.9

66

22.752

3 .3 3 2

0.010

1 8.937

0.005

0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

ekil 4.16: Taze nar suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram Nar suyunun hidrolize olabilen tanenler ve antosiyaninlerce zengin bir rn olduu bilinmektedir. Nar suyunda bulunan hidrolize tanenlerin 417.3-556.6 mg/g antosiyaninlerin ise 161.9-387.4 mg/L aralnda olduu rapor edilmitir (Gil ve di., 2000). Du ve di., (1970) pelargonidin, delphinidin, ve siyanidin-3-glikozit ve 3,5 diglikozit antosiyaninlerini nar suyunda tanmlamlardr. Yakn zamanlarda ise Gil ve di., (2000) Siyanidin 3-glikozitin 59.5- 128 mg/L ile nar suyunun temel antosiyanini olduunu belirtmilerdir. Nar suyunda bulunan hidrolize tanenler ise gallotanenler, elajik asit, galliltanenler, punikalagin ve punikalin olarak belirtilmitir (Gil ve di., 2000). Bunlarn yan sra nar suyunda dk miktarlarda katein, epikatein, gallokatein, prosiyanidin varl tanmlanmtr (de Pascual-Teresa ve di., 2000). Bu almadaki kromatogram sonularna gre taze nar suyu rneinde gallik asit, (-)- gallokatein, (+) katein, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit ve rutin varl tanmlanmtr. (-)- gallokatein 162 mg/L ile en yksek deere sahiptir. Ayrca 520 nm deki kromatogramda grlen pikler nar suyu antosiyaninlerine aittir.
3 .0 8 9 5 .4 1 2
0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00

9 .3 5 2 1 0.4 6 7

1 0 38 2 0 .9 .1 3 4 2 1.5 13 2 2.4 21

2 9.5 8 8

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

2 5 .6 .0 4 7 2 5 13

30.00 Minutes

32.726

35.00

3 7 .3 82
40.00

2 8.5 84

AU

3 2.8 08
45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.17: Ticari nar suyu ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram 67

Tablo 4.17: Ticari nar suyu ekstraktndaki fenolik bileikler

Alkonma sresi (dak) Fenolik madde Alan 6810588 129582 148565 69156 193946 113432 157577 113233 73594 100638 92181 344292 829590 % Alan 65.85 12.53 1.44 0.67 1.88 1.10 1.52 1.09 0.71 0.97 0.89 3.33 8.02 Ykseklik 2049355 74249 9557 3920 8447 7077 8370 7321 3193 4878 7062 6643 21566 Miktar (mg/L) 7.8 13.6 24.4 7 1.5 18.2 6.26 38.2

3.089 Solvent piki 5.412 Gallik asit 9.352 (-)- Gallokatein 10.467 TM 19.384 (+) Katein 20.013 Klorojenik asit 21.513 TM 22.421 Kafeik asit (-)-Epigallokateingallat 25.504 26.137 TM 29.588 TM 32.726 P-kumarik asit 37.382 Ferulik asit TM: Tanmlanamayan madde

0.010 AU 0.005 0.000 0.00

3 .45 1 3.0 86
5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00 Minutes

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.18: Ticari nar suyu ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram Kromatogram sonularna gre ticari nar suyu rneinde gallik asit, (-)- gallokatein, (+)- katein, klorojenik asit, kaffeik asit, (-)- epigallokateingallat varl tanmlanmtr. (-)- gallokatein 13.6 mg/L ile taze nar suyu rneine gre (162 mg/L) % 91 daha az grlmtr. Bunun yan sra gallik asit miktar 7.8 mg/L ile taze nar suyundan (3 mg/L ) daha fazla grlmtr. Ticari nar suyunda 24.4 mg/L olarak bulunan (+)- katein miktarlar her iki nar suyu trnde de yakn grlmtr. Klorojenik asit miktar 7 mg/L ile taze nar suyuna gre (20.6 mg/L) % 66 daha az grlmtr. Ticari nar suyunda grlen 1.5 mg/L ile kafeik asit miktarda taze nar suyuna gre (31.7 mg/L) ok dktr. Ayrca ticari nar suyu rneinde taze nar suyunda grlmeyen (-)- epigallokateingallat (18.2 mg/L) varl tanmlanmtr. Ferulik asit miktar ise (38.2 mg/L) ile taze nar suyunda grlen ferulik asitin yaklak iki kat olarak bulunmutur. Her iki nar suyu rneinde grlen fenolik maddeler arasndaki nitelik ve nicelik farkll kullanlan hammaddeden ve ticari nar suyu rneine uygulanan sl ilemden kaynakland 68

dnlmektedir. Ayrca 520 nm deki kromatogram incelendiinde antosiyaninlere ait pike rastlanamamtr, bunun nedeni ise yine ticari nar suyuna uygulanan sl ilem sonucu antosiyaninlerin degrade olmas ile aklanabilir.
3 .0 6 0 5 .6 2 1 9 .1 1 6
0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00

1 4 .4 4 5

1 8 .9 7 9 2 1 .1 0 5 2 2 .0 0 6

2 5 .6 7 9

2 9 .0 8 2

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00 Minutes

3 2 .2 0 7
35.00

3 6 .7 8 0
40.00

45.00

50.00

55.00

60.00

ekil 4.19: Nar ekisi ekstraktna ait 280 nm de HPLC kromatogram Tablo 4.18: Nar ekisi ekstraktndaki fenolik bileikler
Alkonma sresi (dak) 3.060 5.621 9.116 14.445 18.979 21.105 22.006 25.679 Fenolik madde
Solvent piki Gallik asit (-)- Gallokatein TM (+)- Katein Klorojenik asit Kafeik asit (-) Epigallokateingallat TM P-kumarik asit Ferulik asit

Alan % Alan Ykseklik Miktar (mg/Kg) 7125714 34.91 1777674 1029524 5.04 128113 30 9722523 47.64 842319 1484 424568 2.08 12296 419844 2.06 10443 263 156481 0.77 8341 50.4 144744 0.71 8111 12 156097 0.76 6891 222 140875 89723 999960 0.69 0.44 4.90 11576 3076 46200 3.18 231

29.082 32.207 36.780 TM: Tanmlanamayan madde

0.005 AU

0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

ekil 4.20: Nar ekisi ekstraktna ait 520 nm de HPLC kromatogram

3 .2 5 8

69

Kromatogram sonularna gre

nar ekisi rneinde gallik asit, (-)- gallokatein, varl

(+)- katein, klorojenik asit, kafeik asit, (-) epigallokatein gallat

tanmlanmtr. (-)- gallokatein 1484 mg/kg ile en baskn fenolik madde olarak grlmektedir. Nar ekisi rneinin taze nar suyu ve ticari nar suyunda grlen fenolik maddeler ile benzerlik gsterdii grlmektedir. 520 nm deki kromatogram incelendiinde ise yine ticari nar suyu rneinde olduu gibi antosiyaninlere ait pik grlememitir. Bunun nedeni ise nar ekisinin nar suyunun kaynatlmas (yksek sl ileme maruz kalma) sonucu elde edilen bir rn olmas ve bu esnada antosiyaninlerin degradasyona uramas olarak dnlmektedir. rneklerin kromatogram sonularndan kan bilgiler ve antioksidan aktiviteleri arasndaki iliki incelendiinde, mor havu suyu konsantresinde grlen yksek antioksidan aktivitesi, ierdii, klorojenik asit, 3,4 dihidroksi benzoik asit, kafeik asit, gibi fenolik maddelerle ilikilendirilebilir. Yapsnda olduka fazla miktarda hidroksil iyonu ieren ve dolays ile antioksidan aktivitesi yksek olan klorojenik asit mor havu suyu konsantresinde olduka yksek oranda gzlenmitir. Mor havu suyu konsantresi nemli miktarlarda kafeik asit de iermektedir ve yine kafeik asit de fazla mikarda hidroksil iyonu ieren yaps itibari ile gl bir antioksidan olduu bilinmektedir. Literatr ksmnda deinildii gibi antioksidan aktivitesi belirlemede en nemli parametre hidroksilasyon derecesi ve pozisyonudur. Analiz sonucu rneklerde tanmlanan kumarik asit ve ferulik asit gibi baz yaygn fenolikler nispeten daha dk antioksidan aktivite gstermelerine ramen kafeik asit ve klorojenik asit gibi molekllerinde daha fazla fenolik hidroksil tayan maddelerde antioksidan aktivitesi daha yksektir. Benzoik asit iskelet yaps gsteren gallik asit ve esterleri ise bilinen en iyi gl antioksidanlardandr, ticari nar suyu ve nar ekisi rneklerinde nemli miktarda tanmlanan EGCGin Shaidi, 2004). 4.7. Antioksidan Aktivitesi ve Fenolik Madde erii Arasndaki liki rneklerin antioksidan aktivitesi ile fenolik madde ierii arasndaki ilikiyi incelemek amacyla DPPH yntemi ile gerekletirilen antioksidan aktivitesi sonular ile fenolik madde (toplam fenolik, toplam flavonoid ve toplam antosiyanin) 70 (epigallokatein gallat) en umut vaad edici antikansorejen maddelerden biri olduu rapor edilmitir (Hudson, 1990; Naczk ve

ierikleri arasnda regresyon analizi yaplmtr. Sonular ekil 4.21, ekil 4.22 ve ekil 4.23te verilmitir. Lineer regresyon varyans analizi sonular EK Bde ve Tablo B7, Tablo B8 ve Tablo B9da detayl olarak verilmitir.

ekil 4.21: Toplam fenolik madde ierii ve antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii

DPPH yntemi (mol TE/g) ile

ekil 4.22: Toplam flavonoid madde ierii ve DPPH yntemi (mol TE/g) ile antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii

71

ekil 4.23: Toplam antosiyanin madde ierii ve DPPH yntemi (mol TE/g) ile antioksidan aktivitesi regresyon analizi grafii Regresyon katsaylar incelendiinde rneklerin fenolik madde, flavonoid madde ve antosiyanin madde ierii ile antioksidan aktivitesi arasndaki ilikinin olduka nemli olduu grlmektedir (P<0,05). Buradan kan sonuca gre yksek fenolik madde ierii yksek antioksidan aktivite ile ilikilendirilebilir.

72

5. SONULAR Bu almada fenolik maddeler asndan zengin olan taze sklm nar suyu, ticari nar suyu, nar ekisi, mor havu, mor havu suyu konsantresi ve algam suyu rneklerinin toplam fenolik madde ierikleri ve fenolik madde profilleri ortaya konularak antioksidan aktiviteleri eitli yntemler ile belirlenmeye allmtr. Analizlenen tm rnekler incelendiinde yksek fenolik madde miktar yksek antioksidan aktivite ile ilikilendirilebilir. Antioksidan aktivitenin yksek olduu rneklerde toplam fenolik maddenin de daha yksek olduu grlmtr, ancak sonular dikkatle incelendiinde yksek fenolik madde miktarna sahip olmann, tm antioksidan aktivitesi metodlarnda yksek sonu vermedii grlmtr. rnein algam suyu ve mor havu rnekleri hemen hemen ayn miktarlarda fenolik madde iermelerine ramen, uygulanan antioksidan aktivite metotlarnda mor havucun daha yksek aktiviteye sahip olduu grlmektedir. Bunun nedeni ise HPLC analizi incelendiinde ierdikleri fenolik maddeler arasnda farkllklar olmasndan kaynakland dnlmektedir. Ayrca tm antioksidan aktivitesi analizi sonular incelendiinde analiz rneklerinin her bir yntem iin yksek antioksidan aktivitesi sralamasnda da farkllklar olabildii grlmektedir. Bundan trdr ki tek bir yntemle antioksidan aktivitesi hakknda kesin bir karar vermek doru bir yaklam deildir. Her bir antioksidann farkl radikallere kar farkl reaksiyon mekanizmasna sahip olabilecei bilinen bir gerektir. Bu almada da bu durum gzlenmitir. rnein DPPH radikaline kar olduka aktif olan algam suyu rneinin ABTS radikal katyonuna kar daha dk reaktivite gsterdii gzlenmitir. Antioksidan aktivitesi belirlemede reaksiyon mekanizmas olduka nemli olduundan ve her bir rnein ierdii antioksidan ve oksidan arasndaki reaksiyon tam olarak bilinemediinden tr, farkl yntemler ile antioksidan aktivitesi lmenin daha kesin bir yargya varmada nemli olduu grlmektedir. Ayrca antioksidan aktivite metodunun fizyolojik koullar yanstabilmesi de olduka nemlidir. Bu almada seilen DPPH ve ABTS radikali yakalamaya

73

dayanan yntemlerin olduka kararl, deneysel olarak kesinlii ve tekrarlanabilirlii yksek metotlar olduu gzlenmesine ramen bu radikallerin fizyolojik koullar tam olarak yanstt sylenemez bu nedenle linoleik asit emlsiyon sistemi, metal elatlama gibi fizyolojik koullar daha ok yanstan dier metotlarn sonularnn da destekleyici ve gvenilirlii artrc etkisi olmutur. Ksaca sylemek gerekirse; antioksidan aktivitesi belirlenirken, farkl yntemler kullanarak canl sistemlerdeki biyokimyasal olaylar gz nnde bulundurarak, fizyolojik koullar daha fazla yanstacak ve ayn zamanda kesinlii ve tekrarlanabilirlii yksek metotlarn uygulanmas olduka yararl olacaktr. Ancak alma sonular ve ayn zamanda alma srasnda yaplan literatr taramalar gstermektedir ki gdalardaki ve biyolojik rneklerdeki antioksidan kapasiteyi gvenilir ekilde len karlatrmak asndan glk ekilmektedir. Uygulanan antioksidan aktivitesi metotlar incelendiinde taze sklm nar suyu rneinin tm analiz metotlarnda olduka yksek aktiviteye sahip olduu grlmtr. Ticari nar suyu rnei ve nar ekiside ksmen yksek aktiviteye sahip olsa da taze sklm nar suyundan daha dk aktivite gstermektedir. Bunun nedeni olarak ise proses srasnda uygulanan sl ilem ve hammade farkll olarak ne srlebilir. HPLC analizi incelendiinde ise mor havu, konsantresi ve algam suyu iin kromatogram sonularnn daha dzgn ve sade olduu grlmektedir. Bununda nedeni bu rnlerin antosiyaninler dndaki fenolik maddeleri daha az oranda iermelerinden kaynaklanmaktadr. Mor havu konsantresi ve algam suyu nemli miktarda fenolik asit iermekte, ancak bununla birlikte akca grlmtr ki ierdii fenolik maddelerin ou antosiyaninlerden kaynaklanmaktadr. Nar suyu ve nar ekisi rneklerinin kromatogram sonularna gre ise literatrde mevcut olan nar suyu bileenlerinin bir blm bu sistemle tanmlanamamtr. Nar suyunun ierdii tanenler, fenolik asitler, antosiyaninler gibi fenolik madde grubunun ok eitli olmas nar suyunun fenolik madde profilini daha karmak hale getirmektedir. Bu nedenle bu almada gzlenen sonular dahilinde nar suyunun fenolik bileenlerini analiz etmeden nce fenolik maddeleri ierdii gruba gre ayrma, saflatrma gibi daha farkl ilemlerin uygulanmas nerilebilir. bu analiz metotlarnn farkl aratrma gruplar tarafndan rapor edilen sonularn birbiri ile

74

Sonu olarak, nar suyunun potansiyel bir antioksidan olduu ve salk zerine olan yararlar gnmzde artk ok iyi bilinmektedir. Bu alma ise taze sklm nar suyunun ve ticari nar suyunun ayrca yine nardan elde edilen ve lkemizde olduka yaygn olarak kullanlan bir rn olan nar ekisinin antioksidan aktivitelerinin karlatrlmas asndan fikir vermektedir. Mor havu ise son zamanlarda daha ok yaygnlaan algam suyu retiminde kullanlan bir sebzedir. Fenolik maddeler ve antioksidan aktiviteleri ile ilgili olarak literatrde bugne kadar mevcut almalar incelendiinde ise mor havucun antioksidan aktivitesi ile ilgili olan almalarn olduka az olduu grlmtr. Bu almadan kan sonularn, literatrdeki boluu doldurmak adna olduka yararl olaca dnlmektedir. Son olarak, mor havu ve algam suyunun iyi bir antioksidan olduu ancak nar suyuna gre daha dk aktivite gsterdii sylenebilir. Mor havucun konsantre edilmi halinin ise olduka yksek antioksidan aktiviteye sahip olduu akca grlmektedir.

75

KAYNAKLAR AOAC, 2000. Official Methods of Analysis, Association of Official Analytical Chemists, Virginia, USA. ANON 1, http://www.thehealthnews.org/tr/news/0545/nar_suyu.htm ANON 2, http://www.tameks.com/siyahhavuc.asp Alasalvar, C., Grigor J.M., Zhang, D., Quantick, P.C. and Shahidi, F. 2001. Comparision of volatiles, phenolics, sugars, antioxidant vitamins and sensory Quality of different colored carrot varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 1410-1416. Amakura Y., Okada M., Tsuji S. and Tonogai Y., 2000. High performance liquid chromatographic determination with photodiode array dedection of ellagic acid in fresh and processed fruits. Journal of Chromatograpy, 872, 87-93. Apak, R., 2005. Gda maddelerinde toplam antioksidan kapasite tayin yntemleri arasnda Cu(II) indirgeyici antioksidan kapasite CUPRAC. XIX. Ulusal Kimya Kongresi, Kuadas, 30 Eyll-4 Ekim. Arora, A., Nair, M.G. and Strasburg, G.M., 1988. Structure activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system. Free Radical Biology and Medicine, 24, 1355-1363. Asparuk, M., 2006. Kiisel grme. Targid gda. Aviram, M., Rosenblant M. and Gaitini, D., 2005. Pomegranate juice improves carotid artery health and lowers blood pressure in patients with carotid artery stenosis. Herbal Gram, 65, 28-30. Aviram M., Dornfeld, M., Rosenblant M., Volokva, N., Kaplan, M., Coleman, R., Hayek, T., Presser, D. and Furhman, B., 1999. Pomegranate juice consumtion reduce oxidative stres, atherojenic modification to LDL and platelet aggreation: studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E deficient mice. American Journal of Clinical Nutrition, 71, 1062-1067.

76

Babic, J., Amiot, M.J., Nguyen-The C. and Aubert, S., 1993. Changes in phenolic content in fresh ready to use shredded carrots during storage. Journal of Food Science, 58, 351-355. Belitz, H.D., Grosch, W. and Schieberle, P. 2002. Phenolic compounds. In: Food Chemistry, Springer, pp.822-835. Blando, F., Gerardi, C. and Nicoletti I., 2004. Sour cherry anthocyanins as ingredients for functional foods. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 253-258. Cam, M. ve Hl, Y., 2003. Gdalardaki flavonoidler ve nemleri, 3. Gda Mhendislii Kongresi, Ankara, 2-4 Ekim, s. 67-82. alml, A., 2003. Kays ve vine suyu retimindeki atklarn deerlendirilmesi. Ankara niversitesi Bilimsel Aratrma Projeleri. Ankara. http: papirus.ankara.edu.tr/arastirma/2003/a2003_28/proje.pdf. krk, S., 2005. 4'-dioktilamino-3-hidroksiflavon temelli floresans problarn sentezleri ve zelliklerinin incelenmesi. Yksek Lisans Tezi, .T.. Fen Bilimleri Enstits, stanbul. De Pascual-Teresa., Santos-Bluega, C. and Rivas-Gonzalo, M. 2000. Quantitative analysis of flavan-3-ols in spanish foodstuffs and beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 5331-5337. Dao, L. and Takeoka G., 2002. Anthocyanins. In. Methods of analysis for functional foods and nutraceuticals. CRC Pres LLC.

Dewanto, V., Wu, X., Adom, K.K. and Liu, R.H., 2002. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 1531-1535. Du, C.T., Wang, P.L. and Francis, F.J., 1970. Anthocyanins of pomegranate. Journal of Food Science, 40, 417-418. (Alnmtr: Shahidi, F. and Naczk, M., 2003. Phenolics in food and nutraceuticals. CRC Press). Duh, P.D., Yen, G.C., Yen, W.J. and Chang L.W., 2001. Antioxidant effects of water extracts from barley (hordeum vulgare L.) prepared under different roasting temperatures. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 1455-1463. Duh, Y. and Du, Y., 1997. Antioxidant activity of mung bean hulls, Journal of the American Oil Chemists Society, 74, 1059-1063.(Alnmtr: Mathew, S. and Abraham, T., 2006. Studies on the antioxidant activities of 77

cinnamon bark extracts, through various in vitro models, Food Chemistry, 94, 520-528). Dragovic-Uzelac, V., Delonga, K., Levaj, B., Djarkovic, S. and Pospisil J., 2005. Phenolic profiles of raw apricots, pumkins, and their purees in the evaluation of apricot nectar and jam authencity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(12), 4836-4843. El, S.N. and Karakaya, S., 2004. Radical Scavenging and iron-chelating activities of some greens used as traditional dishes in mediterranean diet. International Journal of Food Science and Nutrition, 55, 67-74. Erginkaya, Z. ve Hammes, W.P., 1992. algam suyu fermantasyonu srasnda mikroorganizmalarn geliimi ve izole edilen laktik asit bakterilerinin tannmalar zerine bir aratrma. Gda, 17, 311-314. Escarpa, A. and Gonzalez, M.C., 2001. An overwiev of analytical chemistry of phenolic compounds in Foods. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 31(2), 57-139. Espada, A.C.M., Wood, K.V., Bordelon, B. and Watkins, B.A., 2004. Anthocyanins quantification and radical scavenging capacity of Concord, Norton, Marechal Foch grapes and wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 677 9-6786. Fuleki, T. and Francis, F.J., 1968. Quantitative methods for anthocyanins. purification of cranbery anthocyanins. Journal of Food Science and Agricultural, 33, 266-274. (Alnmtr: Shahidi, F. and Naczk, M., 2003. Phenolics in food and nutraceuticals. CRC Pres). Garcia-Alanso, M., de Pascual Teresa, S., Santos-Buelga, C. and Rivas-Gonzalo, J.C., 2003. Evaluation of the antioxidant properties of fruits. Food Chemistry, 84 13-18. Gil, M., Barberan, T., Pierce, B.H., Holcroft, D.M. and Kader, A.A., 2000, Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 4581-4589 . Gil, I., Gil, M.I. and Ferreres, F., 2002. Effect of processing techniques at industrial scale on orange juice antioxidant and beneficial health compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 51075514.

78

Gonalves, B., Landbo, A.K., Knudsen, D., Silva, A.P., Pereira, M., Rosa, E., and Meyer, A.S., 2004. Effect of ripeness and postharvest storage an the phenolic profiles of cherries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 532-530. Glin, . 2005. Antioxidant activity of caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid). Toxicology. 217, 213-220. Hakkinken, S.H.and Trrnen, A.R., 2000. Contents of flavonols and selected phenolic acids in strawberries and Vaccinium species: influences of cultivar, cultivation site-and technique. Food Research International, 33, 517-554. Huang, D., Ou, B. and Prior, R.L., 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 1841-1856. Hudson, B., 1990. Food Antioxidants, Elsevier Science, USA, pp 173-188. Jamet, A. And Ebeling, P.W. 2002. Stabilization Mechanisma for Anthocyanin: The Case for Copolymerization Reactions. Engineering and Food for the 21.st Centruy, CRC Pres LLC, pp.1-4. Justesen, U., Knuthsen, P., Leth, T., 1998. Quantitative analysis of flavonols, flavones, and flavonones in fruits, vegetables and beverages by highperformance liquid chromatography with photo-diode array and mass spectrometric dedection. Journal of Chromatography A, 799,101-110. Kammarer, D., Carle, R. and Schiber, A., 2004. Characterization of phenolics acids in black carrots (Daucus carota ssp. Sativus var. Atrorubens Alef.) by high performance liquid chromatograpy/electrospray ionization mass spectrometry. Pub-Med, 18(12), 1331-1340. Karadeniz, F., 1994. Elma suyunda fenolik madde dalmnn konsantreye ileme srasnda deiimi. Doktora Tezi, Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstits, Ankara. Karafakolu, Y.S., 2004. Ttn alanlarnda oksidan-antioksidan durum. The Medical Journal of Kocatepe, 5,7. Kaya, A., Szer, N. 2005. Rheological behaviour of sour pomegranate juice concentrates. International Journal of Food Science and Technology, 40, 223-227.

79

Krca, A., zkan, M. and Cemerolu, B. 2005. Stability of black carrot anthocyanins in various fruit juices and nectars. Food Chemistry, 97, 598-605. Krca, A., zkan, M. and Cemerolu, B. 2006. Effects of temperature, solid content and pH on the stability of black carrot anthocyanins. Food Chemistry, 101, 212-218. Kulkarni, A. P., Aradhya, S. M. and Divakar, S. 2004. Isolation and identification of a radical scavenging antioxidant punicalagin from pith and carpellary of pomegranate fruit. Food Chemistry, 87, 551-557. Kim, D.O., Chun, O.K., Moon, H.Y. and Lee, C.Y., 2003. Quantification of polyphenolics and antioxidant capacity in fresh plumps. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 6509-6515. Lee, J.H. and Talcon, S., 2004. Fruit maturity and juice extraction influences ellagic acid derivatives and other antioxidant polyphenols in muscadine grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 361-366. Lin, J.Y. and Ching, Y.T., 2006. Determination of total phenolic and flavonoid contents in selected fruits and vegetables, as well as their stimulatory effects on Mouse splenocyte proliferation. Food Chemistry, 101, 140147. Liyana-Patrihana, C.M., Shaidi, F. and Alasalvar, C., 2005. Antioxidant activity of cherry-laural fruit (Laurocerasus officinalis) and its concentrated juice. Food Chemistry, 99, 101-128. Madhavi, D.L., Deshpande, S.S. and Salunkhe, D.K., 1996. Food Antioxidants: Technological, Toxicological and Health Perspectives. Markel Dekker, Newyork, pp 41-50. Marinova, D., Ribarova, F. and Atanassova, F., 2005. Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables. Journal of the University of the Chemical Technology and Metallurgy, 40, 255-260. Maskan, M., 2004. Production of pomegranate (Punica granatum L.) juice concentrate by various heating methods: colour degradation and kinetics. Journal of Food Engineering, 72, 218-224. Mazza, G., Miniati, E., 1993. Anthocyanin in fruits, vegetables and grains (p 32). Boca Raton, FL.CRC pres: (Alnmtr: Krca, A., zkan, M. and Cemerolu, B., 2005. Stability of black carrot anthocyanins in various fruits juices and nectars. Food Chemistry. 97, 598-605.)

80

Mathew, S. and Abraham, T.E., 2006. Studies on the antioxidant activities of cinnamon (Cinnamomum verum) bark extracts, through various in vitro models, Food Chemistry, 94, 520-528. Miguel, G., Dandlen, S., Antunes, D., Neves, A. And Martins, D., 2004. The effects of two methods of pomegranate (punica granatum L) juice extraction on quality during storage at 4C. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 332-337. Miller, H.E., Rigelholf, H., Marquart L., Prakash A., Kanter, M. 2000. Journal of American Clinical Nutritional, 19, 312. (Alnmtr: Triantis T., Stelakis A., Dimotikali D. And Papadapulos K., 2005. Investigations on the antioxidant activity of fruit and vegetable aqueous extracts on superoxide radical anion using chemiluminiescence techniques. Analyitica Chimica Acta. 536, 101105). Naczk, M. and Shahidi, F., 2004. Extarction and analysis of phenolics in food. Journal of Chromatography A, 1054, 95-111. Naudi, A.S., Bidlack, W.R. and Crecelius, A.T., 2000. Flavonoids. CRC Pres. Newyork. Noda, Y., Kaneyuki, T., Mori, A. and Packer, L., 2002. Antioxidant activities of pomegranate fruit extract and ts: Delphinidin, cyanidin and pelargonidin. Journal of Agricultural Food Chemistry, 50, 166-171. Oreopoulou, V. 2003. Extraction optimization in food engineering: Extraction of natural antioxidants. CRC Press. Newyork. Ortuno, C., Reynaldo, L., Fuster, M.D., Botia, J., Puig, G., Sabater, F., Lidon, A.G., Porras, I. and Rio, J.A.D., 1997. Citrus cultivars with high flavonoid contents in the fruits. Scietia Horticulturac, 68, 231-236. Oyaizu, M., 1986. Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine, Japan Journal of Nutrition, 44, 307-315. (Alnmtr: Mathew, S. and Abraham, T.E, 2006, Studies on the antioxidant activities of cinnamon (Cinnamomum verum) bark extracts, through various in vitro models. Food Chemistry, 94, 520-528). tle S. ve and, ., 2005. leme ve depolamann meyve sebze antioksidanlarna etkisi. Dnya gda dergisi. zler N., 1995. algam suyu retimi zerine aratrmalar. Yksek Lisans Tezi, Uluda niversitesi Fen Bilimleri Enstits, Bursa.

81

zyurt, D., 2005. Toplam flavonoid miktarnn gelitirilen spektrofotometrik yntem ile tayini. Yksek Lisans Tezi, T Fen bilimleri Enstits, stanbul. Pantelidis, G.E., Vasilakakis, M., Manganaris, G.A. and Diamantidis, Gr. 2006. Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and Cornelian cherries. Food Chemistry, xxx, avalible online at scincedirect.com. Peterson, J., Dwyer, J., Bhagwat, S., Haytowitz, D., Holden, J., Eldridge, A.L., Beecher, G. and Aladesanmi, J., 2005. Major flavonoids in dry tea. Journal of Food Composition and Analysis, 18, 487-501. Pokorny, J., Yanishlieva, N. And Gordon, M. 2001. Antioxidants in food, CRC Press, USA. Poyrazolu, E., Gkmen, V. And Artk, N., 2002. Organic acids and phenolic compounds in pomegranates ( Punica granatum L.) grown in Turkey. Journal of Food Composition and Analysis, 15, 567-575. Prakash, A., 2001. Antioxidant activity. Medallion Laboratories Analytical Progress. 19(2); www.medlabs.com/file.aspx. Prior, R.L., Wu, X., Scaich, K., 2005. Standardized methods for the determination antioxidant capacity and phenolics in foods and dieatry supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(8), 3110-3113. Revillla, E., Ryan, J.M. 2000. Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extract and wines by highperformance liquid chromatography- photodiode array dedection without sample preparation. Journal of Chromatography A, 881, 461469. Rival, S.G., Boerriu, C.G. and Wichers, H.J., 2001. Caseins and casein hydrolysates antioxidative properties and relevance to lipoxygenase inhibition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 295-302. Robards, K., Prenzler, P.D., Tucker, G., Swatsitang, P., Glover, W., 1999. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry, 66, 401-436. Roginsky, V. And Lissi, E.A., 2005. Rewives of methods to determine chainbreaking antioxidant activity in food. Food Chemistry, 92, 235-254.

82

Roussis, I.G., Lambropoulos I., Soulti, K., 2005. Scavenging capacities of some wines and wine phenolic extracts. Food technology and Biotechnology, 43, 351-358. Salces, R.M., Korta, E., Barranco, L., Berrueta, A., Gallo,B. and Vicente,F., 2001. Determination of polyphenolic profiles of basque cider apple varieties using accelerated solvent extraction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 3761-3767. Schieber, A., Keller, P. and Carle, R., 2001. Determination of phenolic acids and flavonoids of apple and pear by high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography A, 910, 265-273. Sellapan, S., Akoh, C.C ., Krewer, G., 2002. Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia grown blueberries and blackberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2432-2438. Seram, N.P., Lee, R., Scheuller, H.S. and Heber, D., 2004. Identification of phenolic compounds in strawberries by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrocopy. Food Chemistry, 97, 1-11. Siddhuraju, P. and Becker, K., 2006. Antioxidant and free radical scavenging activities of processed cowpea (vigna unguiculata L. walp.) seed extracts. Food Chemistry. 101, 10-19. Sngh, R.P., Murthy, K.N. and Jayaprakasha, G.K., 2002. Studies on the antioxidant activities of pomegranate (punica granatum) peel and seed extracts using in vitro models. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 81-86. Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965.Colorimetry of total phenolics with phomolybdis-phosphotungistic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158. (Alnmtr: Shahidi, F. and Nazck, M., 2003. Phenolics in Food and Nutraceuticals. CRC Press). Stewart, A.J., Bozonnet, S., Mullen, W., Jenkins, G.I., Lean, M.E.J. and Crozier, A., 2000. Occurance of flavonols in tomatoes and tomato based products. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48, 2663-2669. Que, F., Mao, L., Zhu, C. and Xie, G., 2006. Antioxidan properties of Chinese yellow wine, its concentrate and volatiles. Food Science and Technology. 39, 111-117.

83

Tanrven, D., 1997. Armut suyu ve konsantresinde fenolik madde dalm. Yksek Lisans Tezi. Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstits, Ankara. Turker, N., Aksay, S. and Ekiz, H.I., 2004. Effects of storage temperature on the stability of anthocyanins of a fermented black carrot (Daucus carota var. L.) beverage: shalgam. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 3807-3813. Uzelac, V.D., Pospisil, J., Levaj, B. and Delonga, K., 2005. The study of the phenolic profiles of raw apricots and apples and their purees by HPLC fort he evaluation of apricot nectars and jams authenticity. Food Chemistry, 91, 373-383. Vardin, H., 2000. Harran ovasnda yetitirilen deiik nar eitlerinde gda sanayinde kullanm olanaklar zerine bir alma. Doktora Tezi, ukurova niversitesi Fen Bilimleri Enstits, Adana. Villers, A., Vanhoenacker, G., Majek, P., Sandra, P., 2004. Determination of anthocyanins in wine by direct injection liquid chromatograpy-diode array detection-mass spectrometry and classification of wines using discriminant analysis. Journal of Chromatography A, 1054, 195-204. Wettasinghe, M., Bolling, B., Pihak, L., Xiao, H. and Parkin, K., 2002. Phase II enzyme-inducing and antioxidant activities of beetrot (beta vulgaris L.) extracts from phenotypes of different pigmentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50, 6704-6709. Wrolstad, R.E. and Grete, S., 2002. Flavonoids from berries and grapes. In: Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects, 2, 72-103. Yang, R., Tsao, R., 2003. Optimization of a new mobile to know the complex and real polyphenolic composition: Towards a tool phenolic index using high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1018, 29-40. Yu, L., Haley, S., Perret, J., Haris, M., Wilson, J. And Qian, M., 2002. frre radical scavenging properties of wheat extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46, 3630-3634. Zheng, Y., Wang, S.Y., Wang, C.Y. and Zheng, W., 2005. Chenges in a strawberries phenolics, anthocyanins and antioxidant capacity in response to high oxygen treatments. LWT, 40, 49-52. Available online www.sciencedirect.com.

84

Zhinsen, J., Mengcheng, T. and Jianming, W., 1999. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry, 64, 555-559.

85

EK A:

ekil A.1: (-)- Epikatein standard kalibrasyon erisi

ekil A.2: (-)- Epigallokatein gallat standard kalibrasyon erisi

ekil A.3: Ferulik asit standard kalibrasyon erisi

86

ekil A.4: Gallik asit standard kalibrasyon erisi

ekil A.5: (-)- Gallokatein standard kalibrasyon erisi

ekil A.6: (+)- Katein standard kalibrasyon erisi

87

ekil A.7: Kafeik asit standard kalibrasyon erisi

ekil A.8: Klorojenik asit standard kalibrasyon erisi

ekil A.9: P-Kumarik asit standard kalibrasyon erisi

88

ekil A.10: irinjik asit standard kalibrasyon erisi

ekil A.11: Rutin standard kalibrasyon erisi

ekil A.12: 3,4 dihidroksi benzoik asit standard kalibrasyon erisi

89

EK B: statistiksel Analizler Tablo B.1: rneklerin fenolik madde (mg/g) varyans analiz tablosu Kaynak rnek Hata Toplam Kareler toplam 451,8518 0,7084 452,5602 DF 5 12 17 Kareler ortalamas 90,3704 0,0590 F deeri 1530,90 P deeri 0,000

Tablo B.2: rneklerin fenolik madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas Karlatrlan rnekler
Mor havu & mor havu suyu konsantresi Mor havu & nar ekisi Mor havu & algam suyu Mor havu & taze nar suyu Mor havu & ticari nar suyu Mor havu suyu kons & nar ekisi Mor havu suyu kons & algam suyu Mor havu suyu kons & taze nar suyu Mor havu suyu kons & ticari nar suyu Nar ekisi & algam suyu Nar ekisi & taze nar suyu Nar ekisi & ticari nar suyu algam suyu & taze nar suyu algam suyu & ticari nar suyu Taze nar suyu & ticari nar suyu

Alt limit
13,836 1,003 -0,689 4,047 1,825 -13,499 -15,191 -10,455 -12,676 -2,359 2,377 0,156 4,070 1,848 -2,888

Orta
14,502 1,670 -0,023 4,713 2,492 -12,832 -14,525 -9,789 -12,010 -1,693 3,043 0,822 4,736 2,515 -2,221

st limit
15,168 2,336 0,643 5,379 3,158 -12,166 -13,859 -9,123 -11,344 -1,026 3,710 1,488 5,402 3,181 -1,555

Tablo B.3: rneklerin flavonoid madde (mg/g) varyans analiz tablosu Kaynak rnek Hata Toplam Kareler toplam 5,03696 0,02202 5,05898 DF 5 12 17 Ortalama 1,00739 0,00183 F deeri 549,02 P deeri 0,000

90

Tablo B.4: rneklerin flavonoid madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas Karlatrlan rnekler
Mor havu & mor havu suyu konsantresi Mor havu & nar ekisi Mor havu & algam suyu Mor havu & taze nar suyu Mor havu & ticari nar suyu Mor havu suyu kons & nar ekisi Mor havu suyu kons & algam suyu Mor havu suyu kons & taze nar suyu Mor havu suyu kons & ticari nar suyu Nar ekisi & algam suyu Nar ekisi & taze nar suyu Nar ekisi & ticari nar suyu algam suyu & taze nar suyu algam suyu & ticari nar suyu Taze nar suyu & ticari nar suyu

Alt limit
1,2942 -0,1871 -0,0295 -0,0851 -0,1718 -1,5988 -1,4411 -1,4968 -1,5835 0,0402 -0,0155 -0,1021 -0,1731 -0,2598 -0,2041

Orta
1,4117 -0,0697 0,0880 0,0323 -0,0543 -1,4813 -1,3237 -1,3793 -1,4660 0,1577 0,1020 0,0153 -0,0557 -0,1423 -0,0867

st limit
1,5291 0,0478 0,2055 0,1498 0,0631 -1,3639 -1,2062 -1,2619 -1,3485 0,2751 0,2195 0,1328 0,0618 -0,0249 0,0308

Tablo B.5: rneklerin antosiyanin madde (mg/L) varyans analiz tablosu Kaynak rnek Hata Toplam Kareler toplam 128804405 191680 128996085 DF 5 12 17 Kareler ortalamas 25760881 15973 F deeri 1612,74 P deeri 0,000

Tablo B.6: rneklerin antosiyanin madde ieriinin % 95 gven aralnda Tukey testi ile karlatrlmas Karlatrlan rnekler
Mor havu & mor havu suyu konsantresi Mor havu & nar ekisi Mor havu & algam suyu Mor havu & taze nar suyu Mor havu & ticari nar suyu Mor havu suyu kons & nar ekisi Mor havu suyu kons & algam suyu Mor havu suyu kons & taze nar suyu Mor havu suyu kons & ticari nar suyu Nar ekisi & algam suyu Nar ekisi & taze nar suyu Nar ekisi & ticari nar suyu algam suyu & taze nar suyu algam suyu & ticari nar suyu Taze nar suyu & ticari nar suyu

Alt limit
6335,2 -1142,7 -293,6 -990,8 -1134,6 -7824,5 -6975,5 -7672,6 -7816,5 502,5 -194,7 -338,5 -1043,8 -1187,6 -490,4

Orta
6681,8 -796,1 53,0 -644,2 -788,0 -7477,9 -6628,9 -7326,0 -7469,9 849,1 151,9 8,1 -697,2 -841,0 -143,8

st limit
7028,4 -449,5 399,6 -297,6 -441,4 -7131,3 -6282,3 -6979,4 -7123,3 1195,7 498,5 354,7 -350,6 -494,4 202,8

91

Tablo B.7: Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam fenolik madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu Kaynak Regresyon Hata Kareler toplam 136329 13443 DF 1 16 Kareler ortalamas 136329 840 F deeri 162,26 P deeri 0,000

Tablo B.8: Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam flavonoid madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu Kaynak Regresyon Hata Kareler toplam 143198 6574 DF 1 16 Kareler ortalamas 143198 411 F deeri 348,53 P deeri 0,000

Tablo B.9: Antioksidan aktivitesi (DPPH metodu) ile toplam antosiyanin madde ieriinin regresyon varyans analiz tablosu Kaynak Regresyon Hata Kareler toplam 142102 7669 DF 1 16 Kareler ortalamas 142102 479 F deeri 296,48 P deeri 0,000

92

ZGEM KSEL BLGLER

Ad Soyad: Tuba ztan Doum Yeri ve Tarihi: stanbul, 08.09.1980 Medeni durumu: Bekar Uyruu: T.C

ETM DURUMU Yksek Lisans:(2003-devam etmekte: stanbul Teknik niversitesi, Gda Mh Blm)
Tezsiz Yksek Lisans: (2003-2004: stanbul niversitesi, Kimya retmenlii formasyonu) Lisans: (1999-2003: stanbul Teknik niversitesi, Kimya Blm) ngilizce Hazrlk Blm: (1998-1999 stanbul Teknik niversitesi)

MESLEK DENEYMLER
EGE KMYA A.: 08/ 200209/2002 Proses Kontrol Blm/stajyer DEVA HOLDNG A.: 07/ 200109/2001 Kalite Kontrol ve Gvence Blm/ stajyer .T. Gda Mhendislii Blm: 2005-2006 Aratrma labaratuar. Yksek Lisans Tez almas: Mor havu, konsantresi, algam suyu, nar suyu ve nar ekisi rnlerinde antioksidan aktivitesi tayini ve fenolik madde profilinin belirlenmesi .T. Kimya Blm: 2002-2003 Aratrma labaratuar: Bitirme devi almas: Katyonik yzey aktif maddelerin kil mineralleri zerine adsorpsiyonu BLG ve BECERLER Yabanc Dil: ngilizce Bilgisayar: Ofis programlar: (Word, Excel, Power Point), Minitab (statistiksel yazlm), Empower (Kromatografik data yazlm)

93